全 文 ：文章编号:1001-4829(2011)01-0225-04
　　收稿日期:2010-09-16
　　基金项目:863计划项目子课题 “柑橘分子育种技术与品种创
制 ”(2006AA100108);贵州省农业科学院专项 “牛肉红金橘区
域化栽培试验 ” [黔农科院专项(2008)]
作者简介:彭志军(1982-), 男 ,硕士 , 从事果树研究 , E-mail:
gzgsszjpeng@163.com, ＊为通讯作者。
朱红橘及其突变体牛肉红金橘的 AFLP分析
彭志军 1 ,陈守一 1 ,蔡永强 1 ,李金强1 ,郭文武2＊
(1.贵州省果树科学研究所 ,贵州贵阳　 550006;2.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,湖北 武汉　430070)
摘　要:为弄清朱红橘红色突变体牛肉红金橘遗传的真实性 ,利用 AFLP分子标记技术对朱红橘 (CitrusreticulataBlanco)及其实
生变异体牛肉红金橘进行了遗传鉴定。结果表明:从 120对 EcoRI/MseI酶切引物中筛选出具有多态性的引物 7对(MCO5E04,
MCO4E01, MC04E02, MC04E03, MC04E04, MC04E06, MCO5E02);对朱红橘及其突变体牛肉红金橘进行 AFLP扩增 , 共扩增出 648
条带 ,其中 , 72条具有多态性,多态性比例占 11.11%;应用 NTSYSpc2.1软件统计分析 ,品种(系)间的遗传距离为 0.0215853。
牛肉红金橘与朱红橘在 DNA水平上确实存在差异 ,牛肉红金橘为遗传上稳定的变异体 ,具有成为新的红肉品种的遗传基础 ,可作
为新型材料加以保护和利用。
关键词:AFLP分析;牛肉红金橘;朱红橘;突变体;遗传距离
中图分类号:S662.1　　　文献标识码:A
IdentificationofZhuhongjuandItsVariantLinebyAFLPAnalysis
PENGZhi-jun1 , CHENShou-yi1 , CAIYong-qiang1 , LIJin-qiang1 , GUOWen-wu2＊
(1.GuizhouFruitInstitute, GuizhouGuiyang550006, China;2.NationalKeyLaboratoryofCropGeneticImprovement, HuazhongAgricul-
turalUniversity, HubeiWuhan430070, China)
Abstract:AFLPtechniquewasusedtodetermineDNApolymorphismofZhuhongjuanditsvariantlineNiurouHongjinju(Citrusreticulata
Blanco)tostudythegeneticdiversityofZhuhongju(CitrusreticulataBlanco)anditsredvariantline.Theresultsshowedthatsevenprimer
pairs(MCO5-E04, MCO4-E01, MC04-E02, MC04-E03, MC04-E04, MC04-E06, MCO5-E02)wereselectedoutof120pairsofprimercom-
binationsand648polymorphismbandswereamplified, 72ofwhichwerepolymorphic.Ratioofpolymorphicbandswas11.11%.Thegenetic
distancebetweenZhuhongjuanditsvariantlinewas0.0215853byNTSYSpc2.1clusteranalysis.NiurouhongjinjuwasdifferentwithZhu-
hongjuatDNAlevelandwasageneticalystablevariantwhichhadgotgeneticbasistobeseletedasanewcultivarandshouldbeprotected
andutilizedasanewmaterial.
