全 文 ：制剂与质控
粉葛与野葛中异黄酮的 HPLC指纹对照和比色测定
陈　珺 ,宋　敏 ,张　钰 ,张丝韵 ,杭太俊
(中国药科大学药物分析室 ,南京 210009)
　　[摘要 ] 　目的:建立粉葛与野葛药材异黄酮的 HPLC指纹对照测定法 、定性和定量相似性评价指标 、以
及粉葛与野葛总异黄酮含量的比色测定法 。方法:采用 C18色谱柱 ,甲醇-0.1%甲酸溶液梯度程序洗脱测定
粉葛与野葛药材异黄酮的 HPLC指纹图谱 ,统计分析确定共有模式;以最接近共有模式的粉葛与野葛药材为
指纹对照 ,采用夹角余弦法和相对欧氏距离法 ,分别从化学成分定性和含量 2个方面对不同产地粉葛与野葛
药材的 HPLC指纹图谱进行定性与定量相似性评价 。以葛根素为对照 , Folin-phenol试剂为显色剂 ,未加供
试品的溶液为空白 , 70℃水浴显色后 ,在 750nm下比色法测定粉葛与野葛药材的异黄酮总量。结果:建立
的粉葛与野葛异黄酮成分 HPLC指纹图谱分离好 、专属性强 ,野葛色谱图中有 20个特征指纹峰 ,粉葛色谱图
中有 11个特征指纹峰 。比色法测定异黄酮总量的线性范围为 12 ～ 40 mg·L-1(r=0.999 5),平均回收率
101.1%(n=6)。结论:粉葛与野葛异黄酮指纹图谱以指纹对照品为参照 ,同时进行夹角余弦法定性和相对
欧氏距离法定量相似性评价 ,重复性和耐用性良好 ,并且更全面和实用。Folin-phenol试剂比色法测定粉葛
与野葛异黄酮总量准确灵敏。
[关键词 ] 　粉葛;野葛;HPLC;指纹图谱;指纹对照品;异黄酮;Folin-phenol试剂比色法
[中图分类号 ] R284.1;R943.3　[文献标识码 ] A　[文章编号 ] 1003-3734(2008)14-1240-07
DeterminationofpueraiaisoflavonesinPuerariathomsoniand
PuerarialobatabyHPLCreferencefingerprintchromatogramand
Folin-phenolreagentcolorimetry
CHENJun, SONGMin, ZHANGYu, ZHANGSi-yun, HANGTai-jun
(DepartmentofPharmaceuticalAnalysis, ChinaPharmaceuticalUniversity, Nanjing210009, China)
[ Abstract] 　Objective:ToestablishastableandrepeatableHPLCreferencefingerprintchromatogramstand-
ardandacolorimetricassaymethodforqualitativeandquantitativeevaluationofpueraiaisoflavonesinPueraria
thomsoniandPuerarialobata.Methods:HPLCseparationwasperformedonaC18 columnwithmethanol-0.1%
formicacidsolutionasmobilephaseingradientelutionmode.Thereferencefingerprintchromatogramwasdeter-
minedasoneofthemosttypicalchromatogramsthatrepresentedthepropertyofpueraiaisoflavonesinPueraria
thomsoniandPuerarialobatafrombothconstitutesandquantityviewofpoints, establishedbystatisticalandsimi-
larityanalysis.ThecolorimetricassaymethodwasestablishedwithFolin-phenolasthecoloringreagent, puerarinas
thereferencestandard, coloringreactionin70℃ waterbathfor15min, andabsorbancemeasurementat750nm.
Thetotalpuerariaisoflavonesweredeterminedbycalibrationcurvemethodwiththesampleblankasreference.Re-
sults:TheHPLCmethodwasspecificandhavinggoodresolutionforthepueraiaisoflavones.Thefingerprintchro-
matogramsofPuerariathomsoniandPuerarialobatashowed20and11 characteristicpeaks, respectively.Calibra-
tioncurveofthecolorimetricmethodwaslinearintherangefrom12to40mg·L-1 withr=0.999 5.Theaverage
recoverywas101.1%(n=6).Conclusion:ThepueraiaisoflavonesfingerprintchromatogramsofPuerariathomso-
niandPuerarialobatacanbequantitativelyandqualitativelyevaluatedbycomparisonwiththeestablishedrefer-
encefingerprintchromatogramsbyusingCosineqandrelativeEucliddistancemethods, respectively.Themethod
isofgoodrepeatabilityandruggedness, andmorecomprehensiveandpractical.Thecolorimetricassaymethodfor
thetotalpueraiaisoflavonoidsissensitiveandaccurate.
