全 文 ：利用 ISSR分子法标记鉴别新会茶枝柑
邓锋1，林向华2，梁蔚阳1
(1．广东省食品药品检验所 生检生化室，广东 广州 510180;2．中山大学孙逸仙纪念医院，
广东 广州 510120)
摘要:目的 研究利用 ISSR分子标记方法在核酸分子水平上鉴别新会茶枝柑。方法 从 28 条 ISSR 引物
中筛选合适的引物，对从新会茶枝柑、砂糖桔、阳山桔、贡柑、芦柑共 16 个新鲜叶片样品中提取的总
DNA进行 PCR扩增及电泳分析，寻找特征位点。结果 新会茶枝柑所有样品与其中 2 条 ISSR引物扩增
出较为明显的特征条带，可区别于其他品种。结论 ISSR作为一种简便有效的分子标记方法，可用于新
会茶枝柑的鉴别。
关键词:茶枝柑;ISSR;鉴别
中图分类号:R282． 5 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2012． 04． 010
文章编号:1006-8783(2012)04-0396-04
Identification of Citrus Reticulata cv． Chachiensis by ISSR molecular markers
DENG Feng1，LIN Xiang-hua2，LIANG Wei-yang1
(1． Biological Product ＆ Biochemistry Department，Guangdong Provincial Institute for Drug Control，Guangzhou
510180，China;2． Sun Yat-Sen Memorial Hospital，Sun Yat － Sen University，Guangzhou 510120，China)
Abstract:Objective To identify Citrus Reticulata cv． Chachiensis from Xinhui by ISSR molecular markers from
different species of Citrus Reticulata． Methods 28 ISSR primers were analyzed by PCR with total DNA
extracted from fresh leaves of 16 samples of Citrus Citrus Reticulata cv． Chachiensis ，reticulata‘Shiyueju’，
reticulata‘Yangshan’，reticulata‘Gong’and reticulata‘Lu’． Results Two ISSR primers amplified from Citrus
Reticulata cv． Chachiensis products showed different electrophoresis bands with other species of Citrus
Reticulata． Conclusion ISSR method provides a quick，reliable molacular marker technique for identification of
Citrus Reticulata cv． Chachiensis．
Key words:Citrus Reticulata cv． Chachiensis;ISSR;identification
收稿日期:2012-04-24
基金项目:广东省中医药管理局资助项目(2010252)
作者简介:邓锋(1975 －) ，男，硕士，副主任药师，从事药品生化和分子生物学研究和检验工作，电话:020-81887684，Email:
dengfengemail@ 163． com。
网络出版时间:2012-07-05 09:56 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1413． R． 20120705． 0956． 002． html
新会茶枝柑为芸香科(Citru)柑橘属植物
(Citrus Reticulata cv． Chachiensis) ，成熟果皮可入
药，主产于广东新会，又称新会柑、大红柑，果实可食
用，果皮可做陈皮，又称广陈皮。陈皮具有理气健
脾、和胃止呕、燥湿化痰等多种功效［1］，而广陈皮是
具有岭南特色的道地药材，具有较高的保健和治疗
价值，为陈皮中的上品［2］。
近年来，随着新会茶枝柑的品牌推广，其受欢迎
程度不断提升。其他地区产柑橘也以茶枝柑或广陈
皮的名义进行生产和销售，植株及陈皮产品分别与
新会茶枝柑、广陈皮高度相似，但质量却有明显差
异。广陈皮中含有挥发油及黄酮类物质如橙皮苷
等，目前相关研究主要集中在通过测定橙皮苷的含
量作为评价陈皮的质量指标［3］，通过建立陈皮的
HPLC指纹图谱鉴别不同产地陈皮品种［4］，此外还
有对其主要黄酮类成分进行分析以研究不同地区产
陈皮的差异等［5 － 6］。
ISSR(inter-simple sequence repeat，简单序列重
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Aug． 2012，28(4)
复区间)分析是基于 PCR 的分子标记技术，最早由
Zietkiewicz等［7］于 1994 年提出，由于其操作简单，
专属性强、重现性好，现已广泛用于植物的多态性分
析、遗传结构分析、种群分类和中药材的分类鉴别等
方面［8］，例如中药材白术［9］、益母草［10］、栀子［11］、党
参［12 － 13］等的遗传关系及遗传多样性等研究，也有直
接用于中药材如石斛的鉴别［14］，而有关道地药材广
陈皮的来源植物新会茶枝柑的分子标记遗传研究及
鉴别分析则未见报道。本研究利用 ISSR 方法选择
合适的引物对道地新会茶枝柑及其他柑橘种类进行
分析和鉴定，旨在 DNA核酸分子水平上对其差异性
进行研究。
1 仪器、材料与试药
1． 1 仪器
Eppendorf MiniSpin 离心机(德国 Eppendorf 公
司) ;MSI 型漩涡混合器(德国 EKA 公司) ;ED-19
