全 文 ：辽宁营口地区锦鸡儿与树锦鸡儿
根瘤菌遗传多样性研究
严雪瑞 1,陈文峰2,陈文新 2,傅俊范 1,周如军 1,隋新华 2
(1.沈阳农业大学 植物保护学院,沈阳 110161;2.中国农业大学 生物学院,北京 100094)
摘要:对锦鸡儿与树锦鸡儿根瘤菌进行研究,以了解其系统发育地位及遗传多样性。通过分离、纯化、回接结瘤测定共获得了 31株
待测菌,并采用16SrDNAPCRRFLP及BOX-PCR等方法对这些菌进行了研究。结果表明,31株待测菌的系统发育地位全部源
于中间根瘤菌属 (Mesorhizobiumspp.),并产生5种不同的rDNA图谱组合。BOX-PCR研究中,待测菌株呈现出较高的多样性,在
80%相似性水平上,将待测菌归于17个不同的类型当中。
关键词:锦鸡儿;树锦鸡儿;根瘤菌;遗传多样性;16SrDNAPCRRFLP;BOX-PCR
中图分类号:Q939.11 文献标识码:A 文章编号:1000-1700(2007)01-0044-05
TheGeneticDiversityoftheRhizobiaIsolatedfrom Caragana
arborescens& C.sinicaofYingkouinLiaoninginChina
YANXue-rui1,CHENWen-feng2,CHENWen-xin2,FUJun-fan1,
ZHOURu-jun1, SUIXin-hua2
(1.ColegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China;
2.DepartmentofBiology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)
Abstract:TherhizobiafromCaraganasinicaandC.arborescenswerestudiedherefortheirphylogenicpositionsandgeneticdi-
versity.31isolatesweregotenafterseparating,purifyingandnodulationcheckingandresearchedbymethodsof16SrDNAPCR
RFLPandBOX-PCR.TheresultsindicatedthattheywerebelongedtotheMesorhizobiumgenerawith5diferentrDNAtypes.
Inaddition,theycovered17paternsofBOXPCRfingerprinting,whichimpliedtherewerehighgeneticdiversityamongthese
isolates.
Keywords:Caraganaarborescens(Amm.)Lam;Caraganasinica(Buchoz)Rehd;rhizobia;geneticdiversity;16SrDNAPCRRFLP;
BOX-PCR
锦鸡儿 [Caraganasinica(Buchoz)Rehd]与树锦鸡儿 [Caraganaarborescens(Amm.)Lam]均为豆科植物
蝶形花亚科锦鸡儿属植物[1]。锦鸡儿别名娘娘袜、铁扫帚、金雀花、金雀根、黄刺、阳雀花、黄雀梅、绣花针;树锦
鸡儿别名为金鸡儿、骨担草、蒙古锦鸡儿、小黄刺条[2]。这两种植物常用做庭院观赏和城市绿化,是近年林业苗
圃栽培频率较高的树种,有很好的推广前景。众所周如,根瘤菌作为豆科植物的共生固氮细菌,为宿主植物的
健康生长提供了必要的氮素保障。目前国内外对锦鸡儿属植物根瘤菌的研究报道不多[3-7],较系统的报道仅针
对毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌,已有报道中尚未见锦鸡儿和树锦鸡儿根瘤菌的研究,有必要开展相应的工
作,弄清锦鸡儿和树锦鸡儿的根瘤菌的系统发育地位、类群及其遗传多样性。
1 材料与方法
1.1 供试材料
2005年8月中旬分别在辽宁营口大石桥市林业苗圃的锦鸡儿植物和盖州市林业苗圃的树锦鸡儿植物上
采集到新鲜根瘤。其根瘤大多数生长于距地表10~20cm的宿主的须根之上,其形状有掌状、米粒状、卵状等,大
收稿日期:2006-07-06
基金项目:国家自然科学基金项目(30400001);科技部基础条件平台建设项目子课题(2005DKA21201-10);沈阳农业大学青年教师基金项目(200410)
作者简介:严雪瑞(1977-),女,沈阳农业大学讲师,博士研究生,从事植物细菌分类及植物病理学研究。
沈阳农业大学学报,2007-02,38(1):44-48
JournalofShenyangAgriculturalUniversity,2007-02,38(1):44-48
第1期
多数长度在6~10cm,常簇生。以树锦鸡儿为代表的原始寄主田间根瘤形状见图1a。参比菌株由中国农业大学
菌种保藏中心(CCBAU)提供。
1.2 研究方法
1.2.1 根瘤菌的分离与回接 根瘤菌的分离采用YMA培养基,根瘤经过清洗、表面消毒、破碎、稀释后用将菌
液涂抹于YMA平板上,置于28℃下培养。挑选单菌落进行镜检和纯化。将纯化后的分离物,进行回接结瘤验
证,选用的回接寄主为近缘植物小叶锦鸡儿,方法采用双层钵法[8],8周后检查结果。
1.2.2 16SrDNAPCRRFLP 样品总DNA 的制备参照TEREFEWORK的硅藻土提取法[9]。16SrDNAPCR