[ Keywords] 　Puerariathomsoni;Puerarialobata;HPLC;fingerprint;fingerprintreferencesubstances;
isoflavone;colorimetrywithFolin-phenolreagent
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　ChineseJournalofNewDrugs2008, Vol.17No.14 中国新药杂志 2008年第 17卷第 14期　
　　粉葛与野葛分布广泛 、药用历史悠久 ,始载于
《神农本草经 》,列为中品 ,历代本草均有记载 。具
有解肌退热 、生津 、透疹 、升阳止泻的功效 ,临床多用
于外感发热头痛 、项背强痛 、消渴 、麻疹不透 、热痢 、
泄泻 、高血压等症[ 1] 。 2005年版 《中华人民共和国
药典 》中分别列出豆科植物野葛 [ Puerarialobata
(Wild.)Ohwi]和粉葛即甘葛藤(Puerariathomsoni
Benth.)两项 。其主要有效成分为葛根素 、大豆苷 、
大豆苷元等异黄酮类化合物 ,现代药理研究表明其
具有调节血液循环系统 ,减慢心率 ,降低外周阻力 ,
改善缺血心肌代谢 ,抗心律失常等功效[ 2] 。
中药指纹图谱是目前已被国内外广泛接受的一
种天然药物质量评价模式 。目前粉葛与野葛的
HPLC指纹图谱研究[ 3-6]大多采用对照品比对法标
定峰位 ,以相对保留时间和相对峰面积为主要指标
进行评定 ,但都停留于化学成分分布的定性相似度
(夹角余弦法)评价上 ,未能揭示药材各指纹成分的
多指标含量特征 。多指标定量相似度研究报道不
多 ,定量相似度限度与质量的相关性范围尚不明
确 [ 7-8] 。
本实验采用 “指纹对照品对照法 ”(由典型对照
药材或典型的代表性样品 ,按指纹图谱标准建立的
方法与条件制备出具有代表性的提取物 ,并以其为
多指标对照品进行指纹图谱测定的方法)[ 9 -10] ,在
同时约定指纹对照品和色谱系统适用性条件的基础
上 ,以随行测得的指纹对照图谱为参比 ,从化学成分
分布定性和多指标定量两方面评价不同产地粉葛与
野葛药材及其相似度 。
指纹图谱的定性相似度采用常用的夹角余弦
(cosθ)算法:
cosθ= ∑
n
i=1xiyi
∑ni=1x2i ∑
n
i=1y2i
(1)
以指纹对照品为参照 , 利用相对欧氏距离法
(relativeEucliddistance, Red)表示指纹图谱的多指
标定量差异 ,则具有良好的定量相关性。
Red= ∑
n
i=1(xi-yi)2
∑ni=1y2i
(2)
由式 1可知 ,供试药材与对照药材的夹角余弦
值(0 ～ 1)越接近于 1定性相似程度越高 。由式 2
可知 ,供试药材与对照药材的相对欧氏距离(0 ～
∞)越接近于 0定量相似程度越高。
粉葛与野葛中异黄酮化合物的总量也是定量相
似性的重要指标 ,其测定多采用 UV法[ 11-12] 。由于
药材中其他共存成分在葛根素最大吸收波长(250
nm)处也有吸收而干扰测定 ,未经显色的单波长及
三波长测定法的准确度较差 [ 13] 。葛根素等异黄酮
化合物不能与 Al3+络合在碱性条件下显色 ,因而也
不适合用 Al(NO3)3 -NaNO2 -NaOH显色法进行测
定[ 14] 。本研究根据粉葛与野葛中异黄酮类化合物
均含有酚羟基 ,可与 Folin-phenol试剂反应显色的性
质[ 15-16] ,建立了粉葛与野葛异黄酮总量的 Folin-
phenol试剂比色测定法 ,较之其他方法能更准确地
测定总异黄酮含量 。
材　　料
AgilentHP1100 LC VWD色谱系统(美国安
捷伦科技公司);UV 2401 PC紫外-可见分光光度
仪(日本岛津公司)。甲醇 、乙醇 、甲酸 、磷酸 、盐酸 、
碳酸钠 、碳酸氢钠 、钨酸钠 、钼酸钠 、硫酸锂 、溴试液
均为分析纯试剂(南京化学试剂厂);实验用水为自
制二次重蒸水 。粉葛与野葛药材分别于 2005 -
2007年购自广西 、广东 、四川 、安徽 、湖南等地 ,由南
京师范大学生命科学院龚祝南教授鉴定 ,结果见表
1。葛根素 (110752-200511)、大豆苷元 (111502-
200402)对照品均购自中国药品生物制品检定所。
表 1　粉葛与野葛药材来源
样品号　 产地 品种
1 广西-1 Puerariathomsonii
2 广西-2 Puerariathomsonii
3 广西-3 Puerariathomsonii
4 广东 Puerariathomsonii
5 安徽 Puerariathomsonii
6 湖北 Puerariathomsonii
7 浙江 Puerariathomsonii
