全 文 ：第 31卷第 6期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vol.31, No.6
2009年 12月 ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis Dec., 2009
文章编号:1000-2286(2009)06-1160-06
喙荚云实种皮总黄酮的提取
及黄酮类型的初步鉴定
黄明堦1 ,陈燕丹 2 ,张福娣 1 ,魏道智 1＊
(1.福建农林大学 生命科学学院 ,福建 福州 350002;2.福建农林大学 材料工程学院 ,福建 福州 350002)
摘要:采用 L9(34)正交试验表进行试验 ,通过极差和方差分析优化确定喙荚云实种皮总黄酮的超声波 -乙醇
提取条件为:乙醇浓度 50%, 提取温度 80 ℃, 提取时间 60 min, 料液比 1∶15,提取次数为 3次 ,总黄酮的提取率
为 8.09%。通过喙荚云实种皮总黄酮提取物溶解性试验 、显色反应以及产品在不同诊断试剂中的紫外 -可见
吸收光谱等特征判断其基本结构类型 , 初步确定喙荚云实种皮中应含有具有 A-环邻位二羟基(6, 7或 7, 8-)
的二氢黄酮或二氢黄酮醇苷类化合物。
关键词:喙荚云实;超声波;黄酮;提取;鉴定
中图分类号:Q946.8;R284　　文献标识码:A
ExtractionofFlavonoidsfromtheSeedsCoatofCaesalpiniaminax
HanceandPreliminaryIdentificationofFlavonoidsType
HUANGMing-jie1 , CHENYan-dan2 , ZHANGFu-di1 , WEIDao-zhi1＊
　　(1.ColegeofLifeSciences, FujianAgricultureandForestryUniversity, Fuzhou350002, China;2.Col-
legeofMaterialEngineering, FujianAgricultureandForestryUniversity, Fuzhou350002, China)
　　Abstract:AccordingtoL9(34)orthogonalexperimentschemeandrangeandvarianceanalysis, thecon-
ditionsfortheoptimalultrasonicassisted-ethanolextractionoftheflavonoidsintheseedscoatofCaesalpinia
minaxHancewereestablishedasfolows:extractionforthreetimesusing50% ethanolastheextractionsol-
ventwithmaterialtoethanolratioof1∶15andextractionfor60minat80℃eachtime.Underthebestextrac-
tionconditions, theextractionrateoftheflavonoidsintheseedscoatofCaesalpiniaminaxHancewas8.09%.
Basedonthesolubilitytests, chromogenicreactionmethodandtheUV-visspectraoftheflavonoidsdissolved
indiferentdetectionreagents, thestructuretypesoftheflavonoidscanbepreliminaryidentifiedasakindof
flavanonewitho-dihydroxy(6 , 7 or7, 8)inringAorcompoundsofdihydro-flavonolglycosides.
