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(收稿日期:2010-11-08;修回日期:2010-11-27)
葫芦茶抗 IgE介导 I型过敏有效部位的研究
周旭东1 , 史丽颖1 , 于大永1 , 师海波2 , 苗艳波2 , 唐玲1 , 冯宝民1 , 王永奇1＊ (1.大连大学药物研究所 ,
辽宁大连　116622;2.吉林省中医药科学院 , 长春　130041)
摘要:目的　以大鼠 I型过敏反应模型探索葫芦茶抗过敏反应有效部位。方法　葫芦茶用 50%丙酮提取 、 乙酸乙酯
萃取和 D101 大孔树脂富集分别得到丙酮提取物 (1 号)、 乙酸乙酯萃取物 (2 号)、 水溶物 (3 号)、 水不溶物 (4
号)和大孔树脂富集物 (5号)。采用卵白蛋白 (OVA)和氢氧化铝 [ Al (OH)3] 的混合液致敏和诱发制备的大鼠
I型过敏反应模型 , 随机分组 , 1 、 2、 3、 4 、 5 号组各设 100 、 400 mg · kg -1 2 个剂量组 , 孟鲁司特钠 (menglus-
itena)组 、 正常对照组和模型组;采用 ELISA 法测定血清 IgE 、 LT 和 His 含量;采用细胞计数法 , 测定大鼠全血
和肺泡灌洗液 (BALF)中嗜酸性粒细胞 (EOS)数量;通过病理学检查 , 检测肺组织炎症面积。 结果　1、 2、 3
号均可明显降低血清 IgE、 LT 和 H is 的含量 , 强弱顺序为 1>2>3;1 号可明显减少全血及 BALF 中 EOS 数量 , 其
余作用不明显;1、 2 号可减少肺组织炎症面积 , 强弱顺序为 1>2。结论　1、 2 、 3 号灌胃给药对大鼠过敏均有明
显的拮抗作用 , 综合各项指标 , 活性强弱顺序为 1>2>3。
关键词:葫芦茶;有效部位;IgE介导 I型过敏反应;炎症
中图分类号:R965.1　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672-2981 (2011)01-0035-04
doi:10.3969/ j.issn.1672-2981.2011.01.012
Effect of active part extracted from Tadehagi trquetrum (Linn.)
Ohashi on type I allergy induced by IgE
ZHOU Xu-dong1 , SHI Li-y ing1 , YU Da-yong1 , S HI H ai-bo2 , M IAO Yan-bo2 , TANG Ling 2 , FENG Bao-min1 ,
WANG Yong-qi1＊ (1.Insititute o f Materia Medica of Dalian University , Dalian Liaoning 116622;2.J ilin Sci-
ence Academy of T raditional Chinese Medicine and Material Med ica , Changchun 130041)
Abstract:Objective　 To determine the effec t of active pa rt e xtr acted f rom Tadehagi trquetrum(L im.)Ohashi on type
I allerg y induced by IgE.Methods　Tadehagi trquetrum (Linn.)Ohashi w as ex tracted by 50% acetone.The 50% ac-
e tone ex tractions w ere again ex tracted by EtOAc and isola ted by D101 chromatog raphy column.We go t 50% acetone
ext raction (1), EtOAc ex traction(2), H 2O layer(3), residue(4), and enriched ex trac t by macropo rous re sin D101
(5).Rats w ere sensitized with the mix ture o f OVA and A l (OH)3 to establish the experimenta l rat model of type I al-
lerg y.The rats were divided into 13 gr oups ramdomly , name ly a no rmal g roup , a model g roup , a menglusitena g roup ,
and sample g roup 1 , 2 , 3 , 4 , 5 at 100 mg · kg-1 o r 400 mg · kg -1 respectively.IgE , LT and His contents in the se-
rum of sensitized ra ts we re mea sured w ith EL ISA.The inflamma to ry a rea in the pulmonary tissues thr ough pa tho log i-
cal examination.Results　Group 1 , 2 , 3 dec reased the contents of IgE , LT and His in the serum.The active se-
quence was 1>2>3.Group 1 reduced the quantities of EOS in w hole blo od and BALF;Group 1 and 2 reduced the in-
flammato ry a reas in the pulmonary tissue , and the active sequence w as 1>2.Conclusion　Group 1 , 2 , and 3 have ob-
v ious anti-ale rgy effect on type Ⅰ allerg y and the activ e sequence is 1>2>3.