8 河南 Puerariathomsonii
9 云南 Puerariathomsonii
10 四川 Puerariathomsonii
11 湖南 Puerariathomsonii
12 江苏 Puerariathomsonii
13 安徽 Puerarialobata
14 陕西 Puerarialobata
15 广东 Puerarialobata
方法与结果
　粉葛与野葛指纹图谱的建立
.　色谱条件
AgilentTC-C18色谱柱(250mm×4.6mm, 5μm);
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甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度程序洗脱:0 min
(20% A)※30min(30%A)※60min(90% A);流速
1.0mL·min-1;柱温 40℃;检测波长 254nm。
　供试品溶液
精密称取粉葛与野葛药材粗粉 0.5g,加 80%
乙醇 20mL,称定重量 ,浸透并超声处理 10min后 ,
于 80℃水浴中加热回流提取 30min,放冷 ,再称定
重量 ,用 80%乙醇补足减失重量 ,摇匀 ,滤过 ,精密
移取续滤液 2mL至 5mL量瓶中 ,蒸馏水稀释至刻
度 ,摇匀 ,即得。
　对照品溶液
精密称取葛根素 、大豆苷元对照品适量 ,以甲醇
为溶剂制成分别含葛根素约为 400mg·L-1 ,大豆苷元
约为 100mg·L-1的溶液 ,作为对照品储备液。分别精
密吸取上述对照品储备液适量 ,用 20%甲醇定量稀
释制成分别含葛根素约为 80mg·L-1 ,大豆苷元约为
20mg·L-1的溶液 ,即得。对照品色谱图见图 1。
图 1　葛根素(a)和大豆苷元(b)对照品 HPLC图
1.4　指纹图谱建立
为考察分析方法的可靠性 ,在 “ 1.1”项的条件
下以广西-1粉葛为供试品 ,进行稳定性 [取同一供
试品溶液 ,分别在不同时间(0, 1, 2, 4, 8 , 12 , 24, 36,
48 , 72h)检测 ] 、精密度(取同一供试品溶液连续进
样 6次)与重复性(取同一批样品分别制备 6份供
试品溶液进行测定)试验。结果 ,各共有峰的相对
保留时间和相对峰面积的 RSD,在稳定性试验中分
别小于 0.28%和 3.48%;精密度试验中分别小于
0.27%和 2.78%;重复性试验中分别小于 0.21%和
2.96%;符合指纹图谱标准的要求 。测定 15批粉葛
与野葛药材供试品溶液 ,经比较分析后确定野葛药
材共有峰 20个 ,粉葛药材共有峰 11个 。图 2和 3
为典型粉葛与野葛药材 HPLC指纹图谱 。选择主要
特征有效成分葛根素峰为参照峰(S峰),分别计算
各共有峰的相对保留时间(α)和相对峰面积(AR)。
经 SPSS聚类分析 ,结果见图 4。可见 3批野葛药材
与 12批粉葛药材具有明显差别 。
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　特征指纹成分含量测定
2.1　线性关系考察
分别精密吸取 “ 1.3”项下对照品储备液适量 ,
用 20%甲醇定量稀释制成葛根素浓度约为 20 , 40,
80 , 120, 160, 200mg·L-1 ,大豆苷元浓度约为 5, 10,
20 , 30, 40, 50mg·L-1的溶液 ,在 “ 1.1”项色谱条件下
测定峰面积积分值 ,以峰面积积分值(S)为纵坐标 、
浓度(C, mg·L-1)为横坐标进行线性回归 ,得葛根
素 、大豆苷元的回归方程分别为:S=83.30C+
4.835, r=0.999 8;S=112.8C+16.10, r=0.999 9。
葛根素与大豆苷元浓度分别在 20.0 ～ 200和 5.0 ～
50.0mg·L-1内线性关系良好。
2.2　回收率考察
精密称取已测知葛根素 、大豆苷元含量的样品适
量 ,分别加入与样品中已知量相当的对照品后照
“1.2”项下方法制备回收率测定用样品溶液 ,平行 6
份 ,在 “1.1”项色谱条件下测定。 6次平均回收率及
RSD分别为葛根素 96.9%, 0.91%;大豆苷元 100.4%,
1.54%。回收率与精密度符合中药质量控制的要求。
　样品测定
按 “ 1.2”项下方法制备供试品溶液 ,在 “1.1”项
色谱条件下测定 ,以外标法计算 12批粉葛和 3批野
葛样品中葛根素 、大豆苷元的含量 ,并以葛根素为替
代对照分别估算各样品中其它特征指纹成分的含
量。结果见表 2,粉葛药材中主要异黄酮成分的含
量明显低于野葛样品中的含量。
表 2　粉葛与野葛异黄酮 HPLC指纹成分的含量 mg·g-1
峰号a 粉　　葛 野葛