Keywords:CaesalpiniaminaxHance;ultrasonic;flavonoids;extraction;identification
喙荚云实(CaesalpiniaminaxHance)为豆科(Leguminosae)云实属(Caesalpinia)植物喙荚云实(南蛇
勒)的种子 ,分布于华南及西南 ,生于海拔 400 ～ 1 500 m的山沟 、溪旁灌丛及路边 [ 1] 。喙荚云实药名苦
收稿日期:2009-09-08　　修回日期:2009-10-29
基金项目:福建省自然科学基金项目(08J0037)和福建农林大学青年教师科研基金项目资助(08B09)
作者简介:黄明堦(1976-), 男 ,实验师 , 硕士生 ,主要从事生物资源利用研究;E-mail:hmj7921@163.com;＊通讯
作者:魏道智 ,教授 , 博士 , E-mail:Weidz888@sohu.com。
DOI :10.13836/j.j jau.2009226
第 6期 黄明堦等:喙荚云实种皮总黄酮的提取及黄酮类型的初步鉴定
石莲 ,性凉 、味苦 ,有清热解毒 、化湿 、散瘀止痛功效 ,主治风热感冒 、痢疾 、淋浊 、痈肿 、跌打损伤等症[ 2] ,
在民间是治疗流感和肝炎等的常用药物。现代药理研究表明:喙荚云实具有抗病毒 、抑菌等多种生物活
性 [ 3 ～ 7] 。
黄酮类化合物是一大类天然产物 ,广泛存在于植物界 ,是许多中草药的有效成分 。大量研究表明黄
酮类化合物具有保肝 、抗病毒等多种生物活性 [ 8 ～ 10] 。对喙荚云实黄酮类化合物的研究 ,目前国内外文
献报道的寥寥无几。本实验首次通过正交试验考察了超声波辅助提取法从喙荚云实种皮中提取黄酮类
化合物的条件 ,并对喙荚云实种皮黄酮类化合物的结构类型进行初步鉴定 ,为进一步研究喙荚云实种皮
黄酮类化合物的化学成分和药理活性提供科学依据 。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
喙荚云实:购自河北安国药材市场 ,经福建农林大学生命科学学院生物科学系鉴定为豆科云实属植
物喙荚云实 (CaesalpiniaminaxHance)的种子。芦丁对照品 (上海融禾医药科技有限公司 , 批号
080616);盐酸 、硫酸为优级纯 ,其他试剂为分析纯(国药集团化学试剂有限公司),水为超纯水 。
1.2　仪器
Cary50紫外可见分光光度计(美国 VARIAN公司);AL204电子天平 [梅特勒 -托利多仪器(上海)
有限公司 ] ;KQ5200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HX-1050恒温循环器(北京博医康实
验仪器有限公司);RE52CS-1旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHB-II循环水式多用真空泵(郑
州长城科工贸有限公司);Eppendorf移液器(德国 EppendorfResearchfamil)。
1.3　试验方法
1.3.1　芦丁标准液的配制及标准曲线的绘制　精确称取干燥至恒重的芦丁对照品 10.0mg,用适量 φ=
60%乙醇水浴微热溶解 ,自然冷却后转移至 50 mL容量瓶中 ,摇匀定容 ,得 200 mg/L芦丁标准溶液。准
确吸取芦丁标准溶液 0.00, 0.50, 1.00, 2.00, 3.00, 4.00, 5.00 mL分置于 25mL容量瓶中 ,添加 φ=
60%乙醇至 12.5 mL;加入 5 g/LNaNO2溶液 0.75 mL,摇匀 ,静置 6 min;再加入 100g/LAl(NO3)3溶
液 0.75 mL,摇匀 ,静置 6 min;最后加入 40 g/LNaOH溶液 10mL,并用 φ=60%的乙醇定容至刻度 ,摇
匀静置 12 min后 ,以第 1瓶溶液为空白 ,在 508nm处测定吸光度 。绘制出吸光度 -浓度标准曲线 ,用