　　作者简介:周旭东 , 男 , 在读硕士 , 主要从事天然活性物质研究 , Tel:15140527202 , Eail:xu dong401@126.com　　＊通讯作者:王
永奇, 男 , 教授 , 博士 , 主要从事天然活性物质研究 , E-mail:dalianwyq@163.com
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中南药学 2011年 1月第 9卷第 1期　Cent ral Sou th Pharmacy.January 2011 , Vol.9 No.1
Key words:Tadehagi trquetrum (Linn.)Ohashi;effective par t;ty pe I allerg y induced by IgE;inflammation
　　由 IgE 介导的 I型过敏反应临床表现为支气管哮喘和过
敏性鼻炎[ 1] 。过敏性哮喘在易感者中可引起反复发作的喘
息 、 气促 、 胸闷 、 咳嗽等症状 , 劳损过度时 , 过敏性哮喘还
可迅速恶化 , 出现呼吸困难等 , 严重者甚至可猝死。 近年
来 , 伴随人们生活方式和工作生活环境的变化 , 过敏性哮喘
的发病率正呈现出不断上升的趋势 , 目前该病已成为常见
病。葫芦茶系豆科葫芦茶属植物葫芦茶 Tadehagi trique-
trum (L.)Ohashi的全草 , 主产于广西 、 江西 、 广东 、 福建
等地[ 2] , 民间常用于治疗感冒发热 、 咽喉肿痛 、 急性肾炎 、
黄疸肝炎 、 肠炎 、 细菌性痢疾等[ 3-4] 。前期研究中发现葫芦
茶具有较强的抗过敏性哮喘作用 , 本实验对其抗过敏的有效
部位及相关机制进行了研究 , 旨在为葫芦茶抗过敏性哮喘作
用提供理论和实验依据。
1　材料
1.1　实验动物
Wista r 大鼠 [ 清洁级 , 吉林大学实验动物中心 , 合格
证号:SCXK- (吉)2008-0005] 。
1.2　药品与试剂
葫芦茶标本经中科院昆植所裴盛基教授鉴定;孟鲁司特
钠片 (杭州默沙东制药有限公司 , 批号:09317);卵白蛋白
(北京鼎国生物技术有限责任公司 , Lo t:99M10230);大鼠
白三烯 (LT)、 免疫球蛋白 IgE 、 组胺 (His)(均来源于加
拿大 Biow en生物公司);ELISA 检测试剂盒 (Biowen Co.,
L td., Canada , Lo t:2009/09/ 12);瑞氏-姬姆萨染色液 (珠
海贝索生物技术有限公司 , Lot:409093)。
1.3　仪器
680 型全自动酶标仪 (美国 BIO-RAD 公司);显微镜
(日本 OLYMPUS 公司)。
2　方法
2.1　药物的提取与配制
取葫芦茶 (茎叶), 粉碎 , 用 50%丙酮-水提取 , 回流 3
次 , 每次 3 h , 浓缩 、 干燥得 50%丙酮提取物 (1 号), 1 g
样品按生药量计为 5.02 g;取 50%丙酮提取物先用水溶解 ,
然后用乙酸乙酯萃取 , 得乙酸乙酯萃取物 (2 号)、 水层 (3
号)和水不溶物 (4 号), 1 g 样品按生药量计分别为 25.32 、
16.88 、 9.93 g。取 50%丙酮提取物用 D101 大孔树脂富集
物 , 得富集物 (5 号), 1 g 样品按生药量计为 24.39 g。 1 ～
5 号分别用 5%吐温-80配制成 40 mg·m L-1备用。
2.2　模型制备与处理[ 5-8]
致敏:大鼠一次性腹腔注射含卵白蛋白 1 mg 和氢氧化
铝 10 mg 的生理盐水混悬液 1 mL。攻击:大鼠致敏后 15 、
16 、 17 d 每日尾静脉注射卵白蛋白生理盐水溶液 (15 mg ·
kg -1)1 次 , 连续3 d , 激发哮喘 , 注射后 5～ 10 min 后出现
喘促 、 咳嗽等呼吸道痉挛梗阻症状提示造模成功。正常对照
组注射等体积生理盐水。
分组与给药:取Wistar 大鼠 130 只 , 雄性 , 170～ 180 g ,
按体重随机分为 13 组 , 分别为正常对照组 , 模型组 , 孟鲁
司特钠 1 mg · kg -1组 , 1 ～ 5 号样品各设 400 、 100 mg ·
kg-1 (按提取物计)2 个剂量组。各给药组于致敏前 1 h 至
末次攻击前 1 h 每日灌胃给药 1 次 , 共计 18 次 , 正常对照
组及模型组给予同体积 (10 m L· kg-1)5%吐温-80 溶液。
2.3　测定指标
2.3.1　外周血 IgE、 LT 与 His 检测　大鼠末次攻击后
24 h , 300 mg · kg -1水合氯醛腹腔注射麻醉 , 腹主动脉采
血 , 3 000 r ·min-1离心 10 min 分离血清 , 按 ELISA 试剂