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 x±s 13 14 15 x±s
1 0.050 0.045 0.026 0.032 0.056 0.044 0.061 0.063 0.040 0.016 0.018 0.019 0.039±0.017 — — — —
2 — — — — — — — — — — — — — 0.45 0.22 0.20 0.29±0.14
3 0.026 0.023 0.031 0.022 0.032 0.022 0.029 0.041 0.021 0.041 0.026 0.059 0.031±0.011 0.52 0.20 2.03 0.92±0.98
4 — — — — — — — — — — — — — 2.84 1.42 0.48 1.58±1.19
5 — — — — — — — — — — — — — 4.08 2.18 2.81 3.02±0.97
6 0.021 0.019 0.093 0.021 0.046 0.051 0.045 0.047 0.051 0.091 0.059 0.130 0.056±0.033 1.11 0.67 1.45 1.08±0.39
7 — — — — — — — — — — — — — 0.56 0.31 0.59 0.49±0.15
8(s) 3.04 3.02 3.23 3.44 3.03 3.03 3.05 4.36 3.11 4.89 2.95 3.58 3.39±0.62 31.66 30.25 42.39 34.77±6.64
9 — — — — — — — — — — — — — 5.70 7.11 7.65 6.82±1.01
10 — — — — — — — — — — — — — 0.90 0.42 2.28 1.20±0.97
11 0.20 0.18 0.33 0.43 0.26 0.03 0.10 0.41 0.26 0.32 0.19 0.33 0.25±0.12 5.43 3.00 9.63 6.02±3.35
12 0.42 0.39 0.75 0.50 0.55 0.61 0.49 0.76 0.30 0.94 0.36 0.57 0.55±0.19 10.08 6.24 4.66 6.99±2.79
13 0.20 0.19 0.16 0.16 0.16 0.24 0.22 0.25 0.16 0.25 0.11 0.18 0.19±0.04 0.87 0.31 0.25 0.48±0.34
14 — — — — — — — — — — — — — 1.26 1.01 0.61 0.96±0.33
15 0.13 0.11 0.20 0.21 0.14 0.03 0.07 0.13 0.17 0.13 0.12 0.21 0.14±0.05 1.25 0.45 0.85 0.85±0.40
16 0.21 0.21 0.22 0.20 0.22 0.25 0.22 0.32 0.22 0.41 0.14 0.15 0.23±0.07 1.97 1.59 1.49 1.68±0.25
17 — — — — — — — — — — — — — 1.60 0.61 0.27 0.83±0.69
18 — — — — — — — — — — — — — 1.02 0.33 0.48 0.61±0.36
19 0.58 0.51 0.28 0.62 0.37 0.29 0.41 0.53 0.32 0.55 0.25 0.19 0.41±0.15 1.42 0.53 1.67 1.21±0.60
20 — — — — — — — — — — — — — 0.57 1.27 0.47 0.77±0.44
21 0.110 0.095 0.062 0.190 0.078 0.065 0.085 0.079 0.059 0.095 0.053 0.043 0.085±0.039 0.41 0.45 0.15 0.34±0.16
　　a:峰号 8(s)代表葛根素 , 19代表大豆苷元
　粉葛与野葛指纹图谱相似度评价
3.1　相似度评价方法
选择广西-3粉葛药材 ,照 “ 1.2”项下方法 ,制备
取样量分别为规定量的 20%, 50%, 80%, 100%,
120%, 150%, 200%的供试品溶液样本。即所构建
的各模型样品相对保留时间和相对峰面积都完全一
致 ,仅是各特征指纹成分的含量存在差异 。以
100%模型样本为参照 ,计算其他各模型样本与参照
的定性相似度(cosθ)和定量相似度(Red)。表 3结
果表明 ,即使化学成分分布完全一致(cosθ=1.0)的
样本 ,它们间的质量也可能存在显著的差异;相对欧
氏距离值(Red)可准确地反映样本之间多元指纹特
