全 文 ：中国蜂业 APICULTURE OF CHINA 2012年 11月上 第 63卷
1 引言
牧豆树是干旱地带的一种十分重要的植物，它不
但能在干旱季节表现出超强固氮能力，而且还是许多
动物的庇护所和食物来源，这些动物以牧豆树的花蜜、
花粉、树叶以及水果为食。牧豆树是四、五月份墨西哥
杜兰戈州干旱、半干旱地带蜜蜂的唯一花蜜和花粉来
源。当地蜂农在这一时期收获的蜂蜜风味一致，均为牧
豆树蜂蜜，同样这两个月蜜蜂采集的花粉为纯牧豆树
花粉。
牧豆树是具有生物学特性的天然产品的一个重要
来源。对牧豆树花粉乙醇提取物体外抗氧化力的评价
表明，该花粉具有较强的自由基清除能力，自由基清除
力与其酚类物质的组成有关。花粉中的酚类化合物主
要包括黄酮苷和羟基肉桂酸，不同种类花粉的酚类化
合物的组成有所不同，并与花粉的药理特性（抑菌、抗
肿瘤、止泻、抗氧化）有一定的关系。
众所周知，化学抗氧化性或体外生物抗氧化性的
评价并不能代表真正的体内活动。本文的目的在于通
过体外实验和体内实验研究牧豆树蜂花粉酚类物质组
成与其抗氧化能力的关系，即在体外体系中将牧豆树
蜂花粉酚类提取物作为小鼠肝微粒体脂质过氧化的抑
制剂；在体内体系（即溴苯诱导的小鼠肝损伤模型肝匀
浆）运用硫代巴比妥酸法（TBARS）对抗氧化能力进行
定量分析。同时对体内和体外两种系统下得到的结果
进行比较。
2 材料与方法
2.1 花粉样品
实验所用的三种牧豆树蜂花粉由当地养蜂人专
供。这些样品可作为 2002年 4月墨西哥杜兰戈州圣胡
安德尔里奥采集到的蜂花粉的代表。从牧豆树花药采
得的花粉取自蜂房周围的牧豆树。凭证标本保存在
CIIDIR 的植物标本室，并经植物标本室的植物学家
Socorro Gonzalez鉴定。
2.2 显微镜检测
采用显微镜分别检测 15份蜂花粉样品的花粉颗
粒以及 5份采自花药的花粉样品的花粉颗粒，以确定
花粉植物来源和均一性。花粉样品都预先经乙酸水解。
实验使用 Olympus BX 40显微镜。
2.3 HPLC/DAD分析
采用高效液相色谱（二极管阵列检测器）直接比较
蜂花粉和采自花药的花粉的酚类物质分布情况，确定
黄酮醇或酚酸的组成以及其植物来源，这一方法已有
人提出过，蜂花粉用含水乙醇（50%，v/v，1 ml）超声提取
60 min，得到的浑浊液离心 10 min，取上层清液做
HPLC/DAD分析。采用 Gylson 305 HPLC 系统进行分
析，进样量 20 μl，Gylson 170 紫外检测器；Waters
Spherisorb S50D52（5 μm）色谱柱；乙腈-水体系（含酸）
梯度洗脱；340 nm 绘制谱图。220~400 nm 范围内用
DAD检测所有峰的光谱数据，采自花药的花粉样品按
相同方法进行分析。根据 Campos and Markham（2006）
的方法进行结构识别。
2.4 提取
按照 2.2确定花粉粒的均一性以后，按 2.3进行提
取并检测蜂花粉的酚类组成及植物来源。20 g花粉加
入 200 ml 50%含水乙醇（v/v）超声提取 5 次，每次 60
min，提取液离心 10 min。合并所有上清液减压蒸发至
干即得到总提物。总提物用 10 ml 50%含水乙醇溶解，
等分分装，分别用于黄酮醇含量的检测及抗氧化能力
评估。
2.5 总提物中黄酮醇含量的确定
分别在不同浓度标品和样品中添加氯化铝，在 425
nm波长下对每个试样进行三次吸光值的测定，以样品
浓度（μl/ml）或标品浓度（μg/ml）对吸光值作图进行线
性回归，通过对槲皮素标准曲线进行线性回归分析来
牧豆树蜂花粉中酚类物质抗氧化能力的研究
摘 要：本文分别评价了牧豆树蜂花粉（产地：墨西哥杜兰戈州）酚类提取物体内和体外的抗氧化能力。在体外
体系中，将牧豆树蜂花粉的酚类提取物作为小鼠肝微粒体脂质过氧化的抑制剂；体内体系（即溴苯诱导的小鼠肝损