引物选用P1和P6[10],反应体系及扩增程序参照BERKUM的描述[11]。将部分PCR产物与DNALadder一起进行
0.8%的琼脂糖凝胶电泳,UV下检测。其片段长度约为1.5kb。将PCR产物分别用4种不同的限制性内切酶[12]进
行处理,各个酶的识别序列和酶切位点如下:
HinfI:5’-G/ANTC-3’HaeII:5’-GG/CC-3’MspI:5’-C/CGG-3’AluI:5’-AG/CT-3’
每种酶切反应10μL体系中含3μLPCR产物,5U内切酶及相应的缓冲液,37℃酶切4h。全部酶切产物与
2μL上样缓冲液溴酚兰(Loadingbufer)混匀进行 3.0%琼脂糖凝胶电泳(100V,4h),UV扫描,文件以 TIFF 格
式保存。采用GelcomparⅡ(version4.5)图像分析软件进行谱带处理,用平均连锁聚类法(UPGMA)得到供试菌株
的树状图。
1.2.3 BOX-PCR 以样品总DNA为模板,引物为BOXair[13],扩增体系及程序如NICK所述[14]。取8μLPCR产
物,加入1μL的上样缓冲液,与DNALadder一起用1.5%的琼脂糖凝胶进行分离,60V,6h。电泳后的凝胶经
UV扫描,文件以TIFF格式保存。采用GelcomparⅡ(version4.5)图像分析软件进行谱带处理,相系性系数选用
Dice,聚树选用平均连锁聚类法(UPGMA)。
2 结果与分析
2.1 根瘤菌的分离与回接结果
本研究采集到的根瘤经分离、纯化、回接测定后共获得 31株分离物,其中17株来自锦鸡儿植物;14株分
离自树锦鸡儿植物。以CCBAU11203菌株为代表的回接测定结果见图1b,c,d。
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第38卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
2.216SrDNAPCRRFLP结果
31株待测菌及25株参比菌株的16SrDNAPCRRFLP酶切组合树状图如图2所示。
16SrDNAPCRRFLP结果表明,待测菌及参比菌共产生23种rDNA图谱。在60%相似性水平上,分为3
个分支:分支1包含了 rDNA图谱组合(以下简称组合)1~13,均由参比菌株组成,属于Rhizobium-Sinorhizobi-
um-Agrobacterium快生菌分支;分支2包含了组合14~22,由6株参比和31株待测菌组成,属于Mesorhizobium
中慢生菌分支;分支3包含了组合23,由1株参比组成,属于Bradyrhizobium慢生菌分支。由此可见,31株待测
菌在系统发育地位上与Mesorhizobium属的关系较近,也表明进一步的研究应主要针对Mesorhizobium属这一
分支展开。待测 31株菌共产生 5种组合,其中组合 17(AbαⅧ)由 SDW018与 1株待测菌构成;组合 21(Adα
Ⅱ)由2株参比和6株待测菌构成;其余3种组合未包含参比菌株,组合19(AbαⅠ)由19株待测菌构成,组合
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第1期
20(AeαⅠ)由3株待测菌构成,组合22(AcαⅡ)由2株待测菌构成。
2.3 BOX PCR结果
本试验在16SrDNAPCRRFLP研究的基础上调整了参比菌株的数目,集中选择了9株Mesorhizobium属
模式菌株。
9株参比菌株在80%相似性水平上可相互区分,在这一水平上所有供试菌株BOXPCR图谱可分为 26种
类型(图3)。
从图3可以看出,31株待测菌株产生17种图谱类型,并均未与9株参比菌株聚在一起。在17种类型当
中,9种类型分别对应于9个不同的菌株,4种类型分别均由2株菌构成,2种类型分别由3株菌构成,2种类型
分别由4株菌构成。由此可见,从数量上来讲这17种类型当中并未产生绝对的优势群。
3 讨论
本研究中17株来自锦鸡儿和14株来自树锦鸡儿的根瘤菌在系统发育地位上与Mesorhizobium属相近,这
与高丽锋[4]报道的来自毛乌素沙地中间锦鸡儿的根瘤菌归于Rhizobium属的结果有所不同。导致结果不一致的
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原因来自两个方面,首先是采集地点生态环境有所差异,其次也可能因寄主种类不同而带来差异。此外,在本
研究中,31株待测菌共产生5种16SrDNA图谱组合,其中组合19所代表的类群由19株待测菌株组成,占总
数的61%,认为其为辽宁省能与这两种寄主共生的优势根瘤菌类群。
BOXPCR图谱分析是一种从菌株水平来区分供试菌株的方法。从本研究的BOXPCR分析结果来看,待
测31株菌表现出了较高的遗传多样性,共产生17种图谱类型,但从数量上讲,并未出现占绝对优势的类群。这
样的结果有可能预示待测31株根瘤菌的表型差异也较大。
鉴于16SrDNAPCRRFLP分析只能对待测根瘤菌进行系统发育地位的初步研究,进一步确定其是否为
新的种群还需要16SrDNA全序列及DNA-DNA杂交等相关数据的验证。此外,这群待测菌具有较高的遗传多
样性,其在表型性状方面也极可能表现出较大差异,值得深入研究。
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[责任编辑:王 娟]
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