型水浴锅(德国 JULABO公司) ;9700 型 PCR 仪(美
国 ABI 公司) ;Power300 型电泳仪(美国 BIO-RAD
公司) ;Ultrospec 2000 紫外分光光度计(美国安玛
西亚公司) ;UNIVERSAL HOOD-II 凝胶成像系统
(美国 BIO-RAD公司)。
1． 2 试药
Tris、β-巯基乙醇购自 Sigma 公司;PCR Buffer、
Mg2 +、Taq DNA 聚合酶、dNTPs 购自广州威佳生物
技术有限公司及宝生物工程(大连)有限公司;超纯
水、D100Marker购自北京鼎国生物公司;琼脂糖购
自广州宝泰克生物科技有限公司;ISSR 引物由上海
生工生物技术服务公司合成。其余试剂均为国产分
析纯。
1． 3 材料
采集新会茶枝柑新鲜叶片 8 批，均采自广东江
门新会区新会柑(陈皮)GAP产业园种植基地;另采
集四会砂糖桔、阳山桔、德庆贡柑、潮州芦柑新鲜叶
片各 2 批，样品均经广东省食品药品检验所符同浩
主管中药师鉴定，新会柑为芸香科柑橘属植物 Citrus
Reticulata cv． Chachiensis，其余为非茶枝柑类柑橘，
详见表 1。
表 1 样品编号及来源
Table 1 Samples and sources
编号 名 称 采集地点 采集日期
1 茶枝柑(Citrus Reticulata cv． Chachiensis) 广东省江门市新会区三江镇 2010 年 12 月
2 茶枝柑(Citrus Reticulata cv． Chachiensis) 广东省江门市新会区会城 2010 年 12 月
3 茶枝柑(Citrus Reticulata cv． Chachiensis) 广东省江门市新会区会城 2010 年 12 月
4 茶枝柑(Citrus Reticulata cv． Chachiensis) 广东省江门市新会区会城 2010 年 12 月
5 茶枝柑(Citrus Reticulata cv． Chachiensis) 广东省江门市新会区古井镇 2010 年 12 月
6 茶枝柑(Citrus Reticulata cv． Chachiensis) 广东省江门市新会区崖门镇 2010 年 12 月
7 茶枝柑(Citrus Reticulata cv． Chachiensis) 广东省江门市新会区小冈镇 2010 年 12 月
8 茶枝柑(Citrus Reticulata cv． Chachiensis) 广东省江门市新会区梅岗镇 2010 年 12 月
9 砂糖桔(Citrus reticulata‘Shiyueju’) 广东省韶关市区 2010 年 8 月
10 砂糖桔(Citrus reticulata‘Shiyueju’) 广东省四会市 2010 年 8 月
11 阳山桔(Citrus reticulata‘Yangshan’) 广东省江门市阳山市 2010 年 8 月
12 阳山桔(Citrus reticulata‘Yangshan’) 广东省江门市阳山市 2010 年 8 月
13 贡柑(Citrus reticulata‘Gong’) 广东省肇庆市德庆县 2010 年 12 月
14 贡柑(Citrus reticulata‘Gong’) 广东省肇庆市德庆县 2010 年 12 月
15 芦柑(Citrus reticulata‘Lu’) 广东省潮州市潮安县 2010 年 12 月
16 芦柑(Citrus reticulata‘Lu’) 广东省潮州市潮安县 2010 年 12 月
2 方法
2． 1 样品总 DNA的提取
采用改良的 CTAB 法［14］，取 0． 5 g 新鲜叶片用
去离子水洗净，在液氮中研磨 10 min，分装 3 管，分
别加入丙酮 1 mL，摇匀，4 ℃ 8 000 r /min 离心 5
min，弃上清液。加丙酮 1 mL，同上重复萃取 3 次，
弃上清液，加入 1 mL预热(65 ℃)的 2 × CTAB提取
液，65 ℃水浴 2 h。加入三氯甲烷-异戊醇(体积比
24∶ 1)0． 5 mL 抽提，4 ℃放置 10 min，10 000 r /min
离心 10 min。取上清，再加入三氯甲烷-异戊醇(体
积比 24∶ 1)0． 5 mL抽提 1 次。上清液中加入 2 /3 体
积的异丙醇沉淀核酸，6 000 r /min 离心 5 min，收集
沉淀。小心除去上清液，沉淀加入洗涤缓冲液(体
793第 4 期 邓锋，等．利用 ISSR分子法标记鉴别新会茶枝柑
积分数 70%乙醇)0． 5 mL，轻柔涡旋打散沉淀，于室
温下放置 20 min。10 000 r /min离心 10 min，收集沉
淀，干燥后，用适量 TE(10 mmol /L Tris-HCl + 1
mmol /L EDTA，pH8． 0)溶解。
用紫外分光光度检测 DNA样品的质量浓度，稀
释至 50 ng /μL，作为 PCR反应的模板。
2． 2 ISSR-PCR扩增
ISSR引物序列参照加拿大 British Columbia 大
学生物技术实验室(编号 UBC ISSR801-900) ，通过
筛选选择 28 条引物进行分析，选取的引物见表 2。
表 2 选取的 ISSR引物
Table 2 Selected ISSR primer sequences
引物编号 引物序列 5-3 引物编号 引物序列 5-3
UBC807 AGA GAG AGA GAG AGA GT UBC810 GAG AGA GAG AGA GAG AT
UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AC UBC812 GAG AGA GAG AGA GAG AA
UBC814 CTC TCT CTC TCT CTC TA UBC815 CTC TCT CTC TCT CTC TG
UBC818 CAC ACA CAC ACA CAC AG UBC820 GTG TGT GTG TGT GTG TC
UBC822 TCT CTC TCT CTC TCT CA UBC823 TCT CTC TCT CTC TCT CC