Keywords:AFLPanalysis;Niurouhongjinju;Zhuhongju;Mutant;Geneticdistance
　　柑橘是世界第一大水果。一方面 ,由于柑橘具
有雌 /雄性败育 、多胚性干扰 、花期不遇及童期长等
常规育种难以克服的困难;另一方面 ,柑橘自然突变
频率高 ,因此从芽变和实生变异中选育新品种一直
是柑橘品种改良的重要途径。色泽品质是柑橘果实
品质的一个重要方面 ,直接影响果实的感观品质和
营养品质 ,红色在中国是喜庆的颜色 ,易吸引消费
者 ,并且柑橘红色突变体通常富含对人体健康有利
的番茄红素等类胡萝卜素 ,因而选育柑橘红色突变
体一直是广大柑橘育种工作者的目标。迄今 ,已在
甜橙中发现了 Shara甜橙 、CaraCara(红肉)脐橙和
红`暗柳 甜橙(CitrussinensisL.Osbeck)3个红色
突变体;葡萄柚中发现红色突变体多达数 10个 ,较
著名的有红马叙葡萄柚 、RubyRed和 StarRuby;在柚
中发现的有处州早红柚和红肉琯溪蜜柚 [ 1 ～ 2] 。本次
的研究材料牛肉红金橘 ,是 80多年前在贵州省惠水
县涟江河岸的 11万多株朱红橘群体中发现的 ,与普
通朱红橘相比 ,果皮红如牛肉色 ,果肉呈暗红色(图
1)[ 3] 。后来当地果农王昌美经实生繁殖获得其实
生 2代植株 70多株 ,现分布在惠水县好花红乡辉油
村毛栗寨附近 ,惠水县涂伯晨农艺师又从中选育出
果皮果肉色泽最红 、丰产 、优质 、无核或少核优系 ,通
过无性繁殖 ,在生产中推广。该品系是目前发现的
225
2011年 24卷 1期
Vol.24　　No.1　　　　　　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2011.01.064
唯一一个宽皮柑橘红肉突变体 ,其遗传变异研究意
义重大 ,但相关工作还未开展。笔者采用片断扩增
图 1　朱红橘及牛肉红金橘的果实形态
Fig.1　ThefruitspictureofZhuhongju(left)andniurouhongjinju(right)
长度多态性(AFLP)分子标记技术 [ 4 ～ 7]对朱红橘及
其变异体 -牛肉红金橘进行遗传鉴定 ,旨在为牛肉
红金橘品种鉴定和保护提供理论依据 ,以期为其下
一步的推广应用奠定基础。
1　材料与方法
1.1　试材
1.1.1　牛肉红金橘和朱红橘　牛肉红金橘和朱红
橘(CitrusreticulataBlanco),采自贵州省惠水县好花
红乡辉油村毛栗寨柑橘园秋梢上的幼嫩叶片 ,冰盒
保存运输 ,实验室 -70 ℃保存备用。
1.1.2　AFLP接头及引物序列　引物和接头序列详
见表 1,所有接头和引物由生工生物工程公司(中国
上海)合成 。
表 1　AFLP接头及引物序列
Table1　SequenceofadaptersandprimersusedforAFLPanalysis
代号 Code 说明 Explanation 引物序列 Sequenceofprimers
Ead5 EcoRI接头 1 EcoRIadapter1 5-CTCGTAGACTGCGTACC
Ead3 EcoRI接头 2 EcoRIadapter2 5 -AATTGGTACGCAGTCTAC
Mad5 MseI接头 1 MseIadapter1 5-GACGATGAGTCCTGAG
Mad3 MseI接头 2 MseIadapter2 5-TACTCAGGACTCAT
EA00 EcoRI预扩增引物 Preamplificationprimer 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3′
MC00 MseI预扩增引物 Preamplificationprimer 5′-GACGATGAGTCCTGAGTAAC-3′
EA01 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACTGCGTACCAATTCAGC-3′
EA02 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACTGCGTACCAATTCACC-3′
EA03 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACTGCGTACCAATTCACA-3′
EA04 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACTGCGTACCAATTCACT-3′
EA05 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACTGCGTACCAATTCAGG-3′
EA06 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACTGCGTACCAATTCAGT-3′
E01 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAT-3′
E02 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAGA-3′
E03 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCACG-3′
E04 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCATG-3′
