全 文 ：　　收稿日期:2000_07_19　接受日期:2000_12_20
　　基金项目:重庆市自然科学基金资助项目(编号:99-5759)。
　　谢永红 ,男 ,副研究员。
锦橙叶片 POD动力学研究
谢永红　甘　霖　吴正琴
(重庆市果树研究所 ,江津 402260)
摘　要　以锦橙成熟春梢叶片提取过氧化物酶(POD), 分别测定了该酶的最适 pH 、最适温度及酶促动力学参数 Km
值和Vmax值 ,比较分析了常见几种POD抑制剂的作用程度。结果表明:以邻甲氧基酚为底物 , 叶片POD 的最适pH
为5.0 , 最适温度为 32℃, Km 值为28.04 mmol/ L, Vmax 值为147.83unit/ s·gFW。在所测的 6 种抑制剂(K+、Pb2+、
CN-、Vc、硫脲及 L-半胱氨酸)中 , CN- , Pb2+, 硫脲和 L-半胱氨酸对 POD 表现出较强的抑制作用 , K+对 POD活性起
促进作用。在一定浓度范围内 ,各种抑制剂的作用程度与其浓度具有极显著的相关性。
关键词　锦橙;春梢叶片;POD;动力学
中图分类号:S666.4　　　文献标识码:A　　　文章编号:1009_9980_(2001)_02_072_03
Study on Dynamics of Peroxidase in the Leaf of Orange cv.Jincheng
Xie Yonghong;Gan Lin , and Wu Zhengqing
(Chongqing Fruit Research Institute , Jiangjin 402260)
Abstract　Peroxidase(POD)in the spring leaf of orange cv.Jincheng(Citrus sinensis Osbeck)was extracted.The optimum pH ,
optimum temperature , Km , Vmax and common inhibitors for POD were analyzed.The results showed that the optimum pH and
temperature were 5.0 and 32 ℃ respectively , Km and Vmax of POD with guaiacol substrate were 28.04 mmol/ L and 147.83
unit/ s·gFW respectively.CN- , Pb2+, thiourea and L-cysteine were strong inhibitors , but K+ was an activator for POD in six
inhibitors measured.In a proper range of inhibitors concentration , the degrees of inhibition of all the inhibitors have a significant
correlation with its concentration.
Key Words　Orange cv.Jincheng;Spring leaf;POD;Dynamics
　　过氧化物酶(peroxidase , POD)活性在植物生理
研究中是一个非常重要的生理指标 。一些学者曾报
道了 POD活性与种子活力[ 1] 、组织衰老[ 2] 、品种耐
缺铁性[ 3]及分枝数和产量[ 4]的相关性。在柑橘和苹
果上也采用 POD活性及其同工酶来鉴定砧木的矮
化程度[ 5 ～ 7] 。吕斌等研究了多种柑橘砧木及嫁接树
叶片 POD活性与树体生长与结果的关系[ 8 ,9] 。以上
都是从 POD活性及其同工酶多型性加以研究 。有
关树体中 POD特性及其动力学研究较少 ,如何对该
酶进行有效的调控未见报道。本文从锦橙叶片中提
取POD ,并对酶的某些特性 、动力学参数及常用抑制
剂的作用效果加以研究 ,为该酶的合理调控提供依
据。
1　材料和方法
1.1 　材料
1999 ～ 2000连续两年以重庆市果树研究所甜橙
园内10年生枳砧锦橙(Citrus sinensis Osbeck)成熟的
春梢叶片为试材 ,每年 6月取样 ,重复测定 3次 。
1.2　POD的提取
将叶片用蒸馏水洗净 ,定量滤纸吸干 ,除去叶片
主脉后 ,剪成碎片 。称取1 g样品加少量蒸馏水和石
英砂 ,研磨成浆 ,定容到100 mL ,稀释 5倍后 1 000×
g离心10 min ,上清液即为酶测定液 。
1.3　POD的测定
愈创木酚法[ 10] :在指形试管中加入1 mL酶液 、
1 mL 1%愈创木酚和1 mL 0.1 mol/L pH5.0 的 HAc
-NaAc缓冲液 ,摇匀后置于 30℃水浴预热5 min ,然
后快速加入1 mL 0.08%H2O2 ,并开始计时 ,立即用
紫外-可见分光光度计测定1 min内■OD470 。一个酶
活性单位为每 g 鲜样在1 s内使 OD值升高 0.1(以
unit/ s·gFW表示)。
1.4　POD最适温度和最适 pH的测定
采用常规方法 ,在不同温度(范围 10 ～ 100℃,
　
果　树　学　报　2001 , 18(2):72～ 74
Journal of Fruit Science
DOI :10.13925/j.cnki.gsxb.2001.02.003
间隔 2℃, pH 5.0)和不同 pH(范围 3.2 ～ 6.4 ,间隔
0.2 ,温度 30℃)条件下测定 POD 活性 ,以最大活性
管为 100%计算相对活性。
1.5　POD Km值和 Vmax值的测定
以邻甲氧基酚为底物 ,设置 1、2、4、10 、20mmol/L的
底物浓度 ,分别测定 POD活性。用双倒数曲线回归
法[11]计算Km值和Vmax值。
1.6　抑制剂对 POD活性影响的测定
在酶促反应中加入不同的抑制剂 ,每种抑制剂
