全 文 ：第 24 卷　第 5 6期
2002 年 9月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.24 , No.5 6
Sep., 2002
2002-03-04收稿
http: www .chinainfo.gov.cn periodical bjlydxxb
＊国家自然科学基金资助项目(39600119).
第一作者:周春玲 ,女 , 1975年生 ,博士生.主要研究方向:园林植物遗传育种.电话:010-62390657　Email:zhou.chl@sina.com.cn　地址:
100083北京林业大学 265信箱.
责任作者:戴思兰 ,女 , 1961年生 ,博士 ,教授.主要研究方向:园林植物遗传育种.电话:010-62338313　Emai l:silandai@sina.com.cn　地址:
100083 北京林业大学园林学院.
菊属部分植物的 AFLP分析＊
周春玲　戴思兰
(北京林业大学园林学院)
摘要　利用AFLP技术 , 对菊属植物 12个分类群进行分析.选择 EcoRI MseI 这一酶切组合 , 5 个 E+3 M+2 引物组合
及1 个 E+3 M+3引物组合进行选择性扩增.共得到 287 条条带 ,其中多态性条带占 85.7%.利用UPGMA方法对扩增
数据进行分析 ,结果表明:所选的两个栽培品种`滁菊 和`亳菊 可归并为一个品种 , 该品种与毛华菊 、野菊 、甘菊亲缘
关系相对较近 , 紫花野菊次之 ,小红菊相对最远.各野生种间 , 野菊 、甘菊和菊花脑间的亲缘关系极近 , 且同一分布区
内的不用种间有比较频繁的种质渗入.研究表明 AFLP技术是进行菊属植物亲缘关系研究极为有效的工具.
关键词　AFLP分析 , 酶切组合 , 菊属植物
中图分类号　Q949.783.5
Zhou Chunling;Dai Silan .AFLP analysis of some Dendranthema spp.Journal of Beijing Forestry University
(2002)24(5 6)71 ～ 75[Ch , 18 ref.] College of Landscape Architecture , Beijing For.Univ., 100083 , P.R.
China.
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)technique was used to assay 12 Dendranthema taxons.
Digestion with enzymes EcoRI MseI and amplification with 5 E+3 M +2 primer combinations , 287 AFLP frag-
ments were detected.Among them , 85.7 %were polymorphic.Cluster analysis based on UPGMA method indi-
cates that there are very little genetic differences between two cultivars of Dendranthema grandiflorum used in this
experiment , which can be regarded as one cultivar .This cultivar is relatively close to D.vestitum , D .indi-
cum and D .lavandulifolium , D.zawadskii came secondly , D .chanetii is the most distinct.The relationship
between D.indicum , D.lavandulifolium , D .nankingense , is very close , and there is a frequent gene flow
among the species distributing in the same area.AFLP technology is a very effective method in the phylogenetic
study of genus Dendranthema .
Key words　AFLP analysis , enzymes combinations , Dendranthema
　　菊属(Dendranthema)是一个种内变异极为丰富
的属 ,各野生种均存在着许多类型的地理居群水平
上的变异[ 1] ,属内各种界的划分历来存在争议 ,尤其
是不清楚各分类群的亲缘关系 ,这给菊属植物的分
类学研究和系统演化研究带来一定困难.而菊属中
的菊花是中国的传统名花 ,又是世界四大切花之一 ,
在中国的传统花文化及世界花卉生产中占有极为重
要的地位.但是关于其起源及品种演化问题始终悬
而未决[ 2 ,3] .我国学者自 1954年以来 ,先后对菊花栽
培品种及菊属各野生种展开了引种实验[ 4] ,种间杂
交[ 5] 及细胞遗传学[ 6] 研究 ,初步断定种间杂交是菊
花起源的重要方式[ 3] .1990 年后 ,研究者逐渐将植
物系统学的研究方法引入菊花起源研究 ,通过数量
分类分析[ 7] 和分支分类分析[ 8] ,发现毛华菊 、野菊与
栽培菊花亲缘关系很近 ,并由此推测毛华菊和野菊
是菊花的起源种.自 1995年以来 , 开始利用 RAPD
技术[ 9] 、核酸原位杂交技术[ 10] 及核酸序列分析技
术[ 11] 等分子系统学分析技术进行研究 ,以期探讨菊
属植物各种间基因组的相互关系 ,寻找菊属植物系
统进化与菊花起源的分子生物学证据.