最小二乘法求出回归方程:
C=74.962 5A+0.194 9 (1)
(1)式中 , C单位为 mg/L,相关系数 r=0.999 8。
1.3.2　提取方法　将喙荚云实的种皮和子叶进行分离获得喙荚云实种皮 ,粉碎 ,过 40目筛 ,移入干燥
器备用 。准确称取 2.000 g样品 ,置于 100 mL圆底烧瓶中 ,加入一定量特定浓度的乙醇溶液 ,将其放入
超声波清洗器中进行超声波辅助提取 。提取液趁热抽滤后 ,转入 100mL容量瓶定容 。准确吸取一定
体积的提取液于 25 mL容量瓶 ,按 1.3.1法显色。以未加显示剂的待测液为空白 ,用分光光度计测定其
吸光度 ,通过回归方程计算出黄酮类化合物的浓度 。总黄酮提取率按下式计算:
提取率(%)=黄酮类化合物的浓度 ×稀释倍数 ×0.01/样品质量 (2)
1.3.3　正交实验　在乙醇浓度 、提取温度 、提取时间 、料液比等单因素试验的基础上 ,以乙醇浓度 、提取
温度 、提取时间 、料液比为分析因素 ,每个因素选择 3个水平(表 1),以黄酮类化合物提取率为考核指
标 ,采用 L9(34)正交试验表进行试验 ,通过极差和方差分析优化确定喙荚云实种皮总黄酮提取方法。
表 1　正交试验因素水平
Tab.1　Factorsandlevelsoforthogonalexperiment
水平 A(乙醇浓度)/% B(温度)T/℃ C(提取时间)t/min D(料液比)/m∶v
1 50 60 30 1∶5
2 60 70 45 1∶10
3 70 80 60 1∶15
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1.3.4　提取次数对提取效果的影响　准确称取 2.000 g喙荚云实种皮粉 ,按正交试验结果确定的提取
条件反复提取黄酮类化合物 7次 ,分析确定最佳提取次数 。
1.3.5　喙荚云实种皮黄酮产品的精制及纯度测试　准确称取 20.00 g喙荚云实种皮粉 ,按 1.3.4和 1.3.5
试验结果提取喙荚云实种皮黄酮类化合物 ,将得到的提取液趁热过滤 ,合并 ,减压蒸馏浓缩至约 200 mL,
用 600 mL石油醚分 3次萃取 ,除去脂溶性物质 ,下层清液继续浓缩至约 20 mL后用 φ=95%乙醇反复
醇沉[ 11] ,除去多糖 、蛋白质等杂质 ,滤液减压蒸干后真空干燥 24h,研碎后得细小颗粒状黄酮产品。称
量后精确称取适量产品用 φ=60%乙醇溶解 、定容 ,按 1.3.2法测定产品纯度。重复试验 2次。
1.3.6　产品的溶解性　准确称取一定量精制后的喙荚云实种皮黄酮提取物 11份 , 1份暴露于空气中 ,
其余 10份分别用相同体积的不同介质进行溶解性试验 ,观察现象 。
1.3.7　显色反应　称取适量精制后的喙荚云实种皮总黄酮提取物 ,用适当的溶剂溶解 ,分置于试管后
加入相关试剂 ,根据颜色 、荧光等反应现象判断某化学成分的纯在 ,具体操作参见文献 [ 12 ～ 14] 。
1.3.8　紫外 -可见光谱分析 [ 15] 　将喙荚云实种皮黄酮提取物的甲醇溶液在 200 ～ 600 nm波长范围内
进行吸收光谱扫描 ,然后在比色杯中加入 3滴 2 mol/LNaOH水溶液 ,混匀后测定 “样品 +NaOH”图谱。
为检验样品是否分解 , 5 min后再测定 1次。测完后另取 1份喙荚云实种皮黄酮甲醇溶液 ,加入 6滴
50 g/LAlCl3甲醇溶液 ,混匀后测定 “样品 +AlCl3 ”图谱 ,然后再加入 3滴浓度为 12%的盐酸溶液 ,混匀
后测定 “样品 +AlCl3 +HCl”图谱 。测完后另取 1份喙荚云实种皮黄酮甲醇溶液 ,加入粉末状无水
NaAc直到杯底出现 2 mm厚沉淀为止 ,混匀后测定 “样品 +NaAc”图谱 , 5 min后再测定 1次 ,然后加入
无水粉状 H3BO3(加入量约为 NaAc的 50%),混匀后测定 “样品 +NaAc+H3BO3 ”图谱。
2　结果与分析
