全 文 ：中国农学通报 2015,31(16):105-110
Chinese Agricultural Science Bulletin
瓯柑中性转化酶基因(CrInv1)克隆及序列特征分析
金微微，陈功楷，郜爱玲
（温州市农科院，浙江温州 325006）
摘 要：研究旨在克隆瓯柑中性转化酶基因(Inv)，了解其序列特征，为从分子生物学水平研究瓯柑果实蔗
糖代谢提供参考。采用同源克隆和RT-PCR技术对瓯柑 Inv基因进行扩增，得到的基因命名为CrInv1，
基因登录号为KF694988。用生物信息学方法对获得的序列进行预测蛋白结构域、系统进化分析以及分
子量、等电点分析，获得瓯柑转化酶基因序列信息。克隆获得CrInv1基因全长为1932 bp的cDNA序列，
预测编码643个氨基酸。序列比对结果显示，在不同物种中 Inv基因高度保守，CrInv1与NCBI网站上其
他物种的序列同源性均高于70%。Primer 5.0软件预测CrInv1蛋白的相对分子量为72.18 kDa，理论等
电点(pI)为6.882，为中性转化酶蛋白，富含非极性氨基酸，亚细胞定位在膜内。系统进化树结果显示，瓯
柑CrInv1蛋白与草莓、荔枝等的亲缘关系较为接近，而与葡萄、桃、苹果的 Inv蛋白分属不同分支。试验
获得了瓯柑CrInv1基因及相关序列信息，为后续瓯柑果实蔗糖代谢分子生物学研究提供了参考。
关键词：瓯柑；中性转化酶；基因；克隆
中图分类号：S666.1 文献标志码：A 论文编号：casb15010147
Cloning and Sequence Analysis of a Neutral Invertase Gene (CrInv1) from Ougan Fruit
Jin Weiwei, Chen Gongkai, Gao Ailing
(Wenzhou Academy of Agricultural Sciences, Wenzhou Zhejiang 325006)
Abstract: The objective of this study was to separate Inv gene from ougan fruit and get sequence information,
which would be used in further study on sucrose metabolism of ougan fruit at molecular level. Methods of
homologous cloning and RT-PCR were used for Inv gene clone from ougan fruit. The gene we got was named
CrInv1 and the accession number was KF694988. Bioinformatics methods were used to get information of
predicted Inv protein including relative molecular mass, isoelectric point (pI), the conserved domains and
phytogenetic analysis results. Results showed that CrInv1 was 1932 bp in size, encoding a putative protein of
643-amino acid. Sequence alignment results showed that CrInv1 was highly conserved among different plants,
and shared more than 70% sequence homology with other plants from NCBI. With the calculation by software
Primer 5.0, relative molecular mass of the putative CrInv1 protein turned out to be 72.18 kDa, and the pI was
6.882. Results indicated that CrInv1 from ougan fruit belonged to neutral invertase and it was rich in nonpolar
amino acids. The subcellular localization of predicted CrInv1 protein was within the cell membrane.
Phylogenetic analysis showed that putative CrInv1 protein was not grouped with that from grape, apple and
peach, and was more close to that from lichi and strawberry. The study got Inv gene from ougan fruit and the
sequence information was analyzed. The results lay a foundation for subsequent research on sucrose
metabolism of ougan fruit.
