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样品消解试剂用量少，降低了由酸所造成的空白值，是理想的
消解方法。采用火焰原子分光光度法测定微量元素含量，该
方法准确性高、精密度好，样品的回收率为 95． 5% ～
104. 8%，相对标准偏差在 3%以内。本研究结果表明，午子
仙毫、定军茗眉、宁强雀舌 3 种茶叶中，对人体有益的 Mg、Ca、
Mn含量很高，这些微量元素对维护人体免疫功能起着重要
作用。其中，午子仙毫中 Mg、Mn、Fe、Cu、Zn 含量较高，茶叶
品质优异。
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doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 11． 121
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测南苜蓿 SSR标记
陈 祥，魏臻武，任海龙，乔志宏
(扬州大学动物科学与技术学院 /扬州大学草业科学研究所，江苏扬州 225009)
摘要:以南苜蓿(Medicago polymorpha)为试验材料，用 CTAB法提取南苜蓿基因组，选择已开发的蒺藜苜蓿(Medi-
cago truncatula)引物 100 对，分别在一年生苜蓿 SSR － PCR反应体系和苜蓿属变种 SSR － PCR反应体系的基础上进行
PCR扩增，并将扩增产物进行 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，都得到了位点明显、背景清晰的条带。结果表
明，南苜蓿均适合于现有的一年生苜蓿 SSR － PCR反应体系和苜蓿属变种 SSR － PCR 反应体系，建立了一套有效、成
熟的应用于南苜蓿 SSR标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测的方法，该方法可以用于南苜蓿杂交 F1 代的鉴定以及后
期资源的遗传分析。
关键词:南苜蓿;SSR标记;PAGE
中图分类号:S540． 1 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)11 － 0382 － 03
收稿日期:2014 － 11 － 10
基金项目:江苏省科技支撑计划(编号:BE2012340) ;江苏省普通高
校研究生科研创新计划(编号:CXLX_1429)。
作者简介:陈 祥(1990—) ，男，江苏扬州人，硕士研究生，研究方向
为牧草种质资源评价与遗传育种。E － mail:yzdxchenxiang @
163． com。
通信作者:魏臻武，博士，教授，主要从事牧草遗传育种与种质资源评
价研究。E － mail:zhenwu_wei@ hotmail． com。
南苜蓿(Medicago polymorpha)属于豆科苜蓿属，是一年
生或越年生苜蓿，别称秧草、草头、金花菜［1 － 2］、多形苜蓿［3］
等。南苜蓿多产于长江中下游地区，如江苏、浙江等地，在安
徽、江西、云南等地也有分布。南苜蓿常作为田间绿肥，也可
作蔬菜和牧草。目前，随着秧草保健功能的不断彰显，多地已
经形成了以秧草为主的产业。南苜蓿实现了牧草功能的延
伸，是长三角生态农业新的增长点，成为我国南方草业发展的
新亮点［4］。
简单序列重复(Simple sequence repeat，SSR) ，是重复序
列的重要组成部分。SSR 是由 1 ～ 6 个核苷酸为重复单位序
列组成的串联重复序列。SSR以 PCR 技术为基础，并均匀分
布于整个基因组中。由于 SSR分子标记具有共显性、涵盖范
围广、标记数量丰富、所揭示的多态性高等优点［5］，已经在分
子育种、指纹图谱构建、种子纯度鉴定、基因定位等方面得到
广泛应用［6 － 7］。同样，对于遗传背景缺乏、没有测序信息的植
物，SSR仍然具有极高的利用价值。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，
PAGE) ，是一种以聚丙烯酰胺凝胶作为介质的常用电泳技
术。由于其检测灵敏度和分辨率都比较高，是分子生物学和
基因工程上不可缺少的试验技术，特别适合 SSR 标记扩增产
物的检测［8 － 9］。本研究在张丽芳等模式植物蒺藜苜蓿(Medi-
cago truncatula)SSR 标记的 PCR 反应体系［10］和 Eujayl 等苜
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蓿属变种 PCR反应体系［11］的基础上，建立一种适用于南苜
蓿 SSR标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测的方法。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
本试验所用的南苜蓿材料由扬州大学草业科学研究所野
外搜集所得(表 1) ，于 2014 年 4 月种植于扬州大学扬子津校
区实验地，在植株成型后取嫩叶研磨，提取的叶片 DNA 作为
PCR反应的模板。试验所用的 MgCl2、dNTP、Taq 聚合酶试剂
均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他常规试剂均
为国产分析纯。
表 1 供试材料
编号 品种类别 来源 形态特征
WL01(♂) 地方品种 浙江温岭 叶片较大、株型较高、分
枝数较多
CX01(♀) 地方品种 云南楚雄 叶片较小、株型较矮、分
枝数少
F1(WL01 × CX01) 待选品系 叶片较大、分枝数较多
1． 2 DNA提取
南苜蓿叶片基因组 DNA 提取采用魏臻武的 CTAB
法［12］。取 10 ～ 15 张叶片在液氮中迅速研磨成粉末，用于后
续 DNA的提取，提取的 DNA 经 0． 8%琼脂糖凝胶电泳和紫
外分光光度计检测质量和浓度。样品稀释 10 倍放入 4 ℃冰
箱备用，原液放入 － 70 ℃冰箱长期保存。
1． 3 引物
引物来源于扬州大学草业科学研究所提供的 100 对蒺藜