2.1　正交实验结果
表 2　L9(34)正交试验结果
Tab.2　ResultsofL
9
(34)orthogonalexperiment
实验号 A B C D 总黄酮提取率 /%
1 1 1 1 1 3.70
2 1 2 2 2 5.05
3 1 3 3 3 5.92
4 2 1 2 3 3.94
5 2 2 3 1 3.90
6 2 3 1 2 4.42
7 3 1 3 2 3.40
8 3 2 1 3 3.33
9 3 3 2 1 3.94
K1 14.68 11.04 11.46 11.55 ∑ =37.62
K2 12.27 12.29 12.93 12.88
K3 10.68 14.29 13.23 13.19
k1 4.89 3.68 3.82 3.85
k
2 4.09 4.10 4.31 4.29
k3 3.56 4.76 4.41 4.40
R 1.33 1.08 0.59 0.55
　　L9(34)正交试验结果如表 2,方差分析结果见表 3。由表 2的极差值 R和表 3的方差分析结果可以
看出:4种因素对喙荚云实种皮黄酮类化合物提取率的影响程度依次为:A>B>C>D,即乙醇浓度 >提
取温度 >提取时间 >料液比 ,乙醇浓度影响显著。本法提取喙荚云实种皮黄酮类化合物的最佳方案为
A1B3C3D3 ,即乙醇浓度为 50%,提取温度为 80℃,提取时间为 60 min,料液比为 1∶15。
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第 6期 黄明堦等:喙荚云实种皮总黄酮的提取及黄酮类型的初步鉴定
图 1　提取次数对提取效果的影响
Fig.1　Influenceofextractiontimesonextractionresult
表 3　方差分析
Tab.3　Thevarianceanalysis
方差来源 偏差平方和 自由度 方差 F 显著性
A 2.706 2 1.353 5.36 显著
B 1.787 2 0.894 3.54
C 0.598 2 0.299 1.18
D 0.505 2 0.252
E 0.505 8 0.252
2.2　提取次数的确定
按上述 A1B3C3D3 方案进行超声提取 ,
结果见图 1。由图 1可知 ,超声波法提取次
数越多 ,黄酮累计提取率就越高 ,但提高幅度
降低;经过 3次提取后 ,提取率达到 8.09%
(n=3 , RSD=1.79%), 继续增加提取次数 ,
提取率增加不大 ,所以确定提取次数为 3次。
2.3　精制后黄酮产品的纯度
经石油醚萃取和反复醇沉精制后的黄酮
产品总黄酮含量为 56.5%和 57.2%,平均纯
度 56.8%。
2.4　物理性质
精制后的喙荚云实种皮黄酮提取物为棕色细小颗粒 ,易潮解 ,易溶于甲醇 、乙醇 、稀 NaOH溶液和
水 ,微溶于丙酮 、正丁醇 ,难溶于乙醚 、乙酸乙酯 、石油醚 、氯仿。一般的黄酮苷元难溶或不溶于水 ,易溶
于甲醇 、乙醇 、乙酸乙酯 、乙醚及稀碱溶液 ,而喙荚云实种皮黄酮提取物具有较大的水溶性和较小的脂溶
性 ,说明提取物可能属于黄酮的糖苷 [ 12 ～ 14] 。这是由于黄酮的糖苷增加了极性基团(-OH),因而增加
了在水中的溶解度 ,减小了在有机溶剂中的溶解度 。
2.5　显色反应结果
试验 1.3.7的结果见表 4 ,由表 4结果可知 ,喙荚云实种皮中含有的黄酮成分可能是分子中具有邻
二酚羟基 、邻位羟基或羰基等的二氢黄酮或二氢黄酮醇类化合物。
表 4　显色反应结果
Tab.4　Resultsofchromogenicreaction
反应类型 现象 结果分析 [ 12～ 14]
可见光下 橙黄色 含有各类黄酮类化合物
紫外光下 灰黄色 含有各类黄酮类化合物
氯化铝反应　可见光下 黄色 含有分子中有邻二酚羟基 、
氯化铝反应　紫外光下 黄绿色荧光 邻位羟基或羰基等的各类黄酮类化合物
氨水反应　可见光下 棕黄色 含有各类黄酮类化合物