E05 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAAG-3′
E06 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAAC-3′
MC01 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′
MC02 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GATGAGTCCTGAGTAACCA-3′
MC03 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3′
MC04 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GATGAGTCCTGAGTAACGA-3′
MC05 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACGATGAGTCCTGAGTAACA-3′A
MC06 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACGATGAGTCCTGAGTAACTC-3′
CMC02 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACGATGAGTCCTGAGTAACAC-3′
CMC03 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACGATGAGTCCTGAGTAACAT-3′
CMC04 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACGATGAGTCCTGAGTAACTA-3′
MC10 选择性扩增引物 Selectiveprimer 5′-GACGATGAGTCCTGAGTAACGTA-3′
226 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
1.1.3　仪器 　PCR-200 PCR仪 , (MJRESEARCH
公司 ,美国)。
1.2　方法
1.2.1　柑橘基因组 DNA的提取与检测 　采用
CTAB法大量提取 DNA,按照参考文献 [ 8]的方法进
行 ,并做适当修改 ,采用 UV-1601型紫外分光光度
计测定 DNA原液浓度及样品 DNA质量 。
1.2.2　AFLP扩增　AFLP扩增参照文献 [ 9 ～ 10]的方
法进行 ,做适当修改。
(1)酶切。双酶切目的 DNA,选用 EcoRI/MseI
两种酶 ,反应体系为 10×的反应缓冲液(bufer)2.0
μl, EcoRI(10U/L)和 MseI(10 U/L)各 0.3 μl,基因
组 DNA250ng,加灭菌双蒸水至总体积 20 μl。先
在 37℃温浴 3 h,再在 65 ℃温浴 2.5 h。
(2)连接 。用 T4 DNA连接酶连接 ,反应体系为
连接缓冲液(bufer)4.0 μl,复性好的 EcoRI和 MseI
接头各 1 μl, T4连接酶(3U/μl)0.4μl,酶切混合物
10 μl,加灭菌双蒸水至总体积 20 μl。 25℃连接 2h
或室温下放置过夜。将连接产物稀释 10倍 ,稀释好
的产物和剩下的产物一起置于 -20 ℃贮存备用。
(3)预扩增。反应体系为稀释好的连接产物 5.
0 μl, EcoRI(25ng/μl)引物和 MseI(25 ng/μl)引物
各 2 μl, MgCl2(50 mM)0.6 μl, TaqDNA聚合酶(5
U/μl)0.08μl, dNTPs(2mM)1μl, 10×PCR反应
缓冲液(bufer)2 μl,灭菌双蒸水 7.32μl,总体积 20
μl。在 PCR仪上扩增 , 20个循环:94 ℃ 30 s, 56 ℃
1 min, 72℃ 1 min。反应混合物稀释 50倍 ,稀释好
的产物和剩下的产物一起置于 -20 ℃贮存备用。
(4)选择性扩增。反应体系为稀释好的预扩增
产物 5.0 μl, EcoRI(25ng/μl)引物和 MseI(25 ng/
μl)引物各 2μl, MgCl2(50mM)0.6μl, TaqDNA聚
合酶(5U/ μl)0.08 μl, dNTPs(2mM)1 μl, 10 ×
PCR反应缓冲液(bufer)2 μl,灭菌双蒸水 7.32 μl,
总体积 20 μl。 PCR程序:94 ℃ 30 s, 65 ℃ 1 min
(每循环降低 0.7 ℃), 72 ℃ 1 min, 13个循环后变
为 94℃ 30 s, 56 ℃ 1 min, 72 ℃ 1min,共 23个循
环 。
(5)电泳 。扩增反应结束后 ,取 4 μl扩增产物
在 6.0 %的变性聚丙烯酰胺凝胶 (含 0.5倍的
TBE)上分离 ,恒定功率 60W,电泳 2h左右(二甲苯
青指示剂距离凝胶底部约 1 /3处)。
(6)银染 。电泳结束后 ,分开两块玻璃板 ,将带
胶的玻璃板放入蒸馏水中漂洗 10s,将漂洗后的胶
板放入染色液(2L水中加入 2.0g硝酸银)中 ,轻轻
摇动 25 min。将染色后的胶板放入超纯水中漂洗 5
～ 10s后立即转入装有 1 L显影液(2L水中加人 1
g的无水碳酸钠 ,用前加 3.0mL37 %的甲醛和 33.