征成分的整体含量差异程度。同时以夹角余弦
(cosθ)为定性相似度指标 、以相对欧氏距离值(Red)
为定量相似度指标 ,能够准确地利用指纹图谱对照标
准进行复杂中药质量更为合理有效的评价与控制。
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　ChineseJournalofNewDrugs2008, Vol.17No.14 中国新药杂志 2008年第 17卷第 14期　
表 3　模型样本的相似度
含量 /% 样品号 cosθ Red
20 1 1.00 0.80
50 2 1.00 0.50
80 3 1.00 0.20
100 4a 1.00 0.00
120 5 1.00 0.20
150 6 1.00 0.50
200 7 1.00 1.00
　　a:指纹对照样本
3.2　相似性分析结果
对 “2.3”项下所测得 3批野葛药材和 12批粉
葛药材样本的指纹图谱分别以平均值法建立共有模
式 ,以夹角余弦法和相对欧氏距离法分别进行定性
和定量相似度计算 ,分析确定最接近共有模式的药
材为指纹对照品。广西 -3粉葛和安徽野葛分别被
确定为粉葛和野葛指纹对照品 。以指纹对照品图谱
为参照 ,分别计算各药材样本与参照之间的定性相
似度(cosθ)和定量相似度(Red)。结果见表 4。
表 4　不同粉葛与野葛药材的相似度计算结果
样品类型 样品号 共有模式为参照 指纹对照为参照cosθ Red cosθ Red
粉葛 1 0.997 2 0.120 3 0.989 6 0.153 6
2 0.998 2 0.122 3 0.990 5 0.152 5
3b 0.996 7 0.088 7 1.000 0b 0.000 0b
4 0.996 3 0.090 6 0.991 3 0.149 1
5 0.999 7 0.105 4 0.997 8 0.095 7
6 0.996 2 0.133 4 0.993 9 0.128 9
7 0.998 7 0.112 5 0.993 2 0.132 2
8 0.999 6 0.290 7 0.997 2 0.346 8
9 0.997 7 0.113 0 0.991 3 0.140 9
10 0.999 3 0.487 5 0.997 6 0.506 1
11 0.998 2 0.150 9 0.993 3 0.154 3
12 0.996 8 0.095 2 0.996 7 0.120 7
野葛 13a 0.992 1 0.135 6 1.000 0a 0.000 0a
14 0.996 0 0.156 2 0.987 7 0.169 7
15 0.993 4 0.245 2 0.973 5 0.387 0
　　a:野葛指纹对照样本 , b:粉葛指纹对照样本
粉葛与野葛虽同为药用葛根属植物 ,但它们的
指纹图谱和含量测定结果表明二者差异较大。以夹
角余弦法和相对欧氏距离法分别考察粉葛与野葛的
定性相似度(cosθ)和定量相似度(Red),结果见表
5。虽然指纹共有峰不尽相同 ,但二者的 cosθ值仍
均 >0.9,说明种间特征指纹成分分布仍具相似性;
而 Red值则体现出种间特征指纹成分含量的显著
差异。显然 , Red值具有更好的区分度 。
表 5　粉葛与野葛药材种间的相似度计算结果
样品类型 样品号 野葛指纹对照 粉葛指纹对照cosθ Red cosθ Red
粉葛 1 0.943 7 0.914 9 0.989 6 0.153 6
2 0.944 6 0.915 9 0.990 5 0.152 5
3b 0.966 8 0.899 5 1.000 0b 0.000 0b
4 0.949 9 0.902 9 0.991 3 0.149 1
5 0.958 6 0.914 0 0.997 8 0.095 7
6 0.953 0 0.914 7 0.993 9 0.128 9
7 0.949 0 0.914 8 0.993 2 0.132 2
8 0.958 6 0.876 7 0.997 2 0.346 8
9 0.946 8 0.914 1 0.991 3 0.140 9
10 0.959 0 0.906 6 0.997 6 0.506 1
11 0.950 8 0.918 3 0.993 3 0.154 3
12 0.959 6 0.861 6 0.996 7 0.120 7
野葛 13a 1.000 0a 0.000 0a 0.966 8 9.355
14 0.987 7 0.169 7 0.965 8 8.556
15 0.973 5 0.387 0 0.963 6 12.31
　　a:野葛指纹对照样本 , b:粉葛指纹对照样本
　粉葛与野葛异黄酮含量比色测定
4.1　对照品溶液制备
精密称取葛根素对照品适量 ,加 80%乙醇溶解
