全 文 ：中国农业科学 2008,41(2):417-423
Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2007-01-11；接受日期：2007-04-03
基金项目：国家自然科学基金（30370929）和广东省科技攻关项目（C20209）
作者简介：阮小蕾（1973-），女，内蒙古包头人，博士，研究方向为植物病理学。Tel：020-85280306；E-mail：ruanxl@scau.edu.cn。通讯作者李华
平（1961-），男，湖北天门人，教授，研究方向为植物病理学。Tel：020-85281107；Fax：020-85281107；E-mail：huaping @scau.edu.cn

望江南中核糖体失活蛋白新基因 CassinⅠ的克隆及特征分析
阮小蕾，刘丽芳，何云蔚，刘福秀，李华平
（华南农业大学资源环境学院植物病毒研究室，广州 510642）

摘要：【目的】克隆在植物抗病虫过程中具有重要作用的核糖体失活蛋白新基因，为该类蛋白基因功能研究
和有效利用创造条件。【方法】通过分析多种不同来源的植物核糖体失活蛋白的氨基酸序列，据其保守区域设计 1
对植物通用简并引物 P1 和 P2，对药用植物望江南基因组进行 PCR 扩增，获得一种新的 RIP 基因片段。通过 RACE
法，获得了其全长 cDNA 序列-CassinⅠ。【结果】CassinⅠ基因全长为 882 bp，其推导的氨基酸序列与葫芦科两
个代表核糖体失活蛋白β-luffin 和 Trichosanthin（TCS）的相似性分别为 58.2%和 34.7%，与 GenBank 中其它核
糖体失活蛋白的序列无显著相似性。多重序列比对发现：CassinⅠ有 9个氨基酸残基与 TCS 的 N-糖苷酶活性位点
的残基完全相同，另外两个残基发生了变化。所有的活性位点都在 P1/P2 扩增区段内。【结论】首次在望江南中克
隆和报道一种新的核糖体失活蛋白基因，为进一步研究该基因的功能、并应用于作物转基因抗病虫害育种研究奠
定了基础。
关键词：望江南；核糖体失活蛋白；基因克隆；特征分析

Cloning and Signature Analysis of A Novel Gene of Ribosome
Inactivating Protein from Cassia occidentalis
RUAN Xiao-lei, LIU Li-fang, HE Yun-wei, LIU Fu-xiu, LI Hua-ping
(Laboratory of Plant Virology, College of Nature Resource and Environment,
South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

Abstract:【Objective】Ribosome inactivating proteins (RIPs) are a group of important proteins that inhibit the growth of plant
pathogens and development of insects. Cloning the RIPs genes is very important for research their resistant function and applications.
【Method】A novel DNA fragment coding RIP was isolated from Cassia occidentalis by applying a PCR strategy in which a pair of
universal degenerated primers deduced from the two blocks with strong conserved amino acid regions in multiple plants was used.
Then the full length cDNA (CassinⅠ) of the fragment was obtained by rapid amplification of cDNA ends.【Result】The full length of
CassinⅠwas 882 bp. Compared with two kinds of typical RIP from Cucurbitaceae, the homologies of the deduced amino acid
sequences of CassinⅠshared 58.2% and 34.7% with that of β-luffin and Trichosanthin (TCS), respectively, and there was no
significant homology compared with other sequences of RIPs in GenBank. Result of multiple alignment about TCS, β-luffin and
CassinⅠshown that 9 amino acid residues forming the active site of the TCS were conserved in CassinⅠ except that 2 residues was
different. All the RIP active sites of CassinⅠ sequence were contained in P1/P2 amplification region.【Conclusion】It is the first
report that a novel RIP gene was cloned from the Cassia occidentalis.. The results reported in this paper have laid a foundation for
further studies of RIP gene function and development of transgenic plants to control plant diseases and insects.
Key words: Cassia occidentalis; Ribosome inactivating protein; Gene cloning; Signature analysis