DOI :10.13332/j.1000-1522.2002.z1.015
AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)技
术是 90年代中期发展起来的一种分子标记技术 ,被
认为是迄今为止最为有效的 DNA指纹技术.因其信
息量大 、灵敏度高 、重复性好 ,这一技术一经问世 ,立
即在分子系统学的研究中得到了广泛应用[ 12] .在栽
培植物及其野生近缘种的亲缘关系研究中 ,AFLP充
分显示出其巨大优越性 ,大量应用于各种作物 、重要
的经济植物的起源及遗传多样性的研究 ,近年来也
逐渐应用于观赏植物 ,如牡丹[ 11] 、长绿杜鹃[ 13] 、萱
草[ 14] 的研究.因此本实验选用 AFLP 技术对菊属植
物中与栽培菊花亲缘关系较密切的野生种进行研
究 ,以期为菊花起源研究提供参考资料.
1　材料与方法
1.1 　实验材料
材料名称详见表 1.实验中均取枝顶未完全展
开的嫩叶 ,并于 5 ～ 30个不同单株上取材 ,混合取
样.
表 1　实验材料及来源
TABLE 1　Materials and their resoures
序号 中 名 学名 来 源
1 `滁菊 Dendranthema ×
grandiflora `chuju 中国医科院药植所
2 `亳菊 D.× grandiflora `boju 中国医科院药植所
3 毛华菊 D .vestitum 河南伏牛山
4 毛华菊 D .vestitum 安徽天柱山
5 毛华菊 D .vestitum 宜昌文佛山
6 小红菊 D.chanetii 河北坝上
7 紫花野菊 D.zawadskii 安徽黄山
8 野菊 D .indicum 河南伏牛山
9 野菊 D .indicum 宜昌文佛山
10 甘菊 D .lavandulifolium 河南伏牛山
11 野菊 D .indicum 安徽天柱山
12 菊花脑 D .nankingense 江苏南京
1.2 　DNA提取
叶片在液氮中研磨至粉末状 , 提取方法见
Scotto
[ 15] .各 DNA 样品经 RNaseA 处理后 ,用紫外分
光光度计测OD260 OD280 .
1.3 　DNA的酶切连接
选择MseI PstI ,MseI EcoRI ,MseI SseI ,TaqI AseI 4
种酶切组合 ,各组合 AFLP 反应体系相似 ,以 MseI
EcoRI 为例.
40 μL的酶切体系包括 DNA 300 ng , 5 U EcoRI
(Progea), 5 U MseI (Biolabs) , 10 mmol L Tris-HAc
(pH 7.5),10 mmol L MgAc ,50 mmol L KAc , 5mmol L
DTT ,50 ng μL BSA.37°C酶切过夜.酶切完成后马上
进行连接反应 ,不需灭活内切酶.在每个酶切样品
中 ,加入 10 μL如下反应液:MseI接头 50 pmol ,Eco-
RI 5 pmol ,1U T4DNA 连接酶 ,1mmol L ATP ,10 mmol
L Tris-HAc(pH 7.5), 10 mmol L MgAc , 50 mmol L
KAc ,5 mmol L DTT ,50 ng μL BSA ,37°C连接 3 h .
1.4　AFLP 反应
采用两步反应法 ,使用γ-32P 进行标记.反应程
序见 Vos[ 16] .所有 PCR反应均于 PE-9600上进行.所
用引物序列见表 2.
表 2　接头及引物序列
TABLE 2　Adapter and primer sequences
引物 碱基序列
EcoRI+3 E1
E2
5 -GACTGCGTACCAATTCATT-3
5 -GACTGCGTACCAATTCATC-3
MseI+2 M 1
M10
M12
M14
M15
5 -GATGAGTCCTGAGTAATT-3
5 -GATGAGTCCTGAGTAAAA-3
5 -GATGAGTCCTGAGTAAAC-3
5 -GATGAGTCCTGAGTAAGA-3
5 -GATGAGTCCTGAGTAAGG-3
MseI+3 M48 5 -GATGAGTCCTGAGTAAAAT-3
2　结果与分析
2.1　模板 DNA的酶切组合对 AFLP 反应的影响
AFLP技术采用双酶切 ,常用酶切组合有 MseI
PstI ,MseI EcoRI ,MseI SseI 及 TaqI AseI ,其中前 3 种
组合多用于基因组 DAN 的酶切 , 后一组多用于
cDAN的酶切[ 16] .这几种组合并非全部适用于所有
的植物材料 ,不同植物材料适用的内切酶组合不同.
