全 文 ：收稿日期:2009-09-10;＊通讯联系人.
基金项目:国家自然科学基金(30660020)和江西省科技支撑计划[ 赣财教 2007(173)] 资助项目.
作者简介:张杨军(1978-),男 ,安徽舒城人 ,硕士研究生 , 主要从事植物生物技术研究.
文章编号:1100-5862(2010)01-0089-04
南丰蜜橘组织培养及植株再生
张杨军1 , 　涂艺声1＊ , 　刘　洁1 , 　张志强2
(1.江西师范大学 生命科学学院 ,江西南昌　330022;2.南丰县蜜橘良种繁育公司 ,江西南丰　344511)
摘要:以南丰蜜橘种子无菌苗的子叶 、上胚轴 、茎端 、下胚轴为材料 ,在不同激素配比的 MS 基本培养基上
进行外植体筛选和诱导不定芽分化 、继代及生根培养 ,确定了诱导植株再生的最佳外植体和最适条件:
(1)诱导不定芽分化最好外植体为上胚轴 , 不定芽分化率达 90%;(2)继代培养中最适激素配比为 MS+
0.8 mg/L 6-BA+0.1 mg/ L NAA+0.5 mg/ L D-泛酸钙;(3)生根最适合培养基为 MS/2+0.1 mg/ L NAA.
关键词:上胚轴;植株再生;组织培养;南丰蜜橘
中图分类号:Q 943.1　　　　　文献标识码:A
柑橘是人们喜食的水果之一 ,它不仅含有丰富的维生素 C 、胡萝卜素和柠檬酸等能调节人体新陈代谢的
物质 ,还含有陈皮甙 、陈皮素 、挥发油 、黄酮等化学成分.近年有科学研究表明这些成分具有扩张冠状动脉 、
增强血流量 、增强微血管韧性的功效 ,可以降低沉积在动脉血管中的胆固醇 ,有助于使动脉粥样硬化发生逆
转.因此 ,对于柑橘的食药综合开发越来越受到人们的关注.
南丰蜜橘为宽皮柑橘乳桔类小果型品种 ,是我国名特优柑桔品种 ,以皮薄 、核少 、汁多化渣 、甜酸适口 、
香味独特 、色泽金黄 、营养丰富而享誉古今中外.南丰蜜橘是乳桔中的精品 ,其最突出的特点在于香和甜的
融合 ,在桔中独具特色.目前 ,国内外对柑橘的组织 、细胞及原生质体培养方面都开展了广泛的研究[ 1-4] ,利
用组织培养的方法在试管内大量繁殖植物种苗具有繁殖速度快 、生产不受季节的限制等特点.然而 ,宽皮柑
橘在组织培养方面存在分化率低 、生根困难等一系列问题[ 4-7] ,导致难以获得生长旺盛的植株 ,因此严重阻
碍了宽皮柑橘植物组织培养技术的生产开发应用.本文以南丰蜜橘无菌种子苗为实验材料 ,通过组织培养
筛选具有高分化率的外植体及最佳的培养基配方 ,提高生根率 ,为探索南丰蜜橘组织培养快速繁殖技术 、种
质资源保存 、品种改良建立了技术平台 ,也为宽皮柑橘的生物工程研究开发提供依据.
1　材料与方法
1.1　材料
所用材料取自江西抚州地区南丰县南丰蜜橘的少籽优良品种的种子 ,以经试管培育的优良品种无菌苗
为材料.
1.2　试验方法
1.2.1　种子消毒和培养　选取饱满的柑橘种子在自来水管下冲洗 30 min ,去除表面粘连果肉 ,在超净台上
剥去种子外壳 ,再用 0.1%HgCl2浸泡 8 ～ 10 min ,后用无菌水反复冲洗 4 ～ 5次 ,即得表面无菌材料 ,备用.将
消毒后的种子接种于 MS[ 8-10]中 ,每瓶接 4粒 ,共接 12瓶.在暗处培养 7 d后移至光照处培养 ,大约 10 d左右
可以得实验用无菌种子苗.
1.2.2　外植体的筛选　将种子苗分成子叶 、上胚轴 、下胚轴和茎端 4部分接种于MS+0.4 mg/L6-BA+0.05
mg/L NAA培养基中 ,10 ,20 ,30 d 分别记算诱导率.诱导率/ %=再生芽分化的块数/成活的外植体块数×
100.
