全 文 ：收稿日期:　2008-01-08　　　修订日期:　2008-02-29基金项目:　国家自然科学基金(30471230);国家科技支撑计划(2006BAD16B04-1)＊通讯作者 E-mail:yuanqinghua@hotmail.com
苜蓿抗褐斑病基因 ISSR标记的筛选及验证
孟　芳1 , 2 , 　袁庆华2＊ , 　苏德荣1 , 　高建明3
(1.北京林业大学森林培育教育部重点实验室 , 北京　100083;　2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 ,
北京　100193;　3.天津农学院 , 天津　300384)
摘要　运用 ISSR分子标记技术和 BSA 法 , 对四倍体紫花苜蓿(Med icago sativa L.)F 1 代进行抗褐斑病基因连锁的
分子标记筛选。结果表明 ,在 93 个随机引物中 , 有 32 个引物能够产生清晰稳定的扩增条带 , 其中 6 个引物在中抗
杂交 F1 代 、高抗 、高感各 12单株所组成的抗 、感 DNA 池间出现差异性条带。随后 , 对此 6个标记进行单株检验 ,结
合均值差检验法 ,结果显示 20-R750 与苜蓿褐斑病的抗病基因紧密连锁 , 11-S750 与苜蓿褐斑病感病的基因紧密连
锁 ,研究结果为紫花苜蓿抗褐斑病的鉴定和分子标记辅助抗病育种提供了依据。
关键词　苜蓿;　褐斑病;　ISSR标记;　均值差检验法
中图分类号　S 432.21 , Q 78
Selection and validation of ISSR markers of common leaf spot
disease resistance-related gene in tetraploid alfalfa
M eng Fang1 , 2 , 　Yuan Qinghua2 , 　Su De rong1 , 　Gao Jianming 3
(1.Key Laboratory o f Forest Breed of Bei jing Forestry Univ ersity , Bei jing　100083 , China;
　2.I nstituteo f Animal S ciences , CAAS , Beij ing　100193 , China;
　3.Tianjin Agricultura l College , Tianjin　300384 , China)
Abstract　Inte r-simple sequence repeats (ISSR)we re employed to de tect mo lecular marker s linked to the resistance
gene o f common leaf spot in F1 of the alfalfa(Medicago sativa), accompanied with BSA.The results show ed tha t 32
of the 93 ISSR prime rs tested could amplify clear and steady bands , and in the F1 o f mode rate resistance , the re was
6 ISS R primers that could amplify po lymorphic bands be tw een resistant and susceptible DNA pools composed o f 12
highly resistant plants and highly susceptible plants.Subsequently , the 6 ISSR marke rs w ere verified in sing le
plants , and 20-R750 was found to be significantly asso ciated with the r esistance in F1 progenies , and 11-S750 was
found to be significantly asso ciated w ith the susceptibility in F1 progenie s.These results are the basis for molecular
marker-a ssisted selection and identification of disease r esistance va rieties.