设置 5个浓度(2 、4 、6 、8 、10×10-5mol/L),分别测定
POD的活性V 并计算各抑制剂不同浓度的抑制程
度(以不加抑制剂的 POD活性V0 为对照)。抑制程
度(%)=(1-V/ V0)×100。
2　结果与分析
2.1　温度对 POD活性的影响
由图 1可以看出 ,锦橙叶片 POD的最适温度为
32℃,在 30 ～ 34℃范围内 POD相对活性大于 97%;
低温(14 ℃以下)可抑制 POD 活性达 50%左右 , 14
～ 32℃范围内 ,POD活性随温度的升高明显增加 ,温
度系数Q10为0.51;超过酶的最适温度 , POD活性随
温度的增加而降低 ,当温度升高到58 ℃时 ,酶相对
活性降为59.4%;当高达 84℃时 ,酶完全变性 ,失去
活性 。
图 1　温度对 POD活性的影响
Fig.1　Effect of temperature on POD activity
2.2　pH对 POD活性的影响
图2表明:该 POD的最适 pH 为5.0 ,与愈创木
酚法[ 10]测定POD活性要求的 pH值一致 。当 pH 小
于5.0时 ,POD活性随 pH 值的降低而下降 ,特别是
在pH为4.4 ～ 5.0范围内这种变化更为突出。当 pH
为3.2时 , POD 活性仅为最大活性的24.2%。当 pH
大于5.0时 ,POD活性随 pH 的升高而降低;当 pH为
6.4时 ,POD活性为最大活性的33.7%。
图 2　pH对 POD活性的影响
Fig.2　Effect of pH on POD activity
2.3　POD酶促反应的动力学参数 Km和 Vmax
利用双倒数法对 1/ [ s] 和 1/V作图(图 3)并进
行线性回归 ,计算出锦橙叶片 POD以邻甲氧基酚为
底物的 Km 值为28.04 mmol/L ,Vmax 值为147.83 U/
s·gFW 。说明 POD与邻甲氧基酚的亲和力较好 。
图 3　POD酶促反应双倒数曲线
Fig.3　Double reciprocal plot of POD enzymatic reaction
2.4　不同抑制剂对 POD活性的影响
不同抑制剂对 POD的抑制作用有明显差别(表
1)。L-半胱氨酸 、硫脲 、Pb2+ 、CN-对 POD活性有明
显抑制作用 ,其中 CN-的抑制效果最好 , 在 10×
10
-5
mol/L时抑制率为86.7%。Vc对POD活性影响
较小 ,在 10×10-5mol/L 时抑制率仅为 14.89%。而
K+的存在可提高 POD 活性 , 当浓度为 8 ×10-5
mol/L时 ,POD活性提高26.6%。在一定浓度范围内
每种抑制剂的抑制效果与其浓度具有极显著的相关
性 ,抑制率 Y(%)与浓度 X(×10-5mol/L)的回归方
732期　　　　　　　　　　　　　　　　　谢永红等:锦橙叶片 POD动力学研究　　　　　　　　　　　　　　　　
程分别为:
K
+:Y =0.169X3 -2.595 5 X2 +7.032X -
4.468 1(R2=0.989 2＊＊)
Vc:Y =0.027 7 X3 -0.546 2X2 +3.983X +
1.968 1(R2=0.999 8＊＊)
Pb
2+:Y=0.171 8X3 -2.056 4X2 +8.099X -
0.691 5(R2=0.999 0＊＊)
CN-:Y=-0.302 X3+5.283 5X2 -17.613X+
35.319(R2=0.974 0＊＊)
L-半胱氨酸:Y =0.060 9 X3 -1.101 8X2 +
9.121 7X-9.308 5(R2=0.999 8＊＊)
硫脲:Y=3.836 9X0.7911(R2=0.987 6＊＊)
表 1　不同抑制剂对锦橙叶片 POD活性的影响
Table 1　Effects of different inhibitors on POD activity
抑制剂
Inhibitors
各浓度(×10-5mol/L)的抑制程度
Degree of inhibition(%)
2 4 6 8 10
回归方程
Rrgressive equation
R2
KCl Potassium chloride 0.27 -5.85 -21.01 -26.60 -25.00 Y=0.169X3-2.595 5X2+7.032X-4.468 1 0.989 2＊＊
PbSO4Anglesite 8.77 9.31 11.70 19.95 46.54 Y=0.171 8X3-2.056 4X2+8.099X-0.691 5 0.999 0＊＊
氰化钾Potassium cyanide 19.95 25.53 61.44 73.40 86.70 Y=-0.302X3+5.283 5X2-17.613X+35.319 0.974 0＊＊
Vc Ascorbic acid 7.98 10.90 12.23 13.03 14.89 Y=0.027 7X3-0.546 2X2+3.983X+1.968 1 0.999 8＊＊
硫脲Thiourea 6.91 11.17 14.63 19.95 25.27 Y=3.836 9X0.7911 0.987 6＊＊
L-半胱氨酸 L-Cysteine 5.05 13.30 19.15 24.20 32.71 Y=0.060 9X3-1.101 8X2+9.121 7X-9.308 5 0.999 8＊＊
　　注:1.Y代表抑制程度(%),X 代表抑制剂浓度(×10-5 mol/ L)。 2.表中数据用相关系数法检验 , ＊＊表示达极显著相关水平(n=5)。
　　Note:1.Y:degree of inhibition , X:content of inhibitors.2.The data in table were analysizedwith correlative coefficient method, ＊＊:significant at P<1%
level(n=5).