第 34 卷第 1期
2010 年 1 月　
江西师范大学学报(自然科学版)
JOURNAL OF JIANGXI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)
Vol.34 No.1
　Jan.2010
DOI :10.16357/j.cnki.issn1000-5862.2010.01.020
1.2.3　诱导分化培养基的筛选　添加激素进行正交设计 ,设计培养基 L1 ～ L9 ,见表 1.将筛选出最好的外植
体接种于该培养基中 ,30 d后计算诱导分化芽的增殖倍数.增殖倍数=有效芽数/开始芽数.
1.2.4　不定芽增殖处理　将诱导出的丛生芽再分割接种不定芽继代增殖培养基:MS+0.1 mg/L NAA+
0.5 mg/L D-泛酸钙 ,再添加6-BA设计 0 ～ 1.6 mg/L 5个浓度梯度.每瓶接 4块 , 30 d后计算增殖倍数.
1.2.5　试管苗生根和移栽　将试管无根苗切割至生根培养基中诱导生根 ,每瓶接 2株 ,每个处理重复 3次.
30 d后统计生根情况 ,生根率/ %=生根株数/诱导株数×100.
1.2.6　培养条件　所有培养基中添加蔗糖 45 g/L 、琼脂粉 6 g/L 、pH 值为 5.8.培养温度为(25±2)℃,光照
强度为1 500 ～ 2 000 lx ,光照时间为 16 h/d.生根时 ,光照强度为1 000 lx ,光照时间为 14 h/d.
表 1　培养基组分
培养基代号 培养基中添加的激素
BA/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1) D-泛酸钙/(mg·L-1)
L1 0　　 0　　 0　　
L2 0　　 0.1　　 0.5　　
L3 0　　 1.0　　 1.0　　
L4 0.8　　 0.1　　 1.0　　
L5 0.8　　 1.0　　 0　　
L6 0.8　　 0　　 0.5　　
L7 1.6　　 1.0　　 0.5　　
L8 1.6　　 0　　 1.0　　
L9 1.6　　 0.1　　 0　　
　　　　　　　　　　注:基本培养基为 MS.
2　结果与分析
2.1　外植体的筛选
采用无菌种子苗的上胚轴 、下胚轴 、子叶和茎端等作为外植体 ,接种在培养基上诱导不定芽分化 ,实验
结果见表 2.表 2数据表明不同外植体的诱导不定芽发生能力有显著差异.上胚轴不定芽的平均诱导率最
高 ,可达 90%,培养过程中出芽所需时间最短;子叶不定芽的诱导率稍低 ,平均诱导率为 65.5%,但培养过程
中发现多分化出单芽;茎端不定芽的诱导过程中未见有芽分化.
表 2　不同外植体对不定芽发生的影响
选材部位 外植体数/个 平均诱导率±SE/ %
10 d 20 d 30 d
上胚轴 48 30.25±0.02a 65.00±0.01a 90.00±0.01a
子叶愈伤 48 17.05±0.02b 33.25±0.01b 65.5±0.01b
茎端 48 13.05±0.01c 29.05±0.01c 29.05±0.01c
下胚轴 48 0d 0d 0d
　　　　　　注:表中计算结果为平均值±标准误差;小写字母表示邓肯氏新复极差法检验在 0.05水平上差异极显著.
2.2　诱导分化培养基的筛选
将上胚轴作为外植体 ,接种到 L 1 ～ L 9培养基中.对添加不同激素水平正交设计的组合进行极差和方差
分析 ,结果见表 3 .极差分析显示 6-BA水平是对实验结果影响最大的因素 ,方差分析结果也表明 6-BA对芽
的增殖作用有显著性影响.实验过程中 L 1、L 2、L 3 、L4 、L5 、L6 、L7 均可诱导上胚轴分化出不定芽.L2 和 L4 上
90 江西师范大学学报(自然科学版) 2010 年
不定芽诱导数最多 ,增殖芽数为 6.0.两种培养基上芽的长势存在差别 , L2 上不定芽叶片能顺利张开 ,但茎
短 、生长较慢;L4 上茎生长正常 ,但未见叶片张开.L5和 L6 上不定芽长势较弱 ,芽生长慢 ,叶分化不明显.培
养基中不添加外源激素也能诱导上胚轴分化出不定芽 ,说明上胚轴可能含有较多的内源激素 ,能够诱导其
不定芽发生.