盒操作要求 , 以全自动酶标仪于 450 nm 测定 A 值 (随机选
取 8 个样本), 通过标准曲线计算全血 IgE 、 LT 、 His 含量。
2.3.2　全血嗜酸性粒细胞计数　全血镜下计数白细胞数;
全血涂片 , 瑞氏-姬姆萨染色 , 镜下进行白细胞分类计数 ,
计数 200 个白细胞中嗜酸性粒细胞所占百分数 , 按全血白细
胞数×嗜酸性粒细胞 (%), 计算嗜酸性粒细胞数量 (随机
选取 8 个样本)。
2.3.3　肺泡灌洗液 (BALF)嗜酸性粒细胞 (EOS)计数　
大鼠腹主动脉采血处死 , 消毒后打开胸腔 , 左侧肺支气管插
管 , 缓慢注入 D-H anks 液 5 m L , 停留 10 s , 缓慢抽回 ,
重复 3 次 , 回收液约 4 mL , 注入消毒试管 , 1 500 r·min-1
离心 15 min , 取少量白细胞涂片 , 按全血方法进行白细胞分
类计数 , 剩余沉淀用 4 mL 生理盐水稀释 , 镜下进行白细胞
计数 , 按全血方法计算嗜酸性粒细胞数量 (随机选取 8 个样
本)。
2.3.4　组织病理学检查　大鼠腹主动脉采血处死后 , 立即
剖去右侧肺组织 , 10%多聚甲醛固定石蜡包埋切片 , HE 染
色 , 按炎症反应轻重程度分为Ⅴ级 , 分级标准为:0 级:镜
下未见炎症反应 , Ⅰ级:镜下目测炎症反应面积占总面积<
25%, Ⅱ级:镜下目测炎症反应面积占总面积<50%, Ⅲ
级:镜下目测炎症反应面积占总面积<75%, Ⅳ级:镜下目
测炎症反应面积占总面积>75%[ 9-10] 。
2.4　统计学处理
计量资料以 x±s表示 , 两组间均数差异性采用 t检验 ,
P<0.05 认为有统计学意义。
3　结果
3.1　对过敏性哮喘大鼠血清 IgE 、 LT 、 His 含量的影响
同正常组大鼠比较 , 模型组大鼠血清 IgE、 LT、 His 含
量明显增高 , 不同组分灌胃给药大鼠同模型组大鼠比较 , 有
不同程度降低 , 其中 1号作用最强 , 且 1号高剂量组强于孟
鲁司特钠组 , 2 号 、 3 号次之 , 4、 5 号作用不明显 , 结果见
表 1。
3.2　对过敏性哮喘大鼠全血与 BALF 中 EOS 的影响
同正常对照组大鼠比较 , 模型组大鼠全血与 BALF 中
EOS 数明显增高 , 同孟鲁司特钠组比较 1 号高剂量组可明
显减少全血及 BALF中 EOS 数量 , 其余作用不明显 , 结果
见表 2。
3.3　对过敏性哮喘大鼠肺组织病理形态的影响
正常对照组大鼠肺组织结构正常 , 肺泡腔内无炎细胞浸
36
C ent ral S outh Ph arm acy.J anu ary 2011 , Vol.9 No.1　中南药学 2011年 1月第 9卷第 1期
表 1　对过敏性哮喘大鼠血清 IgE、 LT、 His含量的影响 (n=8)
Tab 1　Effect of various fractions on serum IgE, LT, and His in rats with allergic asthma(n=8)
组别 (g rou p) 剂量(dose)/mg· kg -1 IgE/mg· L-1 LT/μg· L-1 H is/μg· L-1
正常对照组 5.43±0.71 7.36±0.96 2.69±1.68
模型组 19.71±10.63## 17.21±4.89### 11.07±2.89###
孟鲁司特纳组 1 8.35±2.14＊＊ 11.17±0.40＊＊ 6.99±3.01＊
1号组 400 7.40±2.51＊＊ 10.45±0.37＊＊ 6.78±3.00＊
100 10.84±2.72＊＊ 11.92±0.40＊＊ 7.58±2.00＊
2号组 400 8.91±3.49＊ 12.07±1.00＊ 7.78±1.93＊
100 11.49±6.96 12.38±0.68＊ 7.52±2.84＊
3号组 400 11.00±4.91 11.35±0.75＊＊ 8.68±5.10
100 14.80±11.33 12.23±0.56＊ 9.78±4.46
4号组 400 14.50±6.87 13.58±2.33 10.22±5.25
100 16.17±9.00 13.80±2.49 9.47±5.05
5号组 400 14.02±5.92 13.92±2.47 9.16±5.44
100 16.18±12.89 14.28±2.51 8.99±6.14
　　注:同正常组比较:##P<0.01 , ###P<0.001;同模型组比较:＊P<0.05 , ＊＊P<0.01。
　　note:vs the normal g roup:##P<0.01 , ###P<0.001;vs the model g rou p:＊P<0.05 , ＊＊P<0.01.