33 g的氢氧化钠)的塑料盒中 ,轻轻摇动至带纹清
晰显现。放入蒸馏水冲洗 2次 ,即可室温下自然干
燥。拍照并保存电子图片。 1.2.3　数据处理与分
析　清晰且易于辨认的多态性带记录为 “1”,空缺
时记录为 “0”。以 NTSYS.pc2.10e软件进行分析。
采用 SIMILARITY法 ,对 AFLP扩增结果进行了相似
性分析。
2　结果与分析
2.1　AFLP标记的多态性
从 120对引物对中筛选的 7个多态性引物对
MCO5E04、 MCO4E01、 MC04E02、 MC04E03、
MC04E04、MC04E06、MCO5E02, 其中 ,有 6个多态
性引物对扩增谱带较为清晰(图 2)。对参试的 2份
材料进行 AFLP分析 ,共扩增出 648条带(表 2),平
均每个引物扩增 92.57条带 。其中 , 多态性带 72
条 ,多态性比例为 11.11 %,引物对中 MC04E04得
到的多态性带的比例最高 ,为 20.43 %, MC04E06
得到的多态性带的比例最低 ,为 7.29 %。
2.2　遗传距离
根据 DNA扩增结果进行统计分析 , 2个品种
(系)之间的遗传距离为 0.0215853,相似性系数为
0.9784147。
1.朱红橘;2.牛肉红金橘;3.箭头指示为差异带
1.Zhuhongju;2.Niurouhongjinju;3.Arowmeanspolymorphicbands
图 2　5个多态性引物获得 AFLP分析图谱
Fig.2　TheamplifiedresultsoffivepolymorphicAFLPprimers
2271期 　　　　　　彭志军等:朱红橘及其突变体牛肉红金橘的 AFLP分析
表 2　AFLP引物对的多态性比较
Table2　PolymorphismofdifferentAFLPprimercombinations
引物组合
Primer
combination
扩增总带数(条)
Totalbands
多态性带数(条)
Polymorphic
bands
多态性比例(%)
Polymorphic
rate
MCO5-E04 97 9 9.27
MCO4-E01 88 8 9.09
MC04-E02 81 7 8.64
MC04-E03 85 11 12.94
MC04-E04 93 19 20.43
MC04-E06 96 7 7.29
MCO5-E02 108 11 10.18
总计 648 72 -
平均 92.57 10.28 11.11
3　结论与讨论
　　(1)AFLP分析表明 ,牛肉红金橘与朱红橘在
DNA水平上确实存在差异 ,说明牛肉红金橘特异表
现性状受遗传物质的控制 ,而不是受环境影响产生
的变异 。采用无性繁殖可保持该性状的稳定性 ,这
为牛肉红金橘的品种审定及下一步的推广应用奠定
了基础 。
(2)柑橘突变体的发掘和利用是柑橘品种改良
的重要途径 ,柑橘突变体鉴定方法的研究对突变体
的发掘具有重要意义 。从牛肉红金橘发现到现在 ,
已有研究者 [ 3]通过珠心苗繁殖 、高位嫁接等手段试
图证明其果实色泽变异遗传的真实性 ,但由于野生
型(朱红橘)与变异体(牛肉红金橘)主要形态学特
征色泽品质差异受环境的影响较大 ,其研究结果不
一致。因此 ,关于牛肉红金橘变异的真实性一直存
在争议 。而笔者运用 AFLP技术从遗传物质基础
DNA水平上揭示野生型(朱红橘)与变异体(牛肉红
金橘)的差异 ,从根本上证实牛肉红金橘变异的真
实性 。因此 , AFLP标记技术是鉴定柑橘突变体的
有效方法 。当然 ,扩增出的差异带中是否含有色泽
品质形成相关的基因还需要进一步分析 。分析还表
明 ,在众多对引物中只有 7个引物存在多态性 ,且多
态性条带数最多只有 19条 ,因而将明显差异带回
收 、经 TA克隆 、测序和在 GENEBANK比对 ,极有可
能找到与果实色泽变化相关的基因 ,为进一步研究
宽皮柑橘果实色泽形成机理开辟新途径 。
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(责任编辑　杨　林)
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