伤模型肝匀浆）中运用硫代巴比妥酸法（TBARS）对抗氧化能力进行定量分析；同时还对体内和体外两种体系下得
到的结果进行了比较。结果表明，牧豆树蜂花粉是天然抗氧化剂黄酮类化合物的一个重要来源，在体外和体内体系
中，牧豆树蜂花粉的抗氧化能力均与黄酮醇的浓度有关，但在体内体系中表现出的抗氧化能力稍低。在体内未诱导
氧化应激时，高浓度的黄酮醇能促进氧化反应的进行。
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确定黄酮醇的含量，在 1~50 μg/ml范围内槲皮素标准
溶液的浓度与吸光值（425 nm）呈良好的线性关系，线
性回归方程为 Abs425 nm=-0.00221+0.054899（槲皮素），
相关系数 r= 0.9973；在 1~400 μl/ml（溶于 50%乙醇）范
围内样品浓度与吸光值线性回归的相关系数 r 为
0.9989。花粉中含有较多黄酮醇，其含量以 μg槲皮素/
ml为单位。添加氯化铝后，黄酮醇产生包括邻位二羟基
在内的波长红移，代表标准过程的重现。
2.6 对小鼠肝微粒体脂质过氧化作用的抑制作用
采用硫代巴比妥酸法（TBARS）定量分析样品对小
鼠微粒体脂质过氧化的抑制作用，分析方法在 Ohk awa
等（1979）和 Uchiy ama，Mihara（1978）的基础上进行了
改进。硫代巴比妥酸反应物的生成量反映了丙二醛
（MDA）的含量（μg/L）。
选取 CFI小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏用冷生理盐
水漂洗后添加 1.15%的冷 KCl研磨得到浓度为 10%的
肝匀浆。微粒体制备参照 Diczfalusy等（1996）的方法。
微粒体蛋白分析采用 Lowry的方法。反应体系如下：
100 μl微粒体上清液（86 μg蛋白质/ml）、待测样品的
不同等分试样（0~100 μl）、50μl FeSO4和抗坏血酸的混
合水溶液（含 FeSO4 6.95 mg，抗坏血酸 17.62 mg）、添加
Tris-HCl缓冲液（10 mM，pH 7.4）至 500 μl，置具塞试
管内于 37℃下孵育 30 min，水冷却，每管中加入 3 ml
1%的磷酸和 1 ml 0.6%的硫代巴比妥酸，沸水浴加热
45 min，冷却后，加入 4 ml 正丁醇充分混匀，离心 10
min分离醇相，然后在 535 nm和 520 nm波长下测定其
吸光值，根据 MDA在两个波长下测得的吸光的差异来
评价硫代巴比妥酸反应物的浓度，选取 4个浓度对参
照物（槲皮素、槲皮苷和咖啡酸）进行测定。脂质过氧化
反应抑制能力的大小以 IC50值衡量（即抑制半数 MDA
生成所需要的抗氧化剂浓度，单位 μg/ml），IC50值通过
MDA浓度与样品黄酮醇浓度的线性回归曲线来计算。
每个待测物的等分试样分别做三个平行分析。
2.7 抑制溴苯诱导小鼠模型的脂质过氧化反应
诱导小鼠中毒参照 Zhang和 Shen（1997）的方法。
80只雄性 CFI小鼠（墨西哥 Nacional de Virologia研究
中心）随机分成 8组：一组作为实验对照组用食用油喂
食；一组用 200 μl牧豆树蜂花粉提取物喂食（黄酮醇浓
度 C1=9.794 μg/ml）；一组用 200 μl牧豆树蜂花粉提取
物喂食（黄酮醇浓度 C2=21.751 μg/ml）；一组用 200 μl
维生素 E喂食（400UI）；一组以溴苯（200 μl，溴苯
94.211 μg/ml食用油）诱导中毒；另外三组分别用维生
素 E（400UI）、C1或 C2浓度的蜂花粉提取物喂食后再
用溴苯致毒（200μl，溴苯 94.211μg/ml食用油）。小鼠饥
饿一宿后喂食抗氧化剂，30~60 min后溴苯致毒。