Key words　alfalfa;　common leaf spot;　ISSR marker s;　mean difference test
　　由苜蓿(Medicago sat iva L.)假盘菌[ P seudo-
pez iza medicag inis (Lib.)Sacc.]引起的苜蓿褐斑
病是一种世界性的病害 ,常常造成牧草产量的较大
损失[ 1-2] ,此病几乎遍布世界所有苜蓿种植区 。对于
牧草病害的防治 ,现在全世界都在向抗病育种的方
向努力 ,普遍认为这是病害防治的最有前途的方
法[ 3] 。然而抗病育种的关键性一步就是抗病材料的
鉴定和筛选。但对于四倍体的紫花苜蓿 ,其群体高
度杂合 ,抗病选育较困难 ,传统的田间病情调查筛选
工作量大 ,耗时长 ,难以高效率地筛选出大量抗性种
质 ,要提高选择的效率 ,最理想的方法是能够直接对
基因型进行选择 ,分子标记为实现对基因型的直接
选择提供了可能[ 4] 。
ISSR(inte r-simple sequence repeat)分析方法
是 Zietkiew icz等在 SSR即微卫星标记基础上发展
起来的一种新技术[ 5] ,具有较好的重复性和稳定性 ,
已应用于很多抗性基因的分子标记研究 , 如甜菜
(Beta vulgaris L .)抗根腐病[ Fusarium culmorum
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研 究 报 告
(W.G.Smith)Sacc.] [ 6] ,大豆抗孢囊线虫(Hetero-
dera g ly cine Ichinohe)[ 7] , 小麦(Tri ticum aesti-
vum)抗叶锈病(Puccinia recond ite f.sp.t ri t ici)[ 8]
等。本研究将采用 ISSR分子标记技术 ,结合集群分
离分析法(bulked seg regant analy sis , BSA)[ 9] 对褐
斑病抗性基因进行分子标记筛选 ,初步确定几个与
褐斑病抗性基因连锁的分子标记 ,以实现对苜蓿褐
斑病抗性的单株鉴定 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
根据袁庆华等对伊鲁瑰斯(Medicago sat iva L.
cv.Iroquois)、萨兰斯(Medicago sat iva L .cv Sara-
nac)、沙湾(Medicago sat iva L.cv.Shaw an)、沙河
(Medicago sat iva L.cv.Shahe)和泾阳(Medicago
sat iva L.cv.Jingyang)5个苜蓿品种的离体叶筛选
研究[ 10] ,每品种筛选出最抗和最感各 5株 ,并通过
无性扦插扩繁单独收种 ,本试验在此基础上将 5 品
种的抗 、感单株育苗 ,进一步通过田间病情调查筛选
出以下 16株:
高抗材 料 6 株 , 分 别 为伊 鲁 瑰 斯 2 株
(YL0601R 、 YL0602R), 泾 阳 2 株 (JY0601R 、
JY0602R),沙湾 2 株(SW0601R 、SW0602R), 依次
将其编号为 1 、2 、3 、4 、5 、6。
高感材料 6 株 , 分别为沙河 3 株(SH0601S 、
SH0602S 、 SH0603S), 萨 兰 斯 3 株 (SL0601S 、
S L0602S 、S L0603S),依次编号为 7 、8 、9 、10 、11 、12。
中抗材 料 4 株 , 分 别 为伊 鲁 瑰 斯 2 株
(YL0601M 、YL0602M), 沙 河 2 株(SH0601M 、
SH0601M),依次编号为 A 、B 、C 、D。
对上述 16株材料建立杂交组合 ,其中高抗×高
抗组合 6个 ,分别为 1×3 、2×6 、3×2 、4×5 、6×4;
高感×高感组合 6 个 ,分别为 7×9 、7×11 、8×11 、