表 2　对过敏性哮喘大鼠全血与 BALF中EOS数的影响 (n=8)
Tab 2　Effect of various fractions on the number of EOS in blood and BALF in rats with allergic asthma(n=8)
组别 (g rou p) 剂量 (dose)/mg· k g -1 全血 (b lood)(×108/ L) 肺泡灌洗液 (BA LF)(×107/ L)
正常对照组 1.12±0.37 2.86±1.03
模型组 3.52±1.38### 6.51±2.62##
孟鲁司特钠组 1 1.98±0.70＊ 3.75±0.88＊
1号组 400 1.94±0.97＊ 3.94±0.82＊
100 2.57±1.42 4.77±0.67
2号组 400 2.21±1.06 4.51±1.01
100 2.70±1.54 5.23±1.60
3号组 400 2.27±0.93 4.50±0.63
100 2.87±1.18 5.11±0.47
4号组 400 2.63±0.83 5.14±0.71
100 2.75±1.25 5.09±0.71
5号组 400 2.94±2.40 4.60±0.95
100 2.60±1.49 5.09±0.85
　　注:同正常组比较 , ##P<0.01;同模型组比较 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 , ＊＊＊P<0.001。
　　note:vs the normal g roup , ##P<0.01;vs the model g rou p , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 , ＊＊＊P<0.001.
润 、 渗出。模型组肺的肺泡 、 肺泡囊 、 肺泡管明显变小 , 肺
间质明显增生 , 其中以各类成纤维细胞 , 嗜酸性细胞为主 ,
中性细胞较少 , 肺内未见明显的白细胞渗出和液体渗出。主
要表现为成纤维细胞为主的炎症。同孟鲁司特钠组比较 1
号 、 2 号给药后肺组织炎症面积明显减少 , 结果见表 3。
表 3　抗过敏性哮喘组分对过敏性哮喘大鼠肺组织炎症的影响 (n=10)
Tab 3　Effect of various fractions on inflammation of lung tissue of rats with allergic asthma(n=10)
组别
(group)
剂量
(dose)
/m g· kg -1
动物数 (number)
正常
(normal)
炎症面积 (area of inf lammation)
<25% <50% <75% >75%
U 值
(U value)
＊P值
(P value)
正常对照组 10
模型组 0 0 1 9
孟鲁司特钠组 1 1 3 5 1 3.450 5 <0.01
1号组 400 0 3 3 4 2.367 7 <0.05
100 1 2 2 5 2.009 5 <0.05
2号组 400 1 3 3 3 2.748 8 <0.01
100 1 2 3 4 2.009 4 <0.05
3 号组 400 1 1 4 4 2.330 4 <0.05
100 0 1 3 6 1.550 0 >0.05
4 号组 400 0 1 2 7 1.138 9 >0.05
100 0 0 1 9 0 >0.05
5 号组 400 0 0 1 9 0 >0.05
100 0 0 1 9 0 >0.01
　　注:＊各给药组同模型组比较。
　　note:＊vs the m odel group.
