全 文 ：生物化学与生物物理进展 1 9的 年 第 1 6卷 第 5期、 . _
国产兵豆中凝集素的分离纯化与生化特性的研究
余 健 黄晓春 何晓松 戴美红 朱秋林
(江苏省肿瘤防治研究所肿瘤生化室 , 南京 )
提 要
从 国产兵豆中用荀聚糖凝胶柱层析法分离出一种对人红细胞有凝集作 用 的 凝
集素 , 当其浓度为 5一 7那解m l 时即可 引起血凝 。 通过电泳分析 , 分子量 、 氛基酸组
成 、 糖与金属离子含量 的刚定 。 对其纯度进行 了鉴定。 比较 了 5 种糖对此种凝集素
血凝的抑制作用 , 结 果以 甲基 。 一 D 一甘露糖普抑制能力最强 , D 一半乳糖无抑制作 用。
在交叉亲和免疚电泳中 , 此种凝集素能衬 多数原发性肝癌患者血清 甲胎蛋白糖基有
较强 的结合作用 。
兵豆种子含的凝集素 , 即通称的扁豆凝集
素 ( L e n ti l L e c t i n , 简称 L c A ) , 由于它能特异
性地与某些糖基相结合 , 是研究细胞表面糖分
子结构与功能的常用凝集素之一 。 近年来发现
其对人血清中不同病理状态下出现的甲胎蛋白
( A F P ) 糖基有不同的亲和能力 , 遂成 为 研 究
A F P 糖基结构的一种重要试剂山 。 70 年代以
来 , 关于 L c A 的分离纯化 工恨陆续 有所报
道。 一 5J , 由于兵豆产地不一 , 其理化性质也往往
有一定差别 。 目前有关利用国内资源制备 L c A
的工作 , 尚不多见 , 故本文研究用国产兵豆种子
制备的此种凝集素的特性 , 并观察其用于鉴别
A F P 变异体的作用 。
一 、 凝集素的提取
本文采用的兵豆种子 , 经江苏省植物研究
所鉴定为 L 。。 `耐 f、 , 行 M e dt’ co 兵豆为 一
年生草本 , 莱果短而扁 ,种子小 ,一或二粒 , 多为
浅绿色 , 凸透镜状 , 故俗称扁豆 。 提取时先将磨
碎之豆粉于 5 倍体积的 0 . 巧 m ol /L N aC I 溶液
中抽提 , 滤去沉渣 。 滤液经高速低温离心 ,得橙
黄色上清液 ,再以 0 . 3一 0 . 6 饱和度硫酸按盐析 ,
过葡聚糖 ( S e P h a d e x G 10 0 , p h a : 。 a e i a ) 凝胶
柱 , 用瑞典 L K B 液相层析系统自动程序控制
与监测 。 先以 0 . 巧 m ol 了L N a CI 溶液充分洗脱 ,
吸附之凝集素用含 o . l m ol / L D 一葡萄糖之盐溶
液洗脱 , 收集有紫外吸收之蛋白峰 (即 L c A ) ,
经透析 、浓缩 、 低温保存。 此时制得之 L c A 再
过叛 甲基纤维素 ( C M e e l l 。 10 5。 , w h 。 tm a n , e
5 2 ) 柱 , 用含梯度浓度 N a c l ( 0 . 0 7 5一 o . 1 5m 。 l /
L ) 之醋酸钠缓冲液 ( 。 . 02 m ol /L , pH S . 0) 缓
缓洗脱 , 可得两个紫外吸收峰 , 即同工凝集素
( i
s o l e e it 。 ) 之峰。
.1 凝集紊血凝活力与糖抑制作用的测 定 L习
健康人新鲜红细胞用磷酸缓冲 液 ( 0 . 0 10 01 /
L , p H 6
,
s)
一生理盐水 ( P B s) 洗涤 3 次 , 配成
2多 的悬浮液备用。 L c A ( 0 . 1多) 溶液经 2 倍
连续稀释成不同 浓度 , 取 50 沁加于血凝 板 v 形
孔内 , 再加等量之红细胞悬液混匀 。 30 分钟后
观察红细胞凝集结果 。 糖抑制 作用测定方法基
本同上 , 将最低血凝 斗倍浓度的 L c A 溶液 50 川
同上法加入血凝板孔内 , 再在各孔内分别加人
等量之不同浓度的糖溶液 , 混匀 , , 分钟后加入
红细胞悬液 , 观察出现凝集时的最低糖浓度。
2
. 聚丙烯酸胺凝胶电泳与分子量测定 聚
丙烯酞胺凝胶电泳 ,按 D va is 法 ,垂直平板。 分
口洛。日 T .0绍姐攘自
l
日口00囚叫
12 0 16 0
L oA 用葡聚糖 G 1 0。 凝胶柱层析的洗脱图型
八
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口 /I。三ó一O吐么