实验试用了4种酶切组合(图1),MseI SseI ,MseI Ps-
tI两组合所获片段集中在胶板上部 , MseI EcoRI 组
合所获片段分布均匀;TaqI AseI组合所得片段虽然
在测序胶上分布均匀 ,但不同种间共同条带少 ,差
异较大 ,无法进行可靠的相似性系数的计算(图未
附).因此采用了 MseI EcoRI组合 .
2.2　特异性条带的分布
本实验 6组引物共扩增条带 287条 ,结果列于
表 3(部分结果见图 2),多态性条带比率为 85.7% ,
与 RAPD方法相比 ,9个引物共扩增条带 60条 ,多态
性条带比率为 56.7%[ 9] .AFLP分析所测得的无论是
条带总数还是多态性条带数目都显著多于 RAPD分
析 ,在遗传多样性的检测中 ,AFLP 是更有效的工具.
实验中发现共有条带 41 条 ,这是菊属植物的基本
带.每一野生种都有其特异性条带或特异性缺失条
带与其它种相区分 ,这些特异带或特异缺失带可作
为识别这些野生种的分子标记.
72 北　京　林　业　大　学　学　报 第 24卷　
表 3　各种特异性条带及其在 6对引物中的分布
TABLE 3　Specific bands and their distribution in 6 primer combinations
引物组合 扩增条带数目
多态性条
带比率 %
各种特异性条带数目
`滁菊 毛华菊 小红菊 紫花野菊 甘菊 野菊 菊花脑
YE2M1 63 86.1 2(1) 0 3(1) 0 0 0 0
YE1M 10 35 88.9 0(1) 1(1) 4(6) 2 0 1 0
YE2M 12 46 78.0 4 1(1) 2(4) 0 0 0 0
YE1M 14 41 81.2 2 0 2(3) 0 0 0 0(2)
YE1M 15 64 90.6 1 0(1) 1(2) 1(2) 1(1) 0 0
YE1M 48 39 92.4 2 0 0(1) 0 0 0 0
共计 287 85.71 11(2) 2(3) 12(17) 3(2) 1(1) 1 0(2)
注:括号内为特异性缺失条带数目.
　　在 6对引物扩增得到的 287条条带中 , `滁菊
和`亳菊只有 1条有差异 ,相似性系数为 0.99 ,二
者在形态上差异也不显著 ,可将二者归并为 1 个品
种 ,进行数据统计.与野生种比较 ,它具有较多的特
异性条带.在菊花的 RAPD[ 9] 和牡丹的AFLP[ 17] 分析
中也同样发现 ,同一引物或引物组合 ,栽培种常产生
更多的条带.所有野生种中 ,小红菊的特异性条带最
多 ,与`滁菊 不同的是它同时产生了许多特异性缺
失.除小红菊外的其它各种的特异性条带和特异性
缺失条带数目均较少 ,而野菊的特异性条带或特异
性缺失最少 ,在一定程度上反映出各种间比较频繁
的基因交流.在地理分布上 ,野菊 、甘菊 、紫花野菊 ,
毛华菊均有重叠分布 ,而小红菊的分布区相对偏北 ,
与其它各种重叠区域少[ 1] ,在各种间的种质渗入过
程中 ,小红菊与其它种的基因交流可能相对较少 ,导
致其特异性条带数目较多.
图 1　不同酶切组合的 PCR产物
FIGURE 1　PCR productions of different enzymes combinations
图 2　引物 E1M15的 PCR产物
FIGURE 2　PCR productions of primers E1M15
73第 5 6期 周春玲等:菊属部分植物的 AFLP 分析
2.3 　聚类分析
条带存在记为 1 ,条带缺失记为 0 ,采用单匹配
系数对 12个分类群(OTU)的 PCR产物进行计算 ,得
到单匹配系数矩阵.聚类分析采用 UPGMA 法(Un-
weighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average ,
非加权配对算术平均法),全部运算使用 NTSYS 软
件(1992),聚类结果如图 3所示.