Key words: ougan; neutral invertase; gene; clone
基金项目：浙江省教育厅科研项目“不同大小瓯柑果实枯水研究”(Y201121859)；温州市科技局科技计划项目“瓯柑果实枯水现象研究分析”
(N20130013)。
第一作者简介：金微微，女，1982年出生，浙江苍南人，讲师，博士，研究方向为果实采后生物学。通信地址：325006温州市六虹桥路1000号温州市农
科院，Tel：0577-88429211，E-mail：wwjin2003@163.com。
收稿日期：2015-01-20，修回日期：2015-04-07。
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0 引言
蔗糖是高等植物光合作用产物的主要运输形式，
因此有关蔗糖代谢的研究备受人们关注。蔗糖从代谢
源到代谢库的运输，主要依赖转化酶(Inv，invertase)和
蔗糖合成酶(Sus，sucrose synthase)[1]。其中，Inv催化蔗
糖的分解；Sus则可逆地催化蔗糖的分解和合成，但普
遍认为偏向催化蔗糖分解[2]。Inv基因已从拟南芥、番
茄、棉花、水稻、桃等多种植物中克隆分离，关于其表达
模式和可能的功能报道很多 [1,3-6]，但在瓯柑上并未见
到。瓯柑(Citrus reticulate‘Suavissima’)是芸香科柑
橘属的一个栽培变种。原产中国，在古代被朝廷列为
贡品，是一种传统名果。20世纪90年代在浙江省栽培
面积较大，但因其味苦，随着柑橘品种多样化，逐渐被
排挤出市场。近年来，随着人们对保健功能食品的关
注，瓯柑重新获得老百姓喜爱。据研究，瓯柑具有良好
的治疗咳嗽、降血压等功效[7]，但因其独具的苦味，产
业发展始终受限。有关瓯柑的研究，目前主要集中在
药用价值[7]、生物活性物质[8-9]、良种繁育[10]、果实生理品
质[11-12]等方面，其中良种繁育是瓯柑产业的发展重点之
一。研究瓯柑果实的糖代谢途径，结合良种繁育手段，
提高瓯柑果实含糖量，以此改良瓯柑风味，培育新品
种，具有深远的现实意义。
本研究以瓯柑果肉为试验材料，根据柑橘基因数
据 库 搜 索 到 的 甜 橙 转 化 酶 基 因 序 列 信 息
(orange1.1g006488m)设计引物，以提取的总RNA反转
录的 cDNA为模板，克隆瓯柑 Inv基因，获得编码区全
长序列，以期为后续从分子生物学水平上认识瓯柑果
实的蔗糖代谢积累资料。
1 材料与方法
1.1 试验材料、试剂
试验材料为瓯柑果实，采自温州市农科院果树研
究所梧田基地。以成熟果肉为试材，进行基因克隆。
重复取样 3次，采集后用液氮处理，置于-80℃贮藏备
用。试验在温州市农科院园艺产品贮藏与保鲜实验
室，于 2011 年 12 月—2012 年 4 月进行。试剂有
microRNA提取试剂盒(Qiagen miRNeasy minikit, Cat.
No. 217004)，TAKARA反转录试剂盒 PrimerScript RT
reagent(Code DRR047A)， 聚 合 酶 TAKARA
PrimeSTAR® Max DNA Polymerase，pJET Vector（购自
上海索莱宝生物科技有限公司）。
1.2 主要仪器
2700型PCR仪，美国ABI公司生产。
1.3 试验方法
1.3.1 总RNA提取及cDNA合成 利用microRNA提取
试剂盒进行总RNA提取。按照TAKARA反转录试剂
盒 PrimerScript RT reagent进行操作，以瓯柑果肉的
RNA为模板，合成相应的cDNA。
1.3.2 瓯柑 Inv基因克隆 根据柑橘基因数据库(http://
www.citrusgenomedb.org/node/587796； http://citrus.
hzau.edu.cn/orange/index.php) 提 供 的 甜 橙 (Citrus
sinensis)Inv 基 因 核 苷 酸 序 列 信 息
(orange1.1g006488m)，用生物软件 DNAMAN进行序
列比对分析，设计引物见表1。
以瓯柑果肉 cDNA为模板，用引物对 Inv-FP和
Inv- RP 进行 Inv 基因的 PCR 扩增。用 TAKARA
PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 进行 PCR 反应，
PCR扩增参数为：98℃预变性 2 min，98℃变性 20 s，
56℃退火 30 s，72℃延伸 2.5 min，35个循环，72℃延伸
7 min，10℃停止。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，
回收、纯化，与pJET Vector（购自上海索莱宝生物科技
有限公司）连接，通过菌落PCR，将得到的阳性克隆测
序（上海博尚生物技术有限公司）。
1.3.3 瓯柑 Inv基因生物信息学分析 所得序列的测序
结果用美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站中的