离胶 T~7关 , C ~ .2 6关 : 浓缩胶 丁 一 .3 5多 ,
C ~ 2 0务 . 样品量 : L c A S一 12 产 g /孔 , L c A -
A 与 L c A 一 B 为 5拜g /孔 。 电压 130 V , 电泳 , 小
时 。 考马斯蓝染色 。 分子量测定用 S D S一聚丙
烯酞胺凝胶电泳法 , 采用中科院上海生化所东
风试剂厂生产的低分子量标准蛋白质 , 分子量
范围 1 7 , 0 0一 9 4 0 0 0 , 按原说明书要求操作。 主
要试剂 : 丙烯酸胺 ( E . M e r e k ) , B i s (A l d r i e h ) ,
T M E D A ( B D H )
, S D s ( S
e r v a
)
, 其余均为国产
试剂 。
.3 氨基酸组成分析 样品经 6 m ol / L H CI
在 1 10 ℃ 下水解 2 小时 , 用 “ 日立 ” 8 3 5一 5 0型
高速氨基酸分析仪测定除色氨酸之外的各种氨
基酸 。
4
. 糖与金属含量乏测定 糖的测定依 D -u
b说 s 等之苯酚一硫酸法 `6] 。 金属离子系用 J . .A
A t o m c o m p M a r k 111
,
1 10 0 真空型 , 6 3 通道等
离子体发射光谱仪测定 , 配用 P D lP l /2 3 计算
机。 L c A 事先经过如下处理 : 称取 10 m g 冻
干样品 , 于聚四氟乙烯柑塌中 , 加 l m l 浓硝酸
浸泡过夜 , 然后加热至样品澄清 , 加 4 滴高氯酸
蒸发至近干 , 再加 10 1硝酸和 2 滴高氯酸 , 蒸
发至近干 , 用 7务 盐酸提取 , 移人比色杯中 , 最
后用 7外盐酸定容至 5m l , 即可上机测定 。
5
.
A F P 交叉免疫亲和电泳 ( C IA E ) 按
B价g一 H二l se n 法叨 ,先将 L c A 溶于 1外 琼脂糖
凝胶中 ( L c A 0 . 3 m g /m l 凝胶 ) , 在玻板一侧浇
制凝胶块 , 在近阴极端开一加样槽 , 加人含 A F P
的血清标本适量 (一般为 3一 3 0川 , 视 A F P 浓
度而定 ) , 在 L K B 多用电泳仪 ( M lu t i P h o r e )上
进行第一向电泳 , 然后在玻板之空余部分铺满
含 A F P 抗体的凝胶 (抗体量须与 A F P 量相匹
配 ) ,使之与 已电泳之凝胶连接 , 即可进行第二
向电泳 , 温度控制在 10 ℃ 左右 。 电泳后用盐水
漂洗 , 压干 、染色 ,计算 L c A 结合型 A F P 与不
结合型沉淀峰面积之比 。
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图 2 L c A 混合物 ( M )在搔 甲基纤维素柱上用 氯
化钠梯度浓度缓 冲液 洗 脱 L c A一 A ( A ) 与 L。 A一 B
( B ) 同工凝集素
二 、 结 果 与讨 论
’ 本文制备 L c A的过程主要是先经 0 .巧 m ol /
L N aC I抽提 , 用硫酸镶分级沉淀 , 除去大量杂
一
3 9 0
-
蛋白 ,再利用凝集素与糖的亲和性 , 使其吸附在
葡聚糖凝胶上 , 经 D 一葡萄糖溶液洗脱后即可获
得有较高凝集活力的 L c A (图 l) 。 其消光系
数在波长 2 8 On m 时 , E }护 为 · 12 . , 。 此时制得
的 L c A 实际上是一种含两种同工凝集素的混
合物 ( L c A一 M )。 再通过阳离子交换剂柱层析 ,
经含 N a CI 梯度浓度的缓冲液洗脱 , 在较窄的
浓度变化范 围 内 ( N a C I 0 . 1 1一 o . 1 5 m o r / L ) 即
可使 L c A 一 M 分离为同工 凝 集 素 A ( L c A 一 A )
与同工凝集素 B ( L c A一 B ) (图 2 ) 。 这两种同工
凝集素的量是不均等的 , L c A一 A 较 L ` A 一 B 之
量为多 , 两者之比约 , l :l . 8 。 不同品种的兵豆 ,
一般均含有二种同工凝集素 , 但两者之量常因
地区而异 , 有以 L c A 一 B 为主者 , 亦有两者之量
相等者 8[] 。 我们曾将本实验中所获之同工凝集
98,
.