0 引言
【研究意义】植物病害和虫害使农业生产蒙受严
重损失。使用化学农药给农业生产带来很多严重问题，
而基因工程技术为防治植物病虫害开辟了一条崭新的
途径。本研究通过分析多种不同来源的植物核糖体失
418 中 国 农 业 科 学 41 卷
活蛋白（ribosome inactivating protein，RIP）的氨基酸
序列，据其保守区域设计 1 对植物通用简并引物 P1
和 P2，在药用植物望江南（Cassia occidentalis）中分
离出一个新的 RIP 的全长 cDNA 序列。这为进一步进
行作物抗病虫害的转基因研究和开发新型病虫害防治
生物农药奠定了基础。【前人硏究进展】来源于蓖麻
（Ricinus communis）的毒蛋白（ricin）和来源于相思
子（Abrus precatorius）的毒蛋白（abrin）是最早发现
并鉴定的 RIP[1]。研究发现，RIP 具有特异的 RNA N-
糖苷酶（EC3.2.2.22）活性，可专一性水解核糖体 28S
rRNA 3′-端茎环结构第 4 324 位的腺嘌呤残基，使核糖
体大亚基不能结合延长因子 2 以至不可逆失活，而抑
制蛋白的合成，但它不失活自身的核糖体及 rRNA，
只对其它物种的核糖体显示高度特异性[2]。RIP 可以
分为 2 类，第 1 类是单肽链蛋白（typeⅠ），具有 RNA
N-糖苷酶活性，在活性位点区域内有高度保守的活性
残基和二级结构，如天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）、
美洲商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein，
PAP）、皂草素（saporin）、丝瓜毒蛋白（luffin）等。
第 2 类是异源二聚体蛋白，A 链具有 RNA N-糖苷酶
活性，B 链是一个对半乳糖专一的凝集素。Ⅱ型 RIP
仅在 6 科 8 种植物中发现，如 ricin 和 abrin 等[3]。RIP
广泛存在于植物界，目前已经从 350 余种植物中筛选
到 110 多种 RIP[4~7]。很多 RIP 具有免疫抑制、抗病毒、
抗肿瘤等多方面的药理活性[8]。其中，ricin、TCS、PAP
等 RIP 经常被用作治疗肿瘤的“生物弹头”[9]。临床
表明：很多 RIP 可以抑制流感病毒、乙型脑炎病毒、
麻疹病毒、单纯疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病
毒等；现在已知 10 余种植物 RIP 均具有很强的抗 HIV
活性[10]。此外，RIP 具有广谱的植物病毒抗性和抗多
种植物病原真菌以及农业害虫的活性，在植物保护中
具有广泛的应用前景[11]。望江南，别名金豆子、羊角
豆等，是苏木科（Cassceae）决明属（Senna）的一种
药用植物，性味苦寒，中医学上常用来肃肺、清肝、
和胃、消肿解毒等。其叶、根、种子中含有挥发油，
对多种细菌有抑制作用，其水提取物对某些真菌有抑
制作用。《福建民间草药》记载，望江南还具有杀虫
解毒的功效，常用来治疗虫、蛇咬伤。【本研究切入
点】迄今为止，尚未见到望江南中关于 RIP 的任何报
道。多个 RIP 基因的克隆及其保守序列的研究使从药
用植物中克隆新的 RIP 基因成为可能。【拟解决的关
键问题】本研究运用反向遗传学的方法，尝试从望江
南中克隆 RIP 新基因，以期为进一步研究该基因的功
能、并应用于作物转基因抗病虫害育种等研究奠定基
础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 望江南（Cassia occidentalis）由华
南农业大学植物病毒室提供。
1.1.2 试剂 pMD-18 T 载体、限制性内切酶、3′-Full
RACE Core Set、5′-Full RACE Core Set 等购于宝生物
工程（大连）有限公司（TaKaRa）。RNApure 植物
RNA 抽提试剂盒购自天为时代公司。
1.1.3 引物和测序 PCR 引物由北京赛百胜生物工
程有限公司合成；序列测定均由上海联合基因生物工
程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 望江南中核糖体失活蛋白新基因的获得
1.2.1.1 简并引物的设计 参考林毅等[12]根据葫芦
科 RIP 的代表—天花粉蛋白（TCS）基因的上、下游
两段高度保守的氨基酸序列设计的简并引物，分析了
多种不同来源的植物 RIP 基因的相应区段的氨基酸序
列，设计 1 对植物 RIP 通用简并引物 P1/P2，分别对
应 TCS 的第 89～96 及 215～222 位氨基酸序列，用于
RIPs 新基因的筛选。序列如下：
P1：5′-gt(agc) ac(gca) aa(gct) gt(cta) ta(tca) ItIatggg
-3′；
P2：5′-(cgt)gc (atc)a(atg) I(atc)(ga) Iat (tca)tg(atc)