19~22 h后小鼠颈椎脱臼处死，取小鼠的整个肝脏
分别用冷生理盐水漂洗，用 1.15%的 KCl 匀浆制成
10%的匀浆液。取 500 μl的匀浆液采用硫代巴比妥酸
法（TBARS）进行分析，方法参照 2.6。用维生素 E作为
对照，以确定蜂花粉提取物的相对抗氧化率。每个匀浆
液样品做三组平行分析。
2.8 数据分析
数据采用方差分析法分析（P≤0.05），均值经邓肯
多重比较检验分析，结果由 CASTAT计算机程序处理。
3. 结果和讨论
3.1显微镜检测
显微镜检测显示蜂花粉粒在较大的程度上表现出
均一性状，这一结果肯定了 Campos 等（1997）和 Al－
maraz-Abarca 等（2004）的研究结果，即组成花粉的花
粉粒大都来自同一品种。蜂花粉的花粉粒以及采自花
药的花粉粒的镜检直接比较结果显示蜂花粉均来自牧
豆树。
3.2 HPLC/DAD分析结果
有文献报道可通过直接比较蜂花粉与花药花粉的
酚类物质 HPLC/DAD分布情况来确认蜂花粉的植物来
源。本文研究发现，蜂花粉的酚类物质分布与采自牧豆
树花药花粉的酚类物质分布是一致的。在本实验所采
用的液相分析条件下，只检测到了黄酮类化合物和肉
桂酸衍生物。
表 1 牧豆树花粉中的酚类成分（与墨西哥杜兰戈州采集的
牧豆树蜂花粉中酚类成分一致）
主要酚类物质 保留时间
芹菜素衍生物-7-O-R（黄酮） 31.00
芹菜素衍生物-7-O-R（黄酮） 32.00
芹菜素衍生物-7-O-R（黄酮） 33.00
木犀草素衍生物（黄酮） 35.00
黄酮醇苷 36.70
槲皮素-3-葡萄糖苷（黄酮醇） 37.00
金雀异黄酮苷（大豆异黄酮）或二氢槲皮素 38.68
异鼠李素-3-O-R（黄酮醇） 39.55
异鼠李素-3-O-R（黄酮醇） 40.78
查尔酮 41.89
异鼠李素-3-O-R（黄酮醇） 42.63
肉桂酸衍生物 53.04
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牧豆树花粉中含有黄酮苷，特别是芹菜素、槲皮素
和异鼠李素的衍生物，还可能含有木犀草素和染料木
黄酮，这些化合物都具有广谱的生物活性。
3.3 体外实验：预防肝微粒体脂质过氧化反应
实验根据牧豆树蜂花粉乙醇提取物在硫代巴比妥
酸实验中对微粒体系统脂质过氧化反应的抑制能力来
评价其抗氧化能力。测得的提取物及参照物（槲皮素、
槲皮苷和咖啡酸）的 IC50值见表 2。
在该实验条件下，蜂花粉提取物有效的抑制了脂
质过氧化反应，其抗氧化能力高于参照物，甚至高于槲
皮素的抗氧化力。Terao（1999）和 Okuda（1999）的实验
证明槲皮素是一种对抗脂质过氧化的有效抗氧化剂。
每个种属特有的黄酮和酚酸的组成及含量对确定
不同种属来源花粉的抗氧化能力有决定性的作用。有
酚羟基的化合物在体外表现出很好的抗氧化能力，在
B环的 3和 4位置上有二羟基结构的黄酮类化合物
抗氧化能力尤为突出。牧豆树花粉中的木犀草素和槲
皮素衍生物是具有该结构的黄酮类化合物。将牧豆树
蜂花粉与绿穗苋花粉、混合蜂花粉（由墨西哥杜兰戈州
的六种单一品种花粉混合而成）比较，在基本相同的实
验条件下它们在体外生物系统中的脂质抗氧化能力不
相上下，而这些花粉中黄酮类化合物的组成各不相同。
可见，不同种属来源以及不同黄酮组成的花粉也可能
表现出类似的抗氧化能力。牧豆树花粉、绿穗苋花粉和
混合蜂花粉的抗氧化力均高于以下植物花粉：Rannun－
culus petiolaris（IC50= 0.52 μg/ml）、万寿菊（IC50= 2.6 μg/
ml）、Bidens odorata（IC50= 3.6 μg/ml）、Solanum rostratum
（IC50= 5.9 μg/ml）和 Zea mays（IC50=16.2 μg/ml），而根据