64352
甲。一x犷昌
素 L c A一 A与、 L c A 一 B 的主要特性作一比较 , 如
下文所述 , 除在电泳 行为上不同外 , 消光系数 、
糖抑制作用与血凝活性均相同 。
1
。 纯度鉴定 ( l) 电泳 L c A 一M , L c A 一 A
与 L c A 一 B 经聚丙烯酞胺凝胶电泳后 , L c A 一 M
在近 阴极端出现深浅不同的二条蛋白区带 (即
两种同工凝集素 ) , L c A 一 A 迁移快且 染 色深 。
而纯化后之 L o A 一 A 与 L 。 A 一 B 在分别电汾如寸,
均仅出现单一区带 , 不同的是两者迁移速度不
同 , L c A 一 A快于 L c A 一 B , 其迁移率 ( R f) 相应
为 0 . 20 与 0 . 12 5 , 与 L c A一 M 一深一浅的 蛋 白
区带相对应 , 如图 3 所示 。 同时也说明同工凝
集素之间含量的差别 , 与柱层析分离所得的结
果一致 。
相对迁移率
图 4 用 S D S 一聚丙烯酸胺凝胶电泳法测定
L . A 分子盆
1
. 磷酸化酶 ( 9 4. 0 0) 2 .牛血清白蛋白 ( 6 7 0 0 0)
3
·肌动蛋白 ( 43 0 0 0) 怪. 碳酸醉酶 ( 3 0 0 0 0)
,
、烟草花叶病毒外壳蛋白 ( 17 , 。 0)
父 : L c A 肤链
凝胶电泳等法测定 , 虽不完全一致 , 但基本土在
一定范围之内 : 4 2 o Qo一 63 0 0 0 。
( 3 ) 氨基酸组成 本实验分析结 果 表 明 ,
在 L cA 一 M 中 (除色氨酸未测外 ) 含 巧 种氨基
酸 , 其中以天冬氨酸 、 苏氨酸 、 撷氨酸含量较多 ,
约 占氨基酸分子总量的 34 务 。 不含眺氨酸 一与
蛋氨酸 , 如下表所示 。 本文虽未对同工凝集素
氨基酸组成进行分析 , 但 据 H o w二 dz[ 」 报 告
L o A 的氨基酸组成
图 3 L e A 聚丙烯酸胺凝胶电泳图型
!
。
L c A
`
A , 2
。
L c A
一
B , 3
.
L c A 混合物 s( 拌g ),
.4 L c A 混合物 ( 12 拜 g ) , 5 . 粗提 L c A
氨基酸* g /一0 0 9 m 0 1/斗8 0 0 09 L c A
刻一…( 2 ) 分子量 以 s D s 一聚丙烯酸胺凝胶平板电泳测其分子量 。 分子量标准为 : 磷酸化酶B ( 9 4 0 0 0 ) , 牛血清白蛋白 ( 6 7 0 0 0 ) , 肌动蛋白( 4 3 0 0 0 ) , 碳酸醉酶 ( 3 0 0 0 0 ) , 烟草花叶病毒外壳蛋白( 1 7 5 0 0 ) 。 结果无论 L c A 一M 或 L c A 一 A 、cIJ A一 B 均在相同位置出现二区带 , 分子量约为70 0 与 17 0 。。 , 此即 L c A 亚基之 a 链与 口链 。因 L c A 系由两亚基组成的二聚体结构 , 故其完整分子之分子量为 4 8 0 0 (图 4 ) 。
L c A 之分子量据各家报道。 一气无论用沉降
系数法 , iB ol ge l P 10 凝胶过滤 以 及 s D s -
天冬氨酸
苏 氨 酸
丝 氨 酸
谷 氨 酸
脯 氨 酸
甘 氨 酸
丙 氨 酸
撷 氨 酸
异亮氨酸
亮 氨 酸
酪 氨 酸
苯丙氨酸
赖 氨 酸
组 氨 酸
精 氨 酸
1 2
。
85
1 1
。
3 5
6 9 8
8
.
6 3
3
。
4 1
4
。
1 0
5
。
2 6
8
。
7呼
4
.
9斗
5
.