氨水反应　紫外光下 灰黄色 含有各类黄酮类化合物
浓硫酸反应 橙红色 含有各类黄酮类化合物
氢氧化钠反应 橙色 ,放置后呈深红色 不含花色素 , 可能含有二氢黄酮 、二氢黄酮醇类化合物
碳酸钠反应 橙色 ,放置后呈深红色 不含花色素 , 可能含有二氢黄酮 、二氢黄酮醇类化合物
硼氢化钠反应 变红色 可能含有二氢黄酮 、二氢黄酮醇类化合物
盐酸 -镁粉反应 上升泡沫呈浅红色 可能含有一般黄酮 、黄酮醇 、二氢黄酮 、或二氢黄酮醇等
三氯化铁反应 蓝黑色 含有与氢键缔合的羟基的各类黄酮类化合物
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 31卷
图 2　样品在不同诊断试剂中的吸收光谱
Fig.2　UV-visabsorptionspectrumoftheproductindiferentdiagnosticreagents
　　注:①样品的甲醇液;②样品的甲醇液 +NaOH;③样品的甲醇液 +NaOH(5分钟后);④样品的甲醇液 +AlCl3;⑤
样品的甲醇液 +AlCl
3
+HCl;⑥样品的甲醇液 +乙酸钠;⑦样品的甲醇液 +乙酸钠(5分钟后);⑧样品的甲醇液 +乙
酸钠 +硼酸。
2.6　产品的紫外 -可见图谱解析
按 1.3.8的操作方法 ,测定了喙荚云实种皮黄酮提取物的甲醇溶液及加入各种诊断试剂后的紫外
-可见光谱 ,结果见图 2,图谱解析见表 5。
表 5　产品的吸收光谱数据分析
Tab.5　Dataanalysisoftheabsorptionspectrumfortheproduct
诊断试剂 UV(λmax/nm) 结论 [ 12～ 15]
MeOH 280,无带Ⅰ吸收峰 二氢黄酮 、二氢黄酮醇或异黄酮类
NaOMe 290, 随时间强度降低 样品分解速度快 , 有 A-环邻位二羟基
AlCl3 285 带Ⅱ红移 5nm, 有 A-环邻位二羟基(6, 7或 7, 8-)
AlCl3 /HCl 280 无 5-OH
NaAc 280, 随时间强度降低 样品分解 ,有碱敏感集团存在 ,如 6, 7或 7, 8-二羟基
NaAc/H3BO3 285 带Ⅱ红移 5nm, 有 A-环邻位二羟基(6, 7或 7, 8-)
　　综上 ,喙荚云实种皮中应含有具有 A-环邻位二羟基(6, 7或 7, 8-)的二氢黄酮 、二氢黄酮醇或异
黄酮类化合物。
3　结　论
国产云实属植物资源丰富 ,初步估测云实属果实产藏量约为 3.0×107 kg,喙荚云实产藏量约为 6.42×
10
6 kg,仅次于云实 ,是一种有待于进一步研究开发的新药源 [ 1] 。超声波辅助提取喙荚云实种皮的优选
条件为乙醇浓度 50%,提取温度 80 ℃,提取时间 60 min,料液比 1∶15,提取次数为 3次 ,总黄酮的提取
率为 8.09%,精制后黄酮产品的纯度为 56.8%。余旭亚等 [ 16]采用甲醇为提取剂浸提喙荚云实(南蛇
勒)黄酮类化合物 ,提取条件为水浴温度 25℃,甲醇浓度 70%,提取时间 48 h,固液比 1∶40,总黄酮提
取率为 0.706%。与该法相比 ,本法具有毒性小 、提取时间短 、提取剂用量少 、提取率高等优点 。通过系
列溶解性 、显色反应实验以及产品在不同诊断试剂中的紫外 -可见光谱数据分析初步鉴定喙荚云实种
皮中应含有具有 A-环邻位二羟基(6, 7或 7 , 8-)的二氢黄酮或二氢黄酮醇苷类化合物 ,这为喙荚云实
种皮中黄酮提取物结构的确定提供有力的理论依据 ,也为进一步开发利用喙荚云实黄酮资源提供了有
益的参考。对喙荚云实种皮中黄酮产品的进一步分离 、纯化及结构鉴定等还有待进一步的研究 。
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第 6期 黄明堦等:喙荚云实种皮总黄酮的提取及黄酮类型的初步鉴定
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