BLAST软件进行核苷酸同源性比对分析。利用
ExPASy在线翻译工具(http://web.expasy.org/translate/)
将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，再通过NCBI上的
BLASTX(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行氨
基酸序列的同源性分析。利用TMHMM Server v.2.0
和http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP在线软件分别
分析预测蛋白的跨膜结构和信号肽信息，利用NCBI
网站的 Blast- Conserved Domains 功能和在线软件
InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)分
析预测蛋白的结构域，利用Primer 5.0软件预测分析氨
基酸的等电点和蛋白质大小，使用Mega 5.1软件构建
不同物种 Inv蛋白的系统进化树。
2 结果与分析
2.1 瓯柑CrInv1基因的克隆
以瓯柑果肉cDNA为模板，用Inv-FP和Inv-RP引物
对进行PCR扩增，获得1.9 kb的单一特异性条带（图 1）。
基因名称
Inv
引物名称
Inv-FP
Inv-RP
引物序列(5’-3’)
ATGACTGCTGCTGGGGAAGCAG
TCATACTATGAAGGTCTGCTTTTTC
表1 PCR引物序列
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金微微等：瓯柑中性转化酶基因(CrInv1)克隆及序列特征分析

500 bp
1 kb
1.5 kb
2 kb
回收纯化产物，连接、转化，经菌落PCR验证，最后选
送10个质粒委托上海生工测序。结果显示，研究获得
Inv编码区全长序列，长度为 1932 bp，命名为CrInv1，
基因登录号为KF694988。
2.2 瓯柑CrInv1基因的同源性分析
用NCBI网站中的BLAST进行序列同源性比对，
发现瓯柑 CrInv1 基因与荔枝 (JQ773414.1)，木薯
(JQ339933.1)，甜 菜 (AJ422050.1)、‘ 霞 晖 6 号 ’桃
(JQ412750.1)的中性蔗糖转化酶基因分别具有 83%、
82%、80%、73%的核苷酸序列同源性；再将获得的这些
瓯柑序列与甜橙果实对应的基因序列进行比对，发现
1932 bp中仅有3个核苷酸存在差异，同源性为99.84%
（图2），说明 Inv基因在柑橘属中高度保守。
2.3 瓯柑CrInv1基因预测蛋白的化学特征分析
利用 Primer 5.0软件分析 Inv基因，发现编码 643
个氨基酸（图 3）。分析氨基酸的蛋白质大小，发现
CrInv1预测蛋白的相对分子量约为 72.18 kDa。蛋白
中含有 88个碱性氨基酸 (KRH)、75个酸性氨基酸
(DE)、303个非极性氨基酸(AILPWVFM)、177个极性
氨基酸(CDEGHKNQRSTY)，理论等电点(pI)为 6.882，
可见 Inv蛋白接近中性，富含非极性氨基酸，含量达
47.12%，为中性转化酶蛋白。CrInv1蛋白中含量最高
的氨基酸为亮氨酸 (Leu)，占 9.64%；其次为丝氨酸
(Ser)，占 7.77%。根据 TMHMM Server v.2.0和 http://
www.cbs.dtu.dk/services/SignalP在线软件分析，该蛋白
没有跨膜结构和信号肽，说明其亚细胞定位在膜内，不
属于膜蛋白或分泌蛋白。
1~2为CrInv1基因(1.9 kb)，M1为1kb ladder
图1 瓯柑CrInv1基因片段电泳图
ougan代表CrInv1基因序列，invertase-代表甜橙序列
图2 瓯柑CrInv1基因序列与甜橙 Inv序列orange1.1g006488m比对结果（截取差异部分）
2.4 瓯柑CrInv1基因预测蛋白的保守结构域分析
利用NCBI网站的Blast-Conserved Domains功能，
搜索瓯柑CrInv1基因预测蛋白的保守结构域，结果显
示整段氨基酸序列都含有糖苷酶100超家族(glycosyl-
hydrolase-100 superfamily)的保守结构域（图4）。再利
用 InterProScan在线软件分析蛋白结构域，发现第
160~604氨基酸属于 6-hairpin糖苷酶家族特征序列，
与番茄 [13]中性转化酶基因分析结果一致；第 161~603
氨基酸属于糖苷酶家族 100特征序列。2种软件比对
结果大致接近，说明中性转化酶基因家族高度保守，与
前文的比对结果一致。
2.5 瓯柑CrInv1基因预测蛋白的系统树分析
用Mega 5.1软件构建瓯柑与荔枝、桃、草莓、葡
萄、苹果、拟南芥、毛果杨等 16种植物的 Inv基因氨基
酸序列的系统进化树（图 5），选择邻接法(neighbor-