1 7
礴 . 6 3
9
。
1 1
6
。
0 4
2
。
2 6
2
、 9 7
4 8
·
1 5 ( 4 8)
4 7
·
1 8 (斗7 )
3 2
.
8 7 ( 3 3 )
2 9
.
2 8 ( 2 9 )
14
.
6 9 ( 1 5 )
27
.
0 4 ( 2 7 )
2 9
.
2 8 ( 2 9 )
3 6
.
9 2 ( 3 7 )
1 8
.
3 2 ( 1 8 )
19
.
, 1 ( 2 0 )
1 2
·
7 1( 1 3 )
27
·
3 1 ( 2 7 )
2 0
.
4牛 ( 20 )
7
.
2 1 ( 7)
8
·
43 ( 8)
* 色氨酸未测 。
c LA
一A 与 L。A 一B 之氨基酸组成基本相同 , 唯
L cA
一 B 分子多斗个赖氨酸 , 因而两者电泳行为
不同 。
( 4 ) 糖与金属含量 以葡萄糖为标准 , 测
得 L c A 一M 含糖量为 L g形 。 在检测含糖量之
前 ,样品曾对蒸馏水充分透析 , 直至用苯酚一硫
酸法在外透液中不能测出游离之葡萄糖 。
金属含量经等离子体发射光谱仪测定 , 含
钙 0 . 1抢外 , 含锰 0 . 09 % 。
2
. 血凝活力与糖抑制作用 测得 L c A一 M 、
L c A 一 A 与 L 。 A 一 B 引起人红细胞凝集的最低浓
度均为 5一 7户g /m l , 而且其凝集活力强弱与 人 。
A Bo 血型无关。 多种糖类对凝集素均有不 同
的抑制作用 , 根据我们用 5种糖检测的结果 ,其
中以甲基 a 一 D 二甘露糖昔抑制能力最强 ( 2 0 0耀 /
m l)
, 其余依次为 D 一甘露糖 ( 3 75 芦 g /m l) , D -
葡萄糖 ( 7 50 户 g /m l) 与蔗糖 ( 2 8” 户 g /m l) ; D -
半乳糖在其浓度为 0 . 2 m o l / L 时仍无抑制作用
(图 匀。 实验结果还表明 L c A 一 A 与 L c A一 B 受
糖的抑制作用的特性与 毛 cA 一M 相同 。 与文献
报告的结果比较 8[] ,本文制备的 L认 在受糖的
抑制作用时 ,要求的糖浓度略有不同 , 但各种糖
抑制作用的强弱顺序是一致的 。
R 一 A F P ), 另一为 o A 不结合型 A F P ( L` A-
N一 A FP )
。
cL A 与大多数原发性肝癌患者血清
人 F P 糖基有较强的结合能力 , 故肝癌 A F P 变
异体中 L cA 一 R一 A F P 与良性肝病相 比 有 明 显
的增高 。 我们用上述制备的 工J c A 一 M 初步进行
了 A F P 变异体的鉴别实验 , 结果肝癌 A F P 中
的 L c A 一 R 一 A F P 明显多于良性肝病患者 。 在
受检的 1 例原发性肝癌患者中 , 除一例 L c A -
R 一 A F P 为 l/ % 外 ,其余均在 30 关 以上 (均值
54
.