9×11 、10×11 、11×12;中抗×中抗组合 4 个 ,分别
为 A×B 、B×D 、C×A 、D×C;并通过人工授粉套袋
单独收种 。本试验在此基础上将各杂交组合 F1 代
育苗 ,中抗×中抗每组合育苗 200株 ,高抗×高抗 、
高感×高感每组合育苗 60株 。
苜蓿假盘菌(Pseudopeziz a medicaginis)菌种
采自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所生长 6年
的苜蓿试验地 ,经室内分离纯化扩繁后 ,接种于保定
苜蓿上 ,活体保存备用 。
ISSR随机引物为上海生物工程公司合成 , Taq
DNA聚合酶购自 TaKaRa公司 ,dNTP 购自北京汇
天东方公司 ,去离子甲酰胺购自上海生物工程公司 。
1.2　方法
1.2.1　育苗
育苗方法参考马鸿文等的苜蓿幼苗培养的方
法[ 11] 。中抗 ×中抗每组合育苗 150 株 ,高抗×高
抗 、高感×高感每组合育苗 60株。
1.2.2　活体菌株覆盖接种法
参照袁庆华的方法[ 12] ,并做适当改动。取分离
纯化扩繁后的苜蓿病叶 ,选择发病较严重的叶片 ,将
其放在铺有滤纸的白瓷盘上 ,4 ℃保湿 24 h 后 ,将白
瓷盘倒扣在为需要接种的材料搭的架子(高度
40 cm)上 ,盖上塑料布 ,喷水保湿 72 h ,温度 25 ℃,
湿度 100%。然后将接种的苜蓿叶片移去 ,接种幼
苗进行正常管理 。20 d后 ,进行病情调查 。
1.2.3　病情测定及筛选
将每单株的所有叶片根据以下分级标准进行分
级 ,并计算单株病情指数。
0级:无病斑;
1级:小叶病斑数 1 ～ 3个;
2级:小叶病斑数 4 ～ 6个;
3级:小叶病斑数 7 ～ 10个;
4级:小叶病斑数 11 ～ 15个;
5级:小叶病斑数 16个以上;
根据病情分级标准 ,单株的病情指数计算公
式为:
病情指数 =
∑(各级病叶数 ×该级代表数值)调查总叶数 ×发病最高级的代表数值 ×100;
　　高抗×高抗组合 ,选择长势良好 、发病程度最
低 、综合性状差异大的 3个组合中的单株进行 DNA
提取。
高感×高感组合 ,选择长势良好 、发病程度高 ,
综合性状差异大的 2 个组合中的单株进行 DNA
提取。
中抗×中抗组合 ,选择长势良好 、单株间发病程
度差异最大的 、综合性状差异大的 1个组合 ,选择其
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中出现抗病性分离的高抗和高感单株各 12株 ,大量
提取 DNA ,用来构建抗 、感病 DNA 池 。
1.2.4　DNA提取及定量
苜蓿基因组 DNA 提取采用改进 CTAB法[ 13] 。
用 0.8%琼脂糖凝胶对 DNA质量进行电泳检测 ,并
以一定浓度 λDNA 作为定量参照标准 , 将各单株
DNA 浓度定为 10 ng/μL , -20 ℃保存备用。
1.2.5　抗 、感病 DNA 池的建立
对中抗×中抗组合 ,从中挑选出现抗病性分离
的 12个高抗单株 ,将其 DNA 等量混合 ,构建抗病
DNA 池 ,从中挑选出现抗病性分离的 12个高感单
株 ,构建感病 DNA 池。
1.2.6　ISSR-PCR扩增与产物检测
ISSR扩增反应体系和反应程序参照王瑜等[ 14]
的方法。扩增结束后 ,取 7.5 μL PCR 扩增产物与
1.5 μL 6×Loading Buf fer(TaKaRa)混匀 ,点入含
0.5 μg/mL EB的 2%琼脂糖凝胶中 ,在 5 V/cm 电
场强度下电泳 1 ～ 2 h , 取出凝胶 , 紫外灯下观察
照相 。
1.2.7　ISSR标记的筛选和验证
采用 BSA 法 ,首先用抗 、感病 DNA 池对 ISS R
引物进行筛选 ,挑选在抗 、感 DNA 池间能够产生特
异性条带的引物 ,再用构建抗 、感 DNA 池的单株所
在群体(包含建立 DNA 池的各单株)以及高抗×高
抗杂交 F1 代 3个组合中病情指数小 、高感×高感杂