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中南药学 2011年 1月第 9卷第 1期　Cent ral Sou th Pharmacy.January 2011 , Vol.9 No.1
4　讨论
过敏性哮喘是一种由嗜酸性粒细胞 、 肥大细胞 、 T 细胞
等多种炎症细胞参与的慢性支气管炎和气管高反应性为特征
的疾病。从免疫学来说是速发型超敏反应。机体吸入抗原
后 , 产生特异性 IgE 抗体 , I gE 与肥大细胞膜上 I gE Fc段高
亲和力受体结合 , 使机体呈致敏状态。当再次吸入同类抗原
时 , 抗原与特异性 IgE 发生桥联 , 使胞外 Ca2+流入 , 胞内
Ca2+积聚以及激活酪氨酸磷酸化通路 , 磷酸肌醇水解 , 激
活蛋白激酶 C , 最终导致肥大细胞活化及脱颗粒 , 释放包括
组胺 、 趋化剂 、 白三烯 、 前列腺素 、 血小板活化因子及多种
酶类在内的多种生物活性物质 , 引起平滑肌收缩 、 黏膜水
肿 、 血管通透性增高[11] 。 EOS 增多为过敏性哮喘的特征变
化 , EOS 能产生多种毒性蛋白如主要碱性蛋白 (major ba sic
protein , MBP), 可直接损伤气道上皮和肺组织 , 引起气道
上皮剥离和气道高反应性[ 12] 。 白三烯是引起支气管收缩的
主要介质 , 其作用强度远远高于其他炎症介质如组胺 、 前列
腺素等 , 是引起过敏性哮喘的关键介质。
本实验以卵白蛋白为抗原 , 复制大鼠过敏性哮喘模型 ,
通过特异性 IgE 产生 , 全血及 BALF 中 EOS 数量变化 , 血
清炎症介质白三烯含量变化对不同组分的抗过敏性哮喘活性
进行筛选 , 结果表明 , 模型组大鼠血清 IgE、 LT、 His 含量
明显增高 , 全血及 BA LF 中 EOS 数量明显增高 , 肺组织炎
性细胞浸润及炎症面积明显增加 , 不同组分给药治疗后 , 上
述指标表现出不同程度的抑制作用 , 1、 2 、 3 号均可明显降
低大鼠血清 IgE、 LT 及 His 含量 , 其中 1 号最强 , 2 、 3 号
次之 , 4 、 5 号作用不明显;1号可明显减少全血及 BALF中
EOS 数量 , 其余作用不明显;肺组织病理学检查结果显示 ,
1 、 2号肺组织炎症面积明显减少。综合各项指标 , 活性强
弱次序为:1 号>2 号>3号 。
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(收稿日期:2010-09-16;修回日期:2010-12-06)
高效液相色谱法同时测定三拗片中
盐酸麻黄碱和苦杏仁苷的含量
李沁璇1 , 杨芳2 (1.湖南省常德市第一人民医院 , 湖南 常德　415003;2.湖南省常德市药品检验所 , 湖南 常德　
415000)
摘要:目的　建立高效液相色谱同时测定三拗片中盐酸麻黄碱和苦杏仁苷含量的方法。方法　采用 Hyper sil BDS
C18柱 (250 mm×4.6 mm , 5μm), 流动相为甲醇-0.3%磷酸溶液(20∶80), 检测波长为 217 nm , 流速为 1.0 mL ·
min -1 , 柱温为 30 ℃, 外标法计算含量。结果　盐酸麻黄碱在 0.019 9～ 0.398μg 与峰面积有良好的线性关系 , r=
0.999 8 , 平均回收率为 97.6%, RSD为 1.2%(n=9);苦杏仁苷在 0.104 2～ 2.084 μg 与峰面积有良好线性关系 ,
r=0.999 9 , 平均回收率为 98.2%, RSD为 1.0%(n=9)。结论　该方法简便 、 准确 、 重复性好 , 可同时测定三
拗片中盐酸麻黄碱和苦杏仁苷的含量。
关键词:三拗片;盐酸麻黄碱;苦杏仁苷;高效液相色谱法
中图分类号:R927.2　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672-2981 (2011)01-0038-04
doi:10.3969/ j.issn.1672-2981.2011.01.013
　　作者简介:李沁璇 , 女 , 主管药师 , 主要从事医院药学工作 , Tel:13973650702 , E-mail:liqin xuan520@qq.com
38
C ent ral S outh Ph arm acy.J anu ary 2011 , Vol.9 No.1　中南药学 2011年 1月第 9卷第 1期