UBC825 ACA CAC ACA CAC ACA CT UBC826 ACA CAC ACA CAC ACA CC
UBC829 TGT GTG TGT GTG TGT GC UBC840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT
UBC841 GAGAGAGAGAGA GAG AYC UBC843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA
UBC844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC UBC846 CAC ACA CAC ACA CAC ART
UBC847 CACACA CAC ACA CAC ARC UBC848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG
UBC849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA UBC856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA
UBC857 ACACACACA CAC ACA CYG UBC859 TGT GTG TGT GTG TGT GRC
UBC866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC UBC867 GGCGGCGGCGGCGGCGGC
UBC873 GAC AGA CAG ACA GAC A UBC880 GGA GAG GAG AGG AGA
注:R =(A，G) ，Y =(C，T) ，D =(A，G，T) ，H =(A，C，T) ，V =(A，C，G)。
PCR反应体系为 20 μL:超纯水 14． 4 μL，10 ×
PCR Buffer 2． 0 μL，MgCl2(20 m mol /L)1． 5 μL，
dNTP(10 m mol /L)0． 4 μL，引物(0． 011 m mol /L)
0． 5 μL，模板(50 ng /μL)1． 0 μL，Taq 酶(5 U /μL)
0． 2 μL。
PCR扩增程序为:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变
性 40 s，53 ℃退火 35 s，72 ℃延伸 55 s，40 个循环，
72 ℃保持 5 min，扩增产物 4 ℃保存。
2． 3 电泳分析
ISSR-PCR产物使用 1． 5%(质量浓度)琼脂糖凝
胶电泳以 100 bp DNA Marker定位，3． 5 V /cm恒压电
泳，以 EB染色，254 nm波长检测，凝胶成像扫描。
3 结果
在 28 个 ISSR引物扩增产物的电泳结果中，大
部分产物均显示出了共有的条带，同时不同样品间
也出现了规律性不强的多态性条带，只有引物
UBC818 和 UBC822 扩增的结果表明不同品种的条
带有所区别，所有的茶枝柑均出现了明显区别于其
他柑橘的特征条带。引物 UBC818 扩增时茶枝柑除
了在约 600 bp位置出现共性条带外，在约 700 bp处
观察有特征条带;而 UBC822 扩增时，茶枝柑则在
800 bp位置出现了明显的特征条带。见图 1、2。
100 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
M． D100Marker;1 ～ 16．同表 1 中 1 ～ 16。
图 1 引物 UBC818 扩增产物电泳图谱
Figure 1 Sepharose electrophorogram of the samples with primer
UBC818 amplification
100 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
M． D100Marker;1 ～ 16．同表 1 中 1 ～ 16。
图 2 引物 UBC822 扩增产物电泳图谱
Figure 2 Sepharose electrophorogram of the samples with primer
UBC822 amplification
893 广东药学院学报 第 28 卷
4 讨论
本研究中总 DNA的提取采用 CTAB 改良法，可
提取较多的 DNA 模板，所提取总 DNA 的 A260 /A280
比值均在 1． 8 ～ 2． 0 之间，表明该提取方法可行。另
采用市售植物基因组 DNA 提取试剂盒(北京天根
生物有限公司，批号:20100514)提取进行验证，提取
后的总 DNA进行 ISSR分析的结果与 CTAB 法基本
一致，表明该检测方法可行，操作亦可采用试剂盒进
一步简化，可作为新会茶枝柑树种鉴别的方法。本
研究也尝试了直接从广陈皮及其他柑橘品种的皮中
提取总 DNA进行研究，拟达到直接对道地药材广陈
皮进行鉴定分析的目的。但分别采用了市售试剂盒
提取方法、CTAB 法［16］、Zigenhagen 法等的提取效果
均很不理想，杂质过多，不能有效提取其 DNA。
本研究选用了 28 条 ISSR 引物进行分析，最终
发现有 2 条引物能进行种间鉴定，表明单独或联合
应用 2 条 ISSR 引物对茶枝柑进行分析即可达到鉴
别其道地性的目的。但同时对其余引物扩增的条带
结果发现各柑橘品种均出现不同程度的均一化，多
态性不够明显，ISSR序列有着较高同源性，基因序
列趋向保守，无法进行分析鉴别。
由于受到条件限制，本研究主要只针对广东省
境内主要的柑橘生产区域及品种进行采样分析，未
能对省外柑橘产地如四川、浙江、广西、江西、福建等
的陈皮品种进行研究。该方法可进行新会茶枝柑区
别于省内柑橘品种的定性鉴别，同时也为今后继续
深入研究奠定基础。
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( 责任编辑: 刘晓涵)
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