ttggaIag-3′；其中“I”为次黄嘌呤。
1.2.1.2 望江南核糖体失活蛋白新基因片段的获得 以
CTAB 法抽提的望江南叶片的总 DNA 为模板，在
UNOⅡ型 PCR 扩增仪（Biometra 公司）上进行 PCR
扩增。其反应条件为：25 µl体系中，模板 50 ng，1×PCR
缓冲液，1 mmol·L-1 dNTPs，0.4～1 µmol·L-1 上、下游
引物，1 个单位 Ex Taq 酶。反应程序为：94℃预变性
2 min，94℃变性 30 s，50℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，
进行 35 个循环，然后 72 ℃延伸 10 min。将特异性扩
增片段回收，克隆于 pMD-18 T 载体上。
对候选克隆进行 PCR 和 EcoRⅠ与 HindⅢ双酶切
鉴定，筛选出阳性重组子，送往上海博亚生物技术有限
公司进行测序。
对测序结果利用 NCBI 的 BLAST 软件进行分析。
1.2.1.3 望江南核糖体失活蛋白新基因全长 cDNA
的获得 用 3′-Full RACE Core Set 和 5′-Full RACE
CoreSet 两个试剂盒进行望江南中核糖体失活蛋白新
2 期 阮小蕾等：望江南中核糖体失活蛋白新基因 CassinⅠ的克隆及特征分析 419
基因片段 3′端与 5′端序列的扩增，具体操作步骤参考
产品说明书。
Cassin 3′端引物设计：据已测序出的 Cassin 片段
的 5′端的第 19～42 位碱基来设计 3′端引物，对应保守
序列“MGYLVNST”的 8 个氨基酸。序列为：P6-7：5′-gc
tc taga atg ggc tat ctt gtc aat tca aca-3′
Cassin 5′端引物设计：按试剂盒说明书要求，合
成 5 条引物。序列如下：
反转录引物：PRT：5′-（P）ac ttt gcc tgcagc-3′
进行反向 PCR 时的两对引物：
Pa1：5′-gt aacg atgg tact acc ttt gaa ta-3′
PS1：5′-aac gag tct gat gct aaa cta gctt-3′
Pa2：5′-ttt gaa gcc ttt cgt aat tgccaga-3′
PS2：5′-ggg cta tct tgt caa ttc aac atcc-3′。
经过 PCR 扩增，将 3′与 5′端特异性扩增的条带分
别回收，克隆至 pMD-18 T 载体上。经 PCR 与 EcoR
Ⅰ和 HindⅢ酶切鉴定筛选出阳性重组子测序。测序结
果利用 NCBI 的 BLAST 进行分析。
将 5′端序列与 3′端序列进行拼接，去掉重叠部分,
在此基础上进行望江南中核糖体失活蛋白新基因全长
cDNA 的扩增。据完整拼接序列中起始密码子、终止
密码子的位置，设计特异引物。序列如下：
Pcassin1：5′-gtc aaa aag atg aac aga ttc-3′
Pcassin2：5′-tca gtg ttt tgt agg aat acc atc-3′。
提取望江南的总 RNA，用引物 Pcassin1、Pcassin2 按
常规方法进行 RT-PCR 反应。将出现的明亮的特异性
条带回收，克隆至 pMD-18 T 载体上。经过酶切鉴定，
筛选出阳性重组子测序。
1.2.1.4 全长 cDNA 的序列和特征分析 对测序结果
用NCBI的BLAST和ORF Finder进行分析；用DNAMAN
软件分析氨基酸序列；Signal PV2.0 程序预测信号肽
剪切位点；RPS-BLAST 程序分析氨基酸保守结构域。
2 结果与分析
2.1 望江南核糖体失活蛋白新基因片段的获得及序
列分析
采用 RIP 通用引物，在望江南基因组中通过 PCR
扩增 RIP 基因，能扩增出约 400 bp 的单一明亮条带，
回收并进行克隆。经 PCR 和酶切鉴定，获得了阳性重
组子。经测序，得到 392 bp 的扩增片段。BLAST 分
析表明，所得 DNA 片段为新的 RIP 基因片段，编码
130 个氨基酸。将之命名为：Cassin，GenBank 的登陆
号为：EF183468。
2.2 望江南核糖体失活蛋白新基因全长 cDNA 的获得
及核苷酸序列分析
采用 3′-Full RACE Core Set，对已知的 Cassin 片
段进行 3′端的扩增。经扩增，出现 1 条明亮的特异条
带，约有 850 bp（图 1-A），回收并进行克隆。经酶
切筛选出阳性重组子，经测序得到 848 个 bp 的扩增片
段。Blastn 分析表明，在序列 556 bp 处发现终止密码
子 tga；585～591 bp 处发现 poly A 转录终止信号
aataaa，其余序列为 3′端非翻译区。这表明 Cassin 基
因的 3′端序列已经获得。
采用 5′-Full RACE Core Set，对已知的 Cassin 片