3　讨　论
试验表明 ,锦橙叶片 POD的最适温度为32 ℃,
最适 pH为5.0 ,偏离最适温度和最适 pH ,酶活性将
明显降低;不同抑制剂及其浓度对 POD活性影响具
有明显差异。因此 ,树体在不同环境条件下 ,其 POD
活性各不相同 ,这将直接影响树体的生理状态和生
长发育情况。利用外界因素或人为因素(如温度 、土
壤pH 、土壤重金属含量及钾离子浓度等)对 POD活
性进行有效的调控 ,使其达到较适宜的酶活性范围 ,
以满足柑橘不同时期树体 、果实生长发育的需要 ,这
在果树栽培和生理研究中都具有重要的意义 。
本文仅以邻甲氧基酚为底物对锦橙叶片 POD
的某些特性及常见抑制剂进行了试验 ,有关其它底
物的情况 、POD的其它特性以及不同抑制剂的相互
作用等有待进一步研究。在酶对外界调控因子的表
达研究中尚需进行 POD同工酶分离与活性分析 ,以
确定各调控因子的主要表达蛋白和表达强度 。
参　考　文　献
[ 1] 　吴岳轩 ,曾富华.空间飞行对番茄种子活力及其活性氧代谢的
影响[ J] .园艺学报 , 1998 , 25(2):165～ 169.
[ 2] 　张丽欣 ,宗汝静.四种叶菜衰老期间呼吸 、乙烯产生 , IAA和过
氧化物酶的变化及其相互关系[ J] .植物生理学报 , 1998 ,14(1):
81～ 89.
[ 3] 　李式军 ,汪李平.水培生菜缺铁胁迫品种的筛选及其生理特性
研究[ J] .园艺学报 , 1995, 22(2):147～ 152.
[ 4] 　杨暹 ,关佩聪 ,陈玉娣.青花菜东京绿侧枝数与产量及过氧化物
酶活性研究[ J] .园艺学报 , 1995, 22(2):157～ 160.
[ 5] 　李文斌 ,张映南 ,刘庚峰 ,等.柑桔矮化砧及半矮化砧过氧化物
酶同工酶及活性的比较[ J] .园艺学报 ,1989 , 16(4):261～ 265.
[ 6] 　李秀玲 ,马仁懿.苹果矮化砧与乔化砧过氧化物酶同工酶的比
较研究[ J] .植物学报 , 1981 , 23(1):82～ 84.
[ 7] 　胡国谦 ,张谷雄 ,周中建 ,等.利用叶片过氧化物酶同工酶鉴定
柑桔砧木资源矮化性能[ J] .热带作物科技 , 1992 , 11(1):15 ～
17.
[ 8] 　吕斌 ,陈学年 ,李质怡 ,等.不同砧木先锋橙叶片 POD活性与树
体生长势的关系[ J] .西南农业学报 , 1999 , 12(2):63～ 67.
[ 9] 　欧毅 ,毛启才 ,曹照春 ,等.不同砧木锦橙叶片过氧化物酶活性
与植株生长结果的关系[ J] .云南农业大学学报 , 1994 , 9(1):23
～ 27.
[ 10] 　陈秀伟 ,冯叙桥.农产品贮藏运销学实验教程[M] .重庆:西南
农业大学 , 1990.
[ 11] 　Lineeweaver H , Burk D.The determination of enzyme dissociation
contants[ J] .J Amer Chem Soc , 1934 , 56:685～ 688.
74　　 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　果　　树　　学　　报　　　　 　 　　　　　　　　　　　　　18 卷