Almaraz-Abarca et al.（2004）报道的 IC50值，这些植物
花粉的抗氧化力在蜂产品领域均极具代表性。
3.4 体内实验：预防溴苯诱导的小鼠肝损伤
在本研究中，我们通过测定硫代巴比妥酸反应物
的含量来衡量溴苯诱导致毒小鼠的肝损伤程度；在小
鼠致毒前以牧豆树花粉黄酮醇提取物喂食，评价两个
不同浓度提取物对溴苯诱导致毒小鼠的保护作用。结
果见表 3。
黄酮醇浓度为 C2（21.751 μg/ml）的总提物由于其
自身的氧化性，使得它与实验浓度的溴苯一样对小鼠
的肝脏具有致毒作用，分别产生了浓度为 0.225 μg/ml
和 0.202 μg/ml的 MDA，而以总黄酮浓度为 C1（9.794
μg/ml）的总提物喂食的实验组小鼠产生的 MDA 值
（0.0107 μg/ml）低于实验对照组。这两个实验结果表
明，在未诱导氧化应激时，高浓度的牧豆树花粉黄酮醇
提取物对机体有害，因为它自身就是能一种能诱导肝
损伤以及产生大量 MDA的氧化剂。已有文献报道多酚
在某些特殊条件下对氧化反应有促进作用，如给以瞬
间高浓度金属离子的刺激能诱使多酚促氧化。还有一
些其他的氧化剂如抗坏血酸在体内和体外系统有铁离
子存在时也能作为助氧化剂。1978年 Chen 和 Chang
发现几内亚猪肉中增添的抗坏血酸具有助氧化作用。
对这一现象的解释为：当生物分子中的铁结合不紧密
时抗坏血酸能促进生物分子（很可能是铁蛋白）中铁的
释放。而牧豆树花粉总提物中高浓度黄酮类物质（也有
可能是其他成分）的体内助氧化作用的机理还有待考
察。在该体系中，可能存在一些其他因素对黄酮类化合
物清除自由基有影响。
根据 Rice-Evans的研究，酚类成分对氧化反应的
抑制作用可能与这些化合物能够直接清除脂氧自由基
表 2 牧豆树蜂花粉乙醇提取物及参照物的 IC50值
样品 IC50（μg/ml）
槲皮苷 0.39±0.05
槲皮素 0.22±0.01
咖啡酸 0.17±0.01
提取物 0.07±0.002
表 3 样品对溴苯诱导致毒小鼠肝脏的保护作用
处理方式 TBARS（μg/mg肝脏）
牧豆树蜂花粉提取物，黄酮醇浓度为 21.751 μg/ml 0.2251±0.0566a
溴苯诱导致毒 0.2021±0.0397a
溴苯诱导致毒并用黄酮醇浓度为 9.794 μg/ml的牧豆树蜂花粉进行预处理 0.1629±0.05892bc
溴苯诱导致毒并用黄酮醇浓度为为 21.751 μg/ml的牧豆树蜂花粉进行预处理 0.1373±0.0653c
维生素 0.0091±0.0017d
对照组 0.1295±0.0641c
牧豆树蜂花粉提取物，黄酮醇浓度为 9.794 μg/ml 0.0107±0.0017d
溴苯诱导致毒并用维生素 E进行预处理 0.0241±0.0022d
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（上接第 49页）
和过氧自由基有关。高浓度的牧豆树花粉黄酮提取物
自身引起的助氧化作用与黄酮提取物在溴苯致毒模型
中的抗氧化作用具有显著差异，这一差异表现在：在第
二组实验（即抗氧化作用显著的实验组）中黄酮类化合
物把氢传递给脂氧自由基和过氧自由基更具优势，所
以黄酮类化合物起抗氧化作用而非助氧化作用。
在体内实验中，所有的牧豆树蜂花粉提取物（黄酮
醇浓度分别为 21.751和 9.794 μg/ml）都对溴苯引起的
脂质过氧化反应表现出了抗氧化作用。低浓度黄酮醇
的提取物使脂质氧化减少了 19.4%；高浓度黄酮醇的提
取物使脂质氧化减少了 32.1%。结果表明，牧豆树蜂花
粉提取物中黄酮醇的浓度与其抗氧化能力具有一定的
关系。但是，所有提取物在体内的抗氧化力都比维生素
E要低（维生素 E为 88.08%），可能是因为槲皮素对链
式脂质过氧化自由基的清除率显著低于维生素 E，且