1，3：DNA Maker DL 2 000；2：3′RACE 的扩增结果；4，5：5′RACE 的特异性扩增片段
1, 3: DNA Maker DL 2 000；2: 3′RACE products from Cassin；4, 5: 5′RACE products from Cassin

图 1 Cassin 的 3′（A）及 5′（B）端 RACE 扩增凝胶电泳分析
Fig. 1 Electrophoresis analysis of 3′ (A) and 5′ (B) RACE products from Cassin
3 4 5
bp
1000
750

1 2
bp
1000
750

A
420 中 国 农 业 科 学 41 卷
段进行 5′端的扩增。经过两轮 PCR，有明亮的特异性
条带出现，约为 850 bp（图 1-B）。进行回收并克隆。
经过酶切鉴定筛选出阳性重组质粒，经测序得到 850
bp 的扩增片段。于 105 bp 处发现起始密码子 atg，其
前端序列为 5’端非翻译区。这表明 Cassin 基因的 5′
端序列已经获得。将之与 3′端序列进行拼接，整合后
得到 Cassin 片段的完整 ORF 为 882 bp。在此基础上
进行全长 cDNA 的扩增。
提取望江南的总 RNA，用引物 Pcassin1、Pcassin2 按
常规方法进行 RT-PCR 反应。有明亮的特异性条带出
现，约为 900 bp（图 2）。将之回收并克隆。经过酶切
鉴定筛选出阳性重组子。经测序得到 882 bp 的特异片
段。ORF Finder 分析：整个序列编码 1 个完整的 ORF。
经 Blastn 分析，此片段的核苷酸序列与 GenBank 中的
β-Luffin的相似性最高（63.4%），与 Trichosanthin（TCS）
的相似性较低（38.1%），而与其它序列则没有显著的
相似性。这表明来源于望江南的这个 RIP 基因与现已
报道的 RIP 有较大的差异。将这个新克隆的 RIP 基因
的全长 cDNA 命名为 CassinⅠ，在 GenBank 的登陆号
为：EF183472。



1：DNA Maker DL 2 000；2：阴性对照的扩增结果；3：Cassin 全长 cDNA
序列的扩增结果
1: DNA Maker DL 2 000; 2: Negative control; 3: The full length cDNA
products of Cassin

图 2 Cassin 全长 cDNA 序列的 RT-PCR 扩增
Fig. 2 Electrophoresis analysis of the full length cDNA
sequence of Cassin