joining)，Bootstrap为 1000进行构建。进化树可分为 2
个分支，葡萄、苹果、桃为一单独分支，而瓯柑则与草
莓、荔枝、毛果杨、拟南芥、甜菜等归在另一大分支中，
其中这个分支又可分为3个小的亚分支，瓯柑与草莓、
毛果杨、拟南芥、山俞菜属于同一亚分支。
3 结论
研究首次从瓯柑果实中克隆获得 Inv基因序列，
1.9 kb
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大小为1932 bp，预测编码643个氨基酸。预测蛋白富
含非极性氨基酸，理论等电点为 6.882，为中性转化酶
蛋白，定位于细胞膜内。本研究首次从分子生物学角
度对瓯柑果实糖代谢相关酶进行研究，为瓯柑良种繁
育、改善风味提供分子基础。下一步工作是开展基因
表达研究。
4 讨论
根据最适 pH和等电点大小差异，Inv蛋白可分为
图3 瓯柑CrInv1基因编码氨基酸序列
图4 瓯柑CrInv1基因预测蛋白的结构域
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金微微等：瓯柑中性转化酶基因(CrInv1)克隆及序列特征分析
2个亚家族：酸性转化酶(acid invertase，AIn)和中性/碱
性转化酶(neutral/alkaline invertase，NIn)。1990年，Inv
基因首次从胡萝卜中分离获得。近年来，又分别从油
菜、大豆、玉兰等多种不同的植物[14-16]及柑橘[17]果实中
分离，但所获得的很多都是AIn基因家族成员。和AIn
相比，NIn的研究还不深入，主要由于其酶活性较低且
较易失活。越来越多的学者发现NIn的功能[3-4,18-19]也
非常重要，因而对其研究也越来越关注。
NIn现已在拟南芥[2]、水稻[4]、杨树[20]、橡胶[21]等多种
植物中克隆分离，且在多种果树上也克隆到，如桃[5]、
枳[22]、荔枝[23]、葡萄[24]等，但在瓯柑上未见有相关报道。
研究表明，NIn是一个多基因家族，且不同植物中基因
成员数目不同。拟南芥(Arabidopsis thaliania)中有 9
个成员，水稻(Oryza sativa)中有 8个，毛果杨(Populus
trichocarpa)16个，葡萄(Vitis vinifera)9个[24]。在柑橘类
物种中，仅有报道从枳克隆到 1个NIn基因[22]，笔者所
用到的甜橙转化酶序列信息是从甜橙基因组中找到
的。根据NCBI网站搜索结果，甜橙基因组中可能存
在 2个NIn家族成员。本研究以瓯柑果肉 cDNA为模
板，利用同源克隆和RT-PCR克隆技术得到1个编码区
长度为1932 bp的瓯柑 Inv基因，命名为CrInv1，预测编
码 643个氨基酸。根据对其序列的化学特征分析，该
Inv基因属于中性转化酶基因。这是首次在瓯柑果实
上进行的 Inv基因克隆及序列分析。笔者仅得到 1个
Inv基因，桃[5]果实上也仅得到1个，推测可能与组织表
达差异、时空表达差异等因素有关。
采用分子生物学手段研究植物的各种代谢机理，
推测植物体内基因、蛋白的功能，再通过转基因调控来
改良植物的发育与品质形成，一直以来是研究的热
点。对梨果实的研究发现，套袋降低了梨酸性转化酶
基因的表达，在花后 75~90、150天酸性转化酶活性降
低，但套袋对中性转化酶无影响[25]。在甜瓜[19]上的研
究表明，反义酸性转化酶转基因植株与野生型相比，植
株生长变慢，叶子变小，转化酶表达降低，果实蔗糖浓
度升高，同时促进果实提前成熟。目前关于中性转化
酶在果实品质方向的转基因研究未见有报道，在此方


Litchi chinensis AFP23358.1
Manihot esculenta AFH77954.1
Medicago truncatula AES61477
Glycine max XP_003531388
Cucumis sativus XP_004150486
Solanum lycopersicum XP_004249987
Oryza sativa BAD25431
Zea mays ACG27641
Fragaria vesca XP_004291628
Citrus reticulate ‘Suavissima’
Populus trichocarpa XP_002328169
Eutrema halophilum BAJ33980
Arabidopsis thaliana BAB09123.1
Beta vulgaris CAD19320
Vitis vinifera ABS52644
Prunus persica AF157906
Malus ?domestica AFU56879.1
0.02
加方框标注的为瓯柑CrInv1基因
图5 瓯柑 Inv基因氨基酸序列和其他物种 Inv基因氨基酸序列进化树分析
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面的研究有待展开和深入。
参考文献
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