并定量稀释制成葛根素浓度为:0.12, 0.16, 0.20,
0.24, 0.32, 0.40g·L-1的溶液 ,即得。
4.2　供试品溶液与空白溶液制备
照 “ 1.2”项下方法制备。
4.2.1　Folin-phenol试剂[ 17] 　取 20g钨酸钠和 5 g
钼酸钠置 500mL圆底烧瓶中 ,加入 140mL蒸馏水 、
10mL85%磷酸和 20 mL浓盐酸 ,加热使缓缓煮沸
回流 10h后加入 30g硫酸锂 、10mL蒸馏水和几滴
液溴 ,煮沸 15min以除去过量溴 ,如溶液仍有绿色 ,
需再加几滴液溴 ,重新煮沸 ,冷却并以蒸馏水稀释至
200mL,过滤 ,滤液置棕色瓶中保存 。此溶液加 3倍
蒸馏水稀释 ,即得。
4.2.2　pH10缓冲液　取 0.2mol·L-1无水碳酸钠
溶液 42.5 mL, 加 0.2 mol·L-1碳酸氢钠溶液 7.5
mL,并加蒸馏水稀释到 200mL。
4.2.3　5%碳酸钠溶液　5 g碳酸钠溶于 100 mL
水中 。
4.3　线性关系
取 10mL量瓶 6个 ,分别精密加入不同浓度的
葛根素对照品溶液 1mL,加蒸馏水 1.5mL和 pH10
缓冲液 2mL,混匀 ,加 Folin-phenol试剂 0.7 mL,混
匀 ,放置 3min,加 5%碳酸钠溶液 1mL,摇匀 ,蒸馏
水定容 , 70℃水浴 20min,冷却至室温 ,放置 10min,
以相应的溶液 (不含对照品)为空白 ,在 750 nm波
长处测定吸收度(A)。结果表明 ,葛根素浓度(C)
在 12.0 ～ 40.0mg·L-1范围 ,线性关系良好 。回归
—1244—
　ChineseJournalofNewDrugs2008, Vol.17No.14 中国新药杂志 2008年第 17卷第 14期　
方程为:A=0.016 60C+0.132 0, r=0.999 5。
4.4　比色测定
精密量取供试品溶液 0.5mL置 10mL量瓶中 ,
加 80%乙醇至 1mL,照 “4.3”项下方法 ,自 “加蒸馏
水 1.5mL”起同法操作 ,测定吸收度 ,以空白溶液同
法操作所得为参比 ,按标准曲线法计算 ,即得。典型
吸收曲线见图 5。
1野葛药材;2粉葛药材;3葛根素对照品;4试剂空白
图 5　Folin-phenol试剂显色后的吸收曲线
12批粉葛样品中异黄酮的含量分别为 19.52,
19.64, 19.58, 36.68, 20.96, 19.46, 17.59, 25.30,
15.78, 26.20, 19.21和 21.20 mg·g-1 , 平均值为
(21.76±5.52)mg·g-1;3批野葛样品中异黄酮含量
分别为 143, 106和 151mg·g-1 ,平均值为(133.31±
24.02)mg·g-1。结果表明 ,野葛的异黄酮含量明显
高于粉葛 ,不同产地的药材所含异黄酮量略有差异 。
.　精密度和重复性试验
以广西 -1粉葛为供试品 ,进行精密度(取同一
供试品溶液连续测定 6次)与重复性 (取同一批供
试品 ,平行制备 6份供试品溶液 ,分别测定)试验 。
结果 ,精密度试验和重复性试验中 RSD分别为
2.64%和 3.60%,表明精密度和重复性均良好 。
.　回收率试验
精密称取已测知异黄酮含量的样品适量 ,分别
加入与样品中已知量相当的葛根素对照品后照
“1.2”项下方法制备回收率测定用样品溶液 ,平行 6
份 。分别精密量取上述溶液各 0.5mL置 6个 10mL
量瓶中 ,加 80%乙醇至 1mL,照 “4.3”项下方法 ,自
“加蒸馏水 1.5mL”起同法操作 ,测定吸收度 ,以空
白溶液同法操作所得为参比 ,按标准曲线法计算总
异黄酮含量 , 并计算回收率。 6次平均回收率为
101.1%, RSD为 2.06%,表明回收率良好 。
讨　　论
粉葛与野葛异黄酮成分提取时 ,由超声预处理
时间 、提取溶剂含醇量 、提取温度 、提取时间 4因素
设计正交试验 ,并对试验结果进一步优化。结果表
明 ,随着提取溶液中乙醇比例升高 (20% ～ 90%),
大豆苷元等极性较小的异黄酮成分提取效率明显提
高 ,葛根素等极性较大的异黄酮成分提取效率变化
不大 ,最终采用 80%乙醇溶液 ,粉葛与野葛药材中
异黄酮成分提取能快速而完全溶解平衡 。
比较了不同酸度 (0.05% ～ 0.4%甲酸溶液;
0.05%和 0.1%磷酸溶液;0.5%乙酸溶液),不同梯
度方法以及不同填料色谱柱的液相色谱系统(Agi-
lentTC-ODS, LichrospherODS, InertsilODS, Phe-
nomenexCurosil-PFP)。结果表明 ,在 0.1%甲酸梯度
HPLC色谱条件下 ,出峰数目较多 ,分离度好 ,响应值