交 F1 代 2个组合中病情指数高的单株对挑选出的
引物进行验证 ,每组合挑选 25个单株。
2　结果与分析
2.1　接种鉴定筛选
根据对 F1 代田间接种鉴定筛选的结果 , 中
抗×中抗保留的组合为 A×B(由于移栽造成一些
植株的死亡 ,最后调查总株数为 103株),对该群体
的病情指数进行统计分析 , 符合正态分布(Mu=
11.963 Sigma=5.6905)(图 1)。从 A×B 组合中
挑选出了病情指数小于 6.67 的 12 个单株建立抗
病 DNA 池 ,病情指数大于 28.57 的 12 个单株建
立感病 DNA 池。高抗×高抗最终保留的 3个组合
分别为 4×5 、2×6 、1×3 ,从 3 个组合中各挑选出
了病情指数小于 8.57 的 25 个单株用于验证 。高
感×高感保留的 2 个组合分别为 10 ×7 和 11 ×
12 ,从 2 个组合中各挑选出了病情指数大于 15.55
的 25个单株用于验证 。
2.2　ISSR标记的筛选
对 93个 ISSR引物进行扩增 ,结果表明 ,有 32个
引物有扩增产物(占 34.41%),在 300 ～ 2 000 bp之
间 ,其中6个引物能在混合抗 、感 DNA池间出现特异
性条带(占 18.75%),依次为 9 、11 、20、21 、818 、866号
引物。6个引物的碱基序列 、退火温度及在抗 、感
DNA池间扩增的特异性条带大小见表 1。
图 1　A×B群体病情指数概率分布图
表 1　6 个 ISSR引物退火温度及标记大小
引物 序列 抗性 DNA池/ bp
感性DNA
池/ bp
退火温
度/ ℃
9 AGAGAGAGAGAGAGAGAA 920 - 52
11 ACGACGACGACGACGACG - 750 50
20 AGAGAGAGAGAGAGAGCT 750 - 52
21 AGAGAGAGAGAGAGAGCG 430 - 52
818 CACACACACACACACAG 680 - 52
866 CTCCTCCTCCTCCTCCTC - 800 50
2.3　单株验证
上述筛选出的引物标记根据其扩增出特异性条
带的大小 ,分别命名为 9-R920 、11-S750 、20-R750 、
21-R430 、818-R680 、866-S800。对从抗 、感 DNA 池
中筛选出来的 6个 ISSR引物 ,首先采用均值差检验
法[ 4] ,用构建抗 、感 DNA 池的群体即 A×B 群体进
行 T 检验 ,结果见表 2。20-R750 与苜蓿褐斑病的
抗病基因紧密连锁(p<0.05), 11-S750与苜蓿褐斑
病感病的基因紧密连锁(p<0.05),且 t 值越大 ,表
明连锁越紧密 ,标记离 Q TL 越近 。图 2为 21-R430
在 A ×B群体部分单株中的扩增图谱 。
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表 2　6个标记在 A×B群体中的检验结果1)
标记 单株数量 病情指数平均值
T 检验
T p
9-R920 - 58 12.62
+ 45 11.00 1.365 >0.05
11-S750 - 46 9.77
+ 47 13.73 3.730 <0.05
20-R750 - 56 13.17
+ 47 10.53 2.452 <0.05
21-R430 - 59 12.68
+ 44 10.99 0.131 >0.05
818-R680 - 63 12.30
+ 40 11.43 0.756 >0.05
866-S800 - 52 10.49
+ 51 13.52 1.980 >0.05
　1)+表示能检测到该标记 , -表示未检测到该标记。
图 2　21-R430 在 A×B群体部分单株中的扩增图谱
用高抗×高抗杂交 F1 代 3个组合中各 25个单
株 ,高感×高感杂交 F 1 代 2 个组合各 25个单株对
20-R750 、11-S750 进行进一步的验证(表 3 ),结果