表 3　不同激素配组合上胚轴不定芽发生的影响
处理 BA/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1) D-泛酸钙/(mg·L-1) 增殖芽数/个
1 0 0 0 3.0
2 0 0.1 0.5 6.0
3 0 1.0 1.0 3.0
4 0.8 0.1 1.0 6.0
5 0.8 1.0 0 4.5
6 0.8 0 0.5 4.5
7 1.6 1.0 0.5 0
8 1.6 0 1.0 0
9 1.6 0.1 0 0
水平 1 4.0 2.5 2.5
水平 2 5.0 4.0 3.5
水平 3 0 2.5 3.0
极差 R 5.0 1.5 1.0
SS 14.0 1.5 0.5 16.5
df 2 2 2 8
MS 7.000 0 0.750 0 0.250 0 2.062 5
F 28 3 1
显著性 ＊
图 1　BA 的浓度对不定芽继代培养的影响
2.3　BA浓度对继代培养不定芽增殖的影响
根据诱导分化的结果 ,继续探讨 6-BA 对继代芽的影
响.将不定芽切割后分别接种于继代培养基上进行继代培
养 ,记录开始接种时芽数 ,30 d后观察丛芽生长状况并统计
其有效芽 ,计算增殖倍数 ,结果见图 1.图 1表明 ,外加 BA
对不定芽的发生有明显的促进作用:BA 浓度越高 ,丛生芽
增殖倍数越高.但当 6-BA 浓度为 1.6 mg/L 时 ,所出芽纤
细 ,且出现畸形芽.
2.4　试管苗生根
取生长良好的试管苗转入含不同 NAA 浓度梯度的
1/2MS培养基上进行生根培养 ,30 d时记录 ,结果见表 4.0.
1 mg/L和 0.5 mg/L的培养基上的芽均有生根 ,根长平均为 2.0 cm和 0.7 cm.NAA浓度为 0.1 mg/L 时 ,根生
长较快 ,发育良好 ,适合移栽.0.5 mg/L的NAA也能诱导出根 ,但根粗短 ,生长慢.
91第 1期 张杨军 ,等:南丰蜜橘组织培养及植株再生
表 4　不同激素组合对试管苗生根率的影响
培养基 生根时间/d 平均根长/ cm 平均根数/个 平均生根率/ %
1/2MS+0.05 mg/ L NAA 30 0 0 0
1/2MS+0.1 mg/ L NAA 30 2.0±0.01 2.14±0.03 66.7±0.13
1/2MS+0.5 mg/ L NAA 30 0.7±0.01 1.76±0.01 50.0±0.01
1/2MS+1 mg/ L NAA 30 0 0 0
　　注:基本培养基为 1/ 2MS.
3　结论
组织培养诱导不定芽不仅与外源激素有关 , 而且受外植体材料的影响也较大.南丰蜜橘离体器官组织
培养及植株再生体系研究表明:诱导不定芽分化的最佳外植体为上胚轴 ,该外植体诱导分化率高 ,有利于进
行植株再生.继代培养最适宜培养基为MS+0.8 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5mg/L D-泛酸钙 ,且发现 6-
BA对不定芽生长有显著影响 ,能促进芽的分化.生根的适宜培养基为 1/2MS+0.1 mg/L NAA.同时还发现子
叶诱导分化过程中分化芽大多数为单芽 ,关于这方面的问题还有待进一步研究.
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Tissue Culture and Regeneration of Citrus Reticulata
Blanco var.Kinokuni(Takana)H.H.Hu
ZHANG Yan-jun1 , 　TU Yi-sheng1＊ , 　LIU Jie1 , 　ZHANG Zhi-qiang2
(1.College of Life Sciences , Jiangxi Normal University ,Nanchang Jiangxi 330022 , China;2.)
Abstract:In this paper , the cotyledon , epicotyl , stick ,hypocotyl of Citrus reticulata Blanco var.kinokuni(Tanaka)H.H.
Hu seeding were used as explants for buds and roots on culture media with different hormone combinations.The best re-
sults were achieved on the following media:(1)90% shoot induction , the best part is epicotyl.(2)The best concentration
media is MS+0.8 mg/L BA+0.1 mg/L NAA +0.5 mg/L D-calcium d-pantothenate in the subculture medium.
(3)Rooting on 1/2MS medium supplement withi 0.1 mg/L NAA.
Key words:epicotyl;plant regeneration;tissue culture;Citrus reticulata Blanco var.kinokuni
(责任编辑:刘显亮)
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