高 ,基线漂移幅度较小。在选定的反相色谱梯度条件
下 ,色谱填料对各成分峰之间的分离影响较小。
已有文献报道 [ 18-19]中多以平均值或中位数法
建立指纹图谱共有模式 ,并直接以其为参照进行相
似度计算 ,没有考虑色谱条件变化不易重现的问题。
本实验在以平均值法所建立的指纹图谱共有模式为
参照的基础上 ,从已有样本中选择出最接近共有模
式的粉葛与野葛药材作为指纹对照品 ,采用同时约
定色谱系统和指纹对照品的方法进行相似度计算 ,
可以大大提高指纹图谱的重复性和耐用性 [ 9 -10] 。
粉葛与野葛异黄酮类物质紫外吸收较强 ,通常
以葛根素为对照品 ,在 250nm波长下直接用紫外分
光光度计法测定含量[ 11-12] ,但很多化合物在此波长
下都有一定的吸收而影响了该法测定的准确度。利
用 Folin-phenol试剂在碱性条件下可被酚类化合物
还原生成磷钼蓝和磷钨蓝的蓝色混合物的特
性[ 15-16] ,对异黄酮类物质显色后在 750nm处进行
分光光度法测定 ,大大提高了测定的准确度。并比
较了不同试剂用量(0.3 ～ 0.8mL),不同水浴时间
(5 ～ 30min),不同水浴温度(50 ～ 90 ℃)对显色反
应的影响 ,考察了供试品和对照品显色后的稳定性
(5 ～ 60min)。结果表明 ,在本实验条件下 ,显色反
应完全 ,显色后 1h稳定性良好(RSD<0.5%)。
粉葛与野葛的 HPLC指纹图谱研究和总异黄酮
的含量测定已有文献报道[ 3-6, 11-12] ,但指纹图谱的
评定大都停留在化学成分分布的定性相似度评价
上。未能结合含量测定方法 ,从定量角度来比较不
同产地粉葛与野葛药材之间的差异。中药成分复
杂 ,且有效成分的含量差异大 ,由结果可看出 ,夹角
余弦值反映的仅是中药化学成分分布的相似性 ,不
具备定量评价功能 ,即使定性相似度值达到 1.0的
样品 ,也可能存在很大的质量差异 。因此 ,仅从化学
成分相似性来评价不同来源药材之间的相似度显然
—1245—
　ChineseJournalofNewDrugs2008, Vol.17No.14 中国新药杂志 2008年第 17卷第 14期　
是不全面的 。相对欧氏距离值则可准确地反映样本
之间多元指纹特征成分的整体含量差异程度 ,具有
更好的区分度。在定性相似度良好(cosθ>0.9)的
基础上 ,进行定量相似度(Red)分析 ,可全面评价样
品与指纹对照品间的多指标定量相似性。如 ,当
Red≤0.2时 ,则样品总体含量值与指纹对照品间的
总体质量接近程度在 80% ～ 120%范围。本实验采
用外标法测定粉葛与野葛药材中葛根素和大豆苷元
的含量 ,并以葛根素为替代对照估算其他无对照品
的指纹成分的含量 ,然后采用相对欧氏距离计算定
量相似度 ,对药材的质量具有比较全面的评价 。粉
葛与野葛虽同为药用 ,但相似度计算和含量测定结
果表明 ,它们在化学成分分布和含量上均有较大差
异 ,聚类分析可将他们分为 2类 。因此 ,比较二者间
差异 ,建立各自专属性的指纹对照品 ,提供更加全
面 、准确和典型的信息对粉葛与野葛药材及其制剂
的质量控制是十分必要的 。
[作者简介 ] 　陈珺(1984 -), 女 , 硕士研究生。联系电话:
(025)83271090, E-mail:weiwei6207@sina.com。
[通讯作者 ] 　杭太俊(1963-),男 , 教授 , 硕士生导师 , 主要
从事现代药物分析研究。 联系电话:(025)83271090,
E-mail:hangtj@cpu.edu.cn。
[ 　参　考　文　献　]
[ 1] 　国家药典委员会.中华人民共和国药典 [ S] .2005年版.二
部.北京:化学工业出版社 , 2005:203, 233.
[ 2] 　陈荔炟,陈树和 ,刘焱文.葛根资源 、化学成分和药理作用研
究概况[ J] .时珍国医国药 , 2005, 17(11):2305-2306.
[ 3] 　石峰 ,司成桃, 陈卫 ,等.葛根药材及其提取物 HPLC指纹图
谱研究 [ J] .中国药学杂志 , 2006, 41(11):820-823.
[ 4] 　陈斌 , 刘训红 ,蔡宝昌.葛根高效液相色谱指纹图谱的研究
[ J] .时珍国医国药 , 2005, 16(5):384-385.
[ 5] 　郑一敏 ,胥秀英 ,傅善权.葛根总黄酮指纹图谱数据分析方法
探讨 [ J] .中国中药杂志 , 2005, 30(1):70-71.
[ 6] 　陈士林 ,陈四保 ,杨大坚 ,等.葛根高效液相指纹图谱的研究
[ J] .中草药 , 2003, 34(7):661-663.
[ 7] 　孙国祥,宋杨 ,毕雨萌 ,等.色谱指纹图谱全定性相似度和全定
量相似度质控体系研究 [ J] .中南药学, 2007, 5(3):263-267.