花粉提取物的各成分间也并未表现出协同效应。我们
的实验结果不同于 Zhang和 Shen（1997）报道的茶多酚
与维生素 E 在体内具有相同的脂质过氧化反应抑制
力。
由于未进行更深入的研究，目前也还没有关于花
粉提取物体内抗氧化力的其他数据，所以未对不同种
属来源的花粉的抗氧化力进行比较。但基于我们使用
相同的 MDA-TBA的方法对牧豆树花粉提取物脂质氧
化抑制力的评价，可以比较这一种属花粉体外生物系
统和体内系统的抗氧化力的差异。研究表明，在体外系
统中牧豆树蜂花粉提取物脂质过氧化反应抑制力为
0.07 μg/ml（以 IC50值表示）。即在无氧化剂存在的情况
下，每降低 50%的 MDA的生成需要牧豆树花粉的黄酮
醇浓度为 0.07 μg/ml，而体内系统中黄酮醇浓度为
21.751 μg/ml的提取物仅能降低 32%的 MDA生成量。
4 结论
牧豆树蜂花粉的乙醇总提物作为体内脂质过氧化
反应的抑制剂具有显著作用，可以视为氧化应激的外
源性防卫，尽管其活力低于维生素 E，同样也低于其在
体外肝微粒体生物系统中表现出来的活力。牧豆树花
粉酚类化合物组成独特，是一种重要的天然抗氧化剂
来源。从黄酮醇浓度和抗氧化力的关系可以看出，牧豆
树蜂花粉中的黄酮醇类化合物对其抗氧化力有一定影
响。体外生物系统中抗氧化能力并不代表真实的体内
活动，所以对体内抗氧化活动做更进一步的研究非常
有必要。在未诱导氧化应激的情况下，高浓度黄酮醇的
牧豆树蜂花粉提取物可以视为体内氧化剂。
孙丽萍 彭定利 译
化。Robinson和 Page（1988）研究显示基因型会影响蜜
蜂是否成为守卫蜂。Breed等（1990）发现守卫蜂和响应
蜂是两组行为不同的蜜蜂，守卫行为是抵御其他无脊
椎动物抢夺蜂群而进化出的行为机制，而响应蜂的蜇
刺行为是抵御掠夺进化而来的。Breed和 Rogers（1991）
使用高防御行为和低防御行为的蜂群进行研究，发现
防御行为的表达受蜂群基因型和外界环境的影响。高
防御蜂群防卫蜂防卫的时间更长。
Arechavaleta Velasco和 Hunt（2003）研究高防御蜜
蜂与温驯蜜蜂回交的蜂群中防卫蜂的基因型差异，发
现不同回交类型的蜜蜂行使防卫行为的平均时间没有
差异。不同回交类型及不同蜂群的守卫时间超过一天
和至少超过两天的蜜蜂数量有差别。不同蜂群的这两
个变量的差异部分是由于遗传因素。蜇刺实验中进行
蜇刺的蜜蜂一小部分是守卫蜂，守卫蜂中只有一小部
分进行蜇刺。蜇刺数与守卫蜂数量及守卫蜂中进行蜇
刺的守卫蜂的比例成正相关。移走蜂群中的守卫蜂，蜂
群的蜇刺量减少。
守卫蜂在巢门口区分同巢蜂时的接受临界值会适
应性地改变，比如当来自其他蜂群的入侵蜂数量增加
时，临界值会更加严格。这种适应性的改变会在数分钟
内发生。Couvillon等（2010）研究这种快速转变背后的
机制。他们推测，守卫蜂释放的报警激素可能引起接受
临界值的提高。在一项行为学实验中使用了乙酸异戊
酯及 2-庚酮，没有发现它们的作用。与戊烷对照组相比
（同巢蜂接受 98%，非同巢蜂接受 32%），信息素处理没
有使守卫蜂对同巢蜂（平均接受 91%）或非同巢蜂（平
均接受 30%）的接受发生变化。
Chapman等（2009）检测了无王群与有王群对非同
巢蜂的识别力。结果显示，无王群接受的来自有王群的
非同巢蜂比同巢蜂明显更少。而有王群对两种蜜蜂的
接受无明显差异。一旦无王群中的产卵工蜂比较活跃，
这种趋势还会延续。所以，无王群对潜在的具繁殖力的
工蜂的识别能力比有王群更好。研究还发现，有王群接
受更多的来自有王群的非同巢蜂（卵巢没发育），而接
受的来自无王群的非同巢蜂（很多有发育的卵巢）较
少。而无王群没有这种差别。
丁桂玲 译
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