图 3　菊属植物 12个 OTU聚类图
FIGURE 3　Dendrogram of 12 OTU of genus Dendranthema
从图 3中可看出 ,小红菊最早与其它样本分开 ,
它与其它各种亲缘关系相对较远 ,其形态特点亦与
其它种差距较大.为便于分析 ,在发生明显跳变的第
5和第6次聚合的中点处作结合线 L , L 将除小红菊
外所有分类群分为 4组 ,第 1组是`滁菊 和`亳菊
两个栽培品种 ,第 2组是毛华菊的 3个地理居群 ,第
3组包括野菊 、甘菊 、菊花脑 3个野生种 ,这 3个野
生种的分布区重叠 ,形态相近 ,菊花脑在此组中最晚
与其它分类群聚合.菊花脑为二倍体 ,最初认为是野
菊的一个变种 ,但在后来的研究中又有证据支持将
菊花脑作为一个独立的种[ 8] .本实验中 ,3个野菊的
地理居群间的相似性系数分别为 0.80 ,0.82 ,0.86 ,
而菊花脑和这 3 个野菊居群的相似性系数分别为
0.78 ,0.78 ,0.75 ,证明菊花脑的分化程度相对较高.
紫花野菊单独成组 ,说明它与其它种的亲缘关系较
远 ,这也与形态学特征相符.
3　讨　　论
3.1 　最佳酶切组合
完全酶切是 AFLP 反应取得成功的基础 ,对样
品的不完全酶切使所检测的带型的差异并不能代表
DNA的多态性[ 16] .选择适宜的酶切组合 ,既要能对
样品 DNA完全酶切并能产生适宜的片段数目和片
段大小.一般认为MseI SseI ,MseI PstI 适用于基因组
较大的植物材料 ,MseI EcoRI适用于较小的基因组.
尽管对菊属各野生种的基因组的大小并无精确数
据 ,但对一六倍体菊花品种的检测 ,基因组约为 1.2
×1020 bp[ 18] .据此考虑应尽量选用前两种酶切组合 ,
而实验中 MseI SseI ,MseI PstI 两组合所得的扩增片
段均偏大 , 集中于胶板上部.为改进酶切结果对
DNA提取方法进行了改进 ,增加了提纯次数 ,并在
酶切体系中加入 BSA ,亚精胺等试剂以提高酶切效
率 ,但酶切仍不完全.在用 EcoRI ,HindII和AseI 等识
别序列同为 6碱基的限制性内切酶进行酶切后 ,证
明DNA质量满足酶切要求.该现象一方面是由于
PstI是甲基化敏感酶 ,另一方面可能是由于菊属植
物有其特异性.因此最后选择了 MseI EcoRI 酶切组
合.
3.2　扩增条带的数目
通常在AFLP 反应中 ,相同引物组合扩增片段
的数目与基因组的大小呈线性关系[ 16] .在本实验
中 ,既有六倍体种及品种 , `滁菊 、` 亳菊 、毛华菊 、
紫花野菊;又有四倍体种野菊和小红菊;还有二倍体
种甘菊和菊花脑 ,基因组的大小存在明显差异.但实
验中相同引物组合不同分类群所得到的扩增条带数
目却基本相同 ,这从侧面反映了菊属植物中可能存
在着一套相似的基本染色体组.在菊属染色体原位
杂交的实验中也发现往往来自于一个基因组的探针
能同时和其它的基因组杂交显示信号 ,而很少出现
特异性明显的杂交信号[ 10] .在用 AFLP 技术进行分
析时 ,不同引物组合得到的条带数目不同 ,有必要对
大量引物进行筛选.
3.3　菊属的种质渗入问题
石铸等曾根据外部形态和地理分布特征推测野
菊和甘菊的共同分布区内有杂交现象的发生[ 1] .在
聚类分析中 ,原产于伏牛山的甘菊和野菊相似性系
数很高 ,甚至高于不同原产地的野菊之间的相似性
系数 ,也证明二者之间的基因交流是频繁的.赵会恩
对菊属 15个分类群的 ITS 区测序结果显示:这些菊
属植物 IST序列长度完全相同 ,均为 252+222 ,其中
仅有 15个信号位点的差异 ,如果不考虑外类群 ,仅
剩 4个信号位点[ 11] .这些现象从不同侧面反映了菊
属植物频繁的种质渗入 ,暗示了菊属植物网状系统
发育式样的可能性.
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(责任编辑　董晓燕)
75第 5 6期 周春玲等:菊属部分植物的 AFLP 分析