2.3 CassinⅠ的氨基酸序列分析及结构功能预测
DNA STAR 软件分析得知：CassinⅠ编码 293 个
氨基酸，其推测的分子量为 32.5 kD，等电点为 8.78。
蛋白组成为：强碱性氨基酸 Arg 和 Lys，占氨基酸总
数的 10.2%；酸性氨基酸 Asp 和 Glu，占氨基酸总数
的 8.9%；疏水氨基酸 Ala、Ile、Leu、Phe、Trp、Val，
占氨基酸总数的 39.6%；极性氨基酸 Asn、Cys、Gln、
Ser、Thr、Tyr，占氨基酸总数的 29.7%。
用 Signal PV2.0 程序对 CassinⅠ进行信号肽剪切
位点的预测，依据蛋白剪切规则，发现 CassinⅠ的信
号肽最有可能的剪切位点位于第 28 和 29 位氨基酸之
间（P=0.796）的 AR-EI 区域，这预示 CassinⅠ的信号
肽是前 28 个氨基酸。这与在 TCS 和 β-Luffin 的序列
中，信号肽分别位于前 23 和 18 个氨基酸区域的情况
有所不同。
用 RPS-BLAST 程序分析 CassinⅠ氨基酸的保守
结构域，结果发现了一个 RNA N-糖苷酶的保守区域，
由 88 个氨基酸组成。它与 TCS 氨基酸序列相应区段
的相似性达 73%。由此可推测CassinⅠ的多肽具有RIP
的保守结构。
2.4 CassinⅠ与其它 RIP 的氨基酸序列的比较
将 CassinⅠ推导的氨基酸序列进行 Blast X 分析。
发现它与 β-Luffin 的前体蛋白的相似性为 58.2%，而
与 α-TCS 的前体蛋白的相似性为 33.7%；与其它氨基
酸序列没有显著的相似性。Α-TCS、β-Luffin、CassinⅠ
的多重序列比对结果（图 3）显示：3 种蛋白质中共有
64 个氨基酸残基完全相同。TCS 成熟蛋白的 11 个 N-
糖苷酶活性位点的残基中，有 9 个（Tyr-93、Tyr-134、
Leu-150、Val-176、Glu-183、Arg-186、Leu-211、
Asn-213、Val-255）在 CassinⅠ的氨基酸序列中
（Tyr-118、Tyr-159、Leu-175、Val-201、Glu-209、
Arg-212、Leu-237、Asn-239、Val-281）是相同的，只
是残基位置不一致；仅仅有两个残基存在变化，分别
由 Ala-170、Gln-179（TCS）变为 ILE-196、Thr-204
（CassinⅠ）。而这 11 个残基在 β-Luffin 中则完全保
守。简并引物 P1/P2 的扩增区段分别对应 TCS、
β-Luffin 、CassinⅠ的第 89～222、88～220、114～248
号氨基酸的编码片段，对这 3 种蛋白质而言，所有的
N-糖苷酶活性位点都在此扩增区段内。将 3 种蛋白质
的信号肽序列进行比对，发现其中氨基酸残基的保守
性较差，只有 1 个完全相同的残基。
3 讨论
分离一种新型的RIP费时费力，而且植物体内RIP
的含量一般偏低，无法满足大规模应用的需要。因此，
直接分离 RIP 新基因具有重要意义。RACE 是一种以
2 期 阮小蕾等：望江南中核糖体失活蛋白新基因 CassinⅠ的克隆及特征分析 421

黑色部分表示单个氨基酸完全相同；灰色部分所示部分氨基酸完全相同；上划线为 P1 和 P2 简并引物所在位置
Regions of homology are shown in dark (identity) and gray (highly conservative exchanges). Degenerate primer pair are shown in black line region. This
alignment was generated using DNAMAN multiple alignment program

图 3 CassinⅠ与α-TCS、β-Luffin 的氨基酸多重序列比对
Fig. 3 Multiple alignment of CassinⅠ, α-TCS and β-Luffin