苜蓿 SSR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物粉末用超纯水稀释，保证引物的浓度高于 10 μmol /L。
待完全溶解后在漩涡混合器中混匀，离心，放入 － 20 ℃冰箱
中保存待用。
1． 4 PCR反应体系和扩增程序
SSR反应体系［10］为 10 μL(每孔添加量)。10 μL PCR体
系含 0． 24 μL dNTP (10 μmol /L) ，3 μL Primer(10 μmol /uL) ，
0． 16 μL Taq polymerase(1 U) ，1． 5 μL 10 × buffer (1 μmol /L) ，
3 μL DNA 模板(20 ～ 90 ng /μL) ，0． 9 μL Mg2 +(20 mmol /L) ，
1． 2 μL ddH2O。
一年生苜蓿 PCR扩增程序［13］:94 ℃预变性 3 min;95 ℃
变性 1 min，，55 ℃退火 1． 5 min (不同引物退火温度不同) ，
72 ℃延伸 1min，共循环 35 次;最后 72 ℃保温 8 min，4 ℃
保存。
苜蓿属变种 PCR扩增程序［11］:95 ℃预变性 10 min;95 ℃
变性 50 s，55 ℃退火 50 s(不同引物退火温度不同) ，72 ℃延
伸 90 s，共循环 40 次;最后 72 ℃保温 10 min，4 ℃保存。
1． 5 PCR扩增产物的电泳检测
PCR扩增产物中加入 l L loading buffer (溴酚蓝缓冲
液) ，在 8%非变性聚丙稀酰胺凝胶(PAGE)上，于 100V 电压
电泳 0． 5 h，200 V电压电泳 1 h，然后银染检测。
1． 6 图片处理
电泳照片用 Adobe Photoshop CS2 9． 0 进行裁剪;引物信
息采用 Excel 2003 整理。
2 结果与分析
用 100 对蒺藜苜蓿 SSR 引物进行亲本母本温岭材料和
父本楚雄材料及其杂交 F1 代多态性分析，筛选出 8 对多态性
较好的作为南苜蓿特异性 SSR 引物，引物信息如表 2 所示。
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，最后银染上色，其
结果见图 1、图 2。
表 2 SSR引物相关信息
编号 引物名称 正向引物序列(5→3) 反向引物序列(5→3)
1 MtB152 AATTTCAGGAAAACCATCAA GATGGGACTTGATTTCCTTA
2 MtB34 GACGTCGGAGACATGGAGTT TCTAAGCCTCACCCCAAAGA
3 MtB147 TCAAAATCAAAATCGGCGAC TTACGGGGACAAAAATTGGA
4 MtB18 ACCTGGGATTGGGTTAGGAC CCACTGTTGTTGTTGCTGCT
5 MtB21 TACTGGGTTCACGCACAAAA TTCAACCGTACCGCTCTTCT
6 MtB50 CATGTAACGCTTGAGGCTGA CAACCCTAACCCTCACCAAA
7 MtB16 TTTGTTGGAGTATCTGCTTGCT CAATTTGCCGTTGTTTGCTA
8 MtB8 CCATCCTTTTACGATGACCG GGCTTACCACCACCACATTC
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试验结果表明，蒺藜苜蓿 SSR 引物 MtB152、MtB34、
MtB147、MtB18、MtB21、MtB50、MtB16、MtB8 在一年生苜蓿
SSR － PCR反应体系中和苜蓿属变种 SSR － PCR 反应体系中
均能扩增出条带，但条带质量有差异。具体表现为一年生苜
蓿 SSR反应体系扩增出的产物经电泳检测后得到的谱带要
比苜蓿属变种的 SSR反应体系扩增出的谱带背景更加清晰，
多态性位点更易于辨认，但扩增出的位点明显少于苜蓿属变
种 SSR 的反应体系。在 2 种反应体系中，引物 MtB18、
MtB147、MtB50、MtB8 扩增出的条带数明显多于其他引物，多
态性好于其他引物。
基于一年生苜蓿 SSR 反应体系和苜蓿属变种的 SSR 反
应体系，分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳后对南苜蓿进行 SSR
标记检测，均能够得到稳定、易辨、背景清晰的谱带，是一套快
速有效的检测方法。
3 结论与讨论
由于 SSR的诸多优点以及技术的日趋成熟，已经成为一
种比较理想的分子标记技术，被广泛运用到多个领域。在农
作物中，水稻 (Oryza sativa)［14 － 15］、小麦 (Triticum aesti-
vum)［16 － 17］、玉米(Zea mays)［18］、大豆(Glycine max)［19］、大麦
(Hordeum vulgare)［20］等都已进行了 SSR标记的研究。
南苜蓿早期作为蔬菜和田间绿肥推广［4］，在分子生物学
研究方面，还没有相关的文献报导，导致其遗传背景缺乏，试
验工作无法借鉴，给遗传育种工作带来了困难。试验证明，根
据南苜蓿的分类学地位，将其作为一年生苜蓿属植物的属性
来研究，能够开展 SSR分子标记的研究。根据引物之间的通
用性，已开发的蒺藜苜蓿 SSR 引物，通过聚丙烯酰胺凝胶电
泳技术，在一年生苜蓿 SSR － PCR 反应体系和苜蓿属变种的
SSR － PCR反应体系的基础之上，能够扩增出条带清晰、多态
性高的谱带，可以用于南苜蓿试验分析与交流。
要想获得清晰可靠的条带可以改变引物的退火温度、
Mg2 +浓度以及反应的循环数［21 － 22］。基于一年生苜蓿 SSR 反
应体系的谱带要比苜蓿属变种的 SSR 反应体系的清晰，但是
扩增出的位点数要少于苜蓿属变种的反应体系，这可能与各
自的反应体系的退火温度及循环次数有关，需要进一步设计
试验来摸索证明，才能最终得到位点数多而且条带清晰可靠
的 SSR － PCR反应体系。
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