08 务 , 范围 32 . 04 一 91 . 7 0务) ; 而 8 例良性肝
病之 A F P 一 R 一 A F P 均在 10 外以 下 。 而 未与
L 。 A 相作用的肝癌 A F P (即对照组 )则仅出现
单一的免疫沉淀峰 (图 6 ) 。 说明用国产兵豆制
备的 L c A 对于鉴别各种肝病 A F P 变异 体 同
公众粗ù犯象
糖浓您 , 功功 oJ/ 乙
图 5 搪对 L e A 血凝活性的抑制作用
` 一 ` 甲基 一 a 一D 一甘露糖营 , O 一 O D 一甘露 糖 ,
毋一 O D 一葡萄搪 , 义一 火蔗糖 , . 一一 D 一半乳塘
3
. 对 A F P 变异体 ( v a r认。 )t 的鉴别作
用
肝病患者如出现血清 A F P 增高 , 在 L c A
作用下 , 经 CI A E 电泳后 , 一般会出现 两 种
A F P 变异体田 ,一为 L o A 结合型 A F P ( L 。 A -
图 6 血清 A F P 的 L e A 交叉免疫亲和电泳
示不同肝病患者的 A嘿 变异体
:
. 肝癌患者 , b . 良性肝病患者 , ` . 未与 L ` A
作用的 人 F P (血清标本同照片 a)
样是有效的 。 L cA 与不同来源的 入F P 有不同
的结合作用 , 提示 A F P 塘基存在结构上的 差
·
3 9 2
·
生物化学与生物物理进展 1 ” 夕 年 第 16 卷 第 5期
猪 PD G F的 部 分 纯 化
施产甫 许 琳 肖祥华
(海军 医专中心实验室 , 南京 )
提 要
对猪血小板衍生的生 长 因子 ( P D G )F 进行 了部分纯化 。 通过对提取的猪血小
板进行冻融裂解 、 c M一阮 p ha de x C 一知 离子 交换吸附 、 lB ue 一 eS P la r os e 柱层析和欺
甲基纤维素 C M 一义 柱层析等较 简单的纯化 步骤将猪 P D G F 提纯到 6 2 5 。倍 。
人血小板衍生的生长因子 ( p l a t l e t d e r i v e d
gr
“ w ht 加 ct “ : , 简称 P D G F ) 是贮存于血小 板
。 颗粒中的一种碱性蛋白质川 。 P D G F 能刺激
停滞于 G , / q 细胞周期的成纤维细胞 、 神经胶
质细胞 、 平滑肌细胞等多种细胞进人分裂增殖
周期 。 目前认为 , P D G F 在伤口愈合 、 胆固醇
与磷脂合成的调节 、 动脉粥样硬化等多种生理
及病理过程中起重要作用 。
血凝后人血清中的 P D G F 浓度为 15 一 2 0
n g /二 l , 含量极微 。 国外都从过期的血库血或
血小板中提取 f , 一“ 。亦有从猪血中提取猪 P D G F
的报道 s[, 6] 。 已知人 P D G F 由两种多肤链 A和
B组成异二聚体 , 而猪 P D G F 则为由 B一 B 链
组成的同二聚体 , 但两者具有相似的生理和生
化特性 。
本文报道 用 较 简 单 的 方 法初步 提 纯 猪
P D G F 的结果 。
材 料 与 方 法
1
. 细胞 本实验所用活性检测细胞为小鼠
1 4
, 15
,
H o w a r d
, I
.
K
. , S a g e , H
.
J
.
: B i o c 人口叨 i s t r 少, 1 9 69 .
8
, 2 4 2 6
.
丫 i e h a , M . , e t a l . : 刀 1 0 ` 人f哪 . 召 10 户几夕了 . A c 了a , 19 7 Q ,
之2 1 。 2 8 2 .
`
f o y o s h l m
a , 5
. , e t a l
.
: B i o c人萝邢 · B i o P无夕5 . A c t a ,
19 7 0 , 2 2 1
,
5 1斗.
F l i e g e r o v 巨, A . , e t a l . : B i o c h t仍 . B i o 户h 夕5 . A c t口
1 97 4
, 35 1
, 呼1 6 .
D u b o i s
,
M
. , e t a l
.
: A n
a
l
, c 方` 饥 . , 1 9 5 6 , 2 8 , 3 50 .
! 3价g 一H a n s e n , T . C . : A o a l . B i o c方口。 . , 1 9 73 , 56 ,
斗80 。
H o w a r d 1
.
K
. , e t a l
.
: J
.
B 矛0 1 . C h 君。 . , 1 9 7 1 , 2奶 ,
1 95 0
。
A o y a g i
,
Y
. , e t a l
.
: 万i o e h i仍 . B i o P五夕5 . A c ; a , 19 8多
8 30
, 2 1.7
曰川叫
IJ I飞.JOUO户r. LrJ
别 。 A oy ag i 等 f g J认为 L o A 与 A F P 相结合的
搪基是岩藻糖基化的糖基 。 换言之 , 肝癌时往
往伴有岩藻糖基 A F P 的急剧增高 。
本文通过各种纯度指标的鉴定以及血凝活
力的测定 ,研究了用国产兵豆制备的 L cA 的理
化特性。 在交叉免疫亲和电泳中 , 证实此种凝
集素对肝癌 A F P 糖基具有较高的亲和性 , 是
研究 A F P 糖基结构与癌变关系的一种有效工
具 。
{{{
本文承江苏省植物研究所副研究员方文哲鉴定豆
种 ;南京大学现代分析中心分析金属含量 ; 江苏省理化
检测中心分析氨基酸组成均此一并致谢 。
L本文于 1夕8 8 年 7 月 3 0 日收到 ]
参 考 文 献
L l 」 B r e b o r o w 二` z , A . o t a l . : s ` 口 移 d . ] · l m m “ ” 0 1, 1 9 8 1-