PCR 为基础快速分离 cDNA 的 3′末端和 5′末端的方
法，其优点在于快速、简便，仅知少量序列信息时即
可扩增得到全长 cDNA，多数情况下无需构建 cDNA
文库[13]。本研究采用反向遗传学的方法，通过分析多
种不同来源的植物 RIP 的氨基酸序列，根据其保守区
域设计一对植物通用简并引物 P1 和 P2，在苏木科的
药用植物望江南中进行扩增，首先分离出一个 RIP 基
因片段，通过 RACE 的方法，得到其全长 cDNA 序列
-CassinⅠ。这是首次在望江南中克隆和报道一种新的
RIP 基因。另外，利用这对简并引物，从芭蕉科
（Musaceae）、天南星科（Araceae）、茄科（Solanaceae）、
龙舌兰科（Agavaceae）、兰科（Orchidaceae）等植物
中均扩增得到了新的 RIP 片段（资料未显示），这些
片段为进一步克隆新的 RIP 基因奠定了基础。
RIP 具有的特异的 RNA N-糖苷酶活性，能水解核
糖体 RNA 3′端茎环结构的膘嘌呤残基而导致核糖体
失活，进而抑制蛋白合成。这种 N-糖苷酶的活性位点
的氨基酸残基在不同植物来源的 RIP 中是保守的，而
且其活性位点的区域，其序列间的同源性特别高[14]。
本研究克隆的 CassinⅠ序列中具有 9 个氨基酸残基与
TCS 成熟蛋白的 11 个 N-糖苷酶活性位点的残基完全
相同，只有 2 个发生了变化，这证明 CassinⅠ确实是
一种新的 RIP。而 TCS、β-Luffin、CassinⅠ序列中的
RIP 活性位点残基具有高保守性的发现也与 Wu 等[15]
报道的不同科属来源的 RIP 中至少有 8 个活性位点残
基完全相同的说法相一致。
简并引物 P1/P2 的扩增区段约编码成熟 RIP 一半
的氨基酸，是最为保守的部分，绝大部分的活性位点
都位于这一区域。林毅等[12]比对了葫芦科来源的 9 个
RIP 的 P1/P2 扩增区段,发现 9 个氨基酸片段中共有 43
个残基完全相同，包含所有的活性位点。其中 6 个残
基完全保守，其余残基高度同源。Lin 等[16]从麻疯树
（Jatropha curcas）中分离得到一种 RIP-curcin，序列
分析发现其中具有成熟 TCS 所有的活性位点残基，除
1 个有变化以外，其余的完全相同。这些活性位点残
基只有 2 个位于 P1/P2 扩增区段之外。本研究克隆的
CassinⅠ，其活性位点残基完全位于 P1/P2 扩增区段
之内。因此对 P1/P2 区段进行分析比较有助于更好的
了解 RIP 的结构和功能的关系以及分子进化，也为在
其他生物中克隆新的 RIP 基因提供很好的思路。
RIP 基因在植物抗病基因工程中具有良好应用前
景[17]。Ⅰ型 RIP 具有一定的抗病毒活性，它是构建抗
病毒转基因植物和单链免疫毒素的重要基因资源。
Lodge 等[18]报道转 RIP 基因植株显示出对病毒侵染具
广谱抗性。Jack 等[19] 报道了大麦Ⅰ型 RIP 单基因转化
烟草，其转基因植株对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）
422 中 国 农 业 科 学 41 卷
等真菌病原体具有一定的抗性。当 RIP 与真菌细胞壁
水解酶如几丁质酶、β-1，3 葡聚糖酶等协同作用时，
其抗真菌效果则极为显著[20]。
下一步的工作中，要开展以下几方面研究：将
CassinⅠ进行原核表达，纯化其表达产物进行抑菌实
验，确实证明 CassinⅠ的抗菌功能；将 CassinⅠ构建
植物表达载体，转入植物，接种不同的病原真菌、细
菌、病毒等，还可以接种有关的有害昆虫，分析其抗
病、抗虫谱，探讨 CassinⅠ在植物保护中更广泛的应
用前景。以上研究将对探索 RIP 的抗病机理和丰富抗
病基因资源将大有帮助。
4 结论
RIP 是一类能抑制蛋白质生物合成的蛋白质，被
广泛的应用于植物抗病抗虫、基因工程中，已经从高
等植物中克隆得到了多个 RIP 基因。本研究采用反向
遗传学的方法，在药用植物望江南中克隆得到一个新
的 RIP 基因。本工作的完成，为进一步将之应用于作
物抗病虫害育种等研究奠定了基础。

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（责任编辑 赵利辉，毕京翠）