[ 8] 　孙国祥 ,侯志飞 ,张春玲 ,等.色谱指纹图谱定性相似度和定
量相似度的比较研究 [ J].药学学报 , 2007, 42(1):75-80.
[ 9] 　宋敏 ,杭太俊 ,张正行.丹参水溶性成分 HPLC指纹图谱指纹
对照品对照法的研究 [ J].中草药 , 2005, 36(3):360-364.
[ 10] 　宋敏 ,杭太俊 ,张正行.丹参脂溶性成分指纹图谱标准的对照
品对照法研究 [ J].药物分析杂志 , 2007, 27(1):8-12.
[ 11] 　张梦军 ,吴世容 ,李志良.几种提取葛根异黄酮的方法比较及
实验优化 [ J] .中成药 , 2005, 27(10):1133-1135.
[ 12] 　刘杏荣 ,董英 ,孙艳辉 ,等.葛根总黄酮的提取与 UV-TLC测
定 [ J] .食品研究与开发 , 2006, 27(10):126-129.
[ 13] 　董怀海 ,谷文英.三波长比色法测定大豆异黄酮的研究 [ J].
中国油脂 , 2002, 27(4):75-77.
[ 14] 　陈静 ,梅广 ,符昌雨.分光光度法测定总黄酮含量中存在问题
的研究 [ J] .食品科技 , 2007, (3):230-232.
[ 15] 　王强 ,罗集鹏.中药分析 [ M] .北京:中国医药科技出版社 ,
1999:353-353.
[ 16] 　徐礼燊 ,刘爱茹.葛根素比色测定法 [ J] .中草药通讯 , 1975,
(6):9-11.
[ 17] 　李云巧.实验室溶液制备手册 [ M] .北京:化学工业出版社 ,
2006:612-612.
[ 18] 　狄留庆, 刘圣金 ,赵晓莉 ,等.杜仲药材 HPLC指纹图谱及其
共有模式的建立 [ J].中草药 , 2007, 38(4):596-599.
[ 19] 　杨柳 ,许舜军 ,田润涛 ,等.白芍的高效液相色谱指纹图谱研
究 [ J] .药学学报 , 2007, 42(1):71-74.
编辑:周卓 /接受日期:2007-12-27
　(上接第 1239页)
二氧六烷 , 5%碳酸氢钠提取时分层极为困难 ,经过
我们的研究 ,改用在甲苯和三乙胺中进行反应 ,冷却
后过滤 ,滤液浓缩 、加水 、调 pH值 ,搅拌析晶的方
法 ,操作简便 ,收率比文献 [ 4]略高。
文献 [ 3] 以 4-(2-正丁氧基苯甲酰)氨基苯甲酸
2-(二乙胺基)乙酯的制备为例报道了该类化合物的
合成 ,文献 [ 4]也报道了该类化合物的通用合成方
法 。由于取代基的不同 ,化合物的性质明显变化 ,文
献报道的方法不再适用于 7的合成 ,本研究将文献
的溶剂吡啶改为甲苯 ,并加三乙胺中和氯化氢;后处
理进行了相应的改进 ,简化了操作;并增加了成盐酸
盐精制再碱化的过程 ,提高了化合物 7的质量 ,收率
由文献 [ 4]的 81%提高到 88.2%。经过改进和优
化后 ,总收率达 69.0%(以水杨酸乙酯计)。
[作者简介 ] 　李荣东(1966 -), 男 , 副研究员 , 主要从事药
物合成研究。联系电话:13787008996, E-mail:rongdongli@
yahoo.com.cn。
[ 　参　考　文　献　]
[ 1] 　林金坤 ,胡品津 ,王伟岸 ,等.奥替溴铵对腹泻型肠易激综合征
患者肛门直肠感觉运动功能的影响 [ J] .世界华人消化杂志 ,
2003, 11(12):1926-1928.
[ 2] 　袁耀宗 , 许斌 , 柯美云 , 等.奥替溴铵治疗肠易激综合征有效
性和安全性的研究 [ J].胃肠病学 , 2003, 8(5):279-282.
[ 3] 　GHELARDONIM, RUSSOF, PISANTIN, etal.p-(2-Alkyloxy-
benzoyl)-aminobenzoatesofn-dialkylamine-alkylandtheirquater-
narysalts:US, 3536723[ P] .1970-10-27.
[ 4] 　GHELARDONIM, PESTELLINIV, PISANTIN, etal.Quaternary
salteofsubstituted2-aminoethylN-benzoylaminobenzoate.Anew
classofsmoothmusclerelaxantagents[ J] .JMedChem, 1973, 16
(9):1063-1065.
编辑:王宇梅 /接受日期:2007-08-13
—1246—
　ChineseJournalofNewDrugs2008, Vol.17No.14 中国新药杂志 2008年第 17卷第 14期