20-R750在 75 个高抗单株中有 72 个能扩增出
750bp的特异 DNA 条带 ,11-S750在 50个高感单株
中有 38个单株能扩增出 750bp 的特异 DNA 条带 ,
且经过χ2 检验 ,结果与在 A×B 群体检验相符 ,即
20-R750 、11-S750 分别与苜蓿褐斑病的抗 、感病的
基因紧密连锁(p<0.05)。图 3 为 11-S750号引物
在高抗×高抗 、高感×高感杂交 F1 代部分单株中的
检验结果 。
表 3　20-R750 与 11-S750 在抗 、感单株中的检验结果1)
单株来源 数量/株
11-S750
+ -
20-R750
+ -
高抗×高抗 75 36 39 72 3
高感×高感 50 38 12 26 24
合计 125 74 51 98 27
χ2 检验 χ2=9.74 , p<0.05 χ2=39.38 , p<0.05
　1)+表示能检测到该标记 , -表示未检测到该标记。
3　讨论与结论
本试验应用 ISSR 技术 、BSA 法以及均值差检
验法 ,在对 93个随机引物进行筛选过程中 ,有 32个
引物能够产生清晰稳定的扩增条带 ,其中 6 个引物
在中抗杂交 F 1 代高抗 、高感各 12单株所组成的抗 、
感 DNA 池间产生差异性条带。随后 ,对此 6个标记
进行单株检验 ,结果显示 20-R750与苜蓿褐斑病的
抗病基因紧密连锁(p<0.05), 11-S750与苜蓿褐斑
病感病的基因紧密连锁(p<0.05),这两个标记可以
用于紫花苜蓿抗褐斑病基因的 DNA 分子标记
鉴定。
图 3　11-S750 号引物在高抗×高抗 、高感×高感
杂交 F1 代部分单株中的检验结果
表 3中显示抗性标记 20-R750 在抗 、感单株检
验时 ,在 75个抗性单株中有 72个单株有此标记 , 3
个单株没有此标记 ,而感性标记 11-S750在 50个感
病单株中有 38个有此标记 ,12个单株无此标记 ,这
表明这两个标记分别与苜蓿褐斑病抗 、感病基因存
在连锁 ,但并非完全连锁 ,同时也表明苜蓿抗褐斑病
基因不是由单基因控制的 ,属于多基因控制。
对于筛选出的 20-R750和 11-S750 两个标记 ,
可以对其进行挖带 、克隆 、测序 ,并根据测序结果设
计更长的寡核苷酸引物对 ,将其转化为SCA R标记 ,
以提高试验的重复性和稳定性 。由于紫花苜蓿异花
授粉 ,且自交不亲和 ,难以建立 F 2 自交群体 ,可建立
BC1对转化的 SCAR标记进行扩增 ,计算该标记与
Q TL 的遗传距离 ,为 Q TL 的精确定位 、建立分子标
记辅助育种体系提供依据 。
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收稿日期:　2007-11-16　　　修订日期:　2008-04-09基金项目:　新疆维吾尔自治区科技攻关和重点项目(200231107);新疆现代化畜牧业试验示范项目办资助＊致　　谢:　在调查过程中得到张大伟 、陈坤等同学的帮助 ,在此表示由衷的感谢 !＊＊通讯作者 zlym57@sohu.com
紫苜蓿叶象甲寄生蜂种群数量消长初步研究＊
朱晓锋 , 　赵　莉＊＊
(新疆农业大学农学院 , 新疆草地资源与生态实验室 , 乌鲁木齐　830052)
摘要　以呼图壁种牛场苜蓿生产基地为主要观测点对紫苜蓿叶象甲幼虫 、寄生性天敌消长规律以及幼虫寄生率的
调查分析表明:在苜蓿生长期紫苜蓿叶象甲及苜蓿叶象啮小蜂共出现 3 个高峰期;春季紫苜蓿叶象甲发生初期 , 越
冬代苜蓿叶象啮小蜂大量出现 , 夏秋 2 季随寄主数量的增加而增加;确定紫苜蓿叶象甲的优势寄生蜂为苜蓿叶象啮
小蜂[ Tetrastichus incertus(Ratzeburg)] ;寄生性天敌对苜蓿叶象甲幼虫起着重要的控制作用 , 寄生率在 5.10%～
78.95%之间 , 年平均为 30.55%。
关键词　苜蓿叶象甲;　寄生性天敌;　苜蓿叶象啮小蜂;　种群消长
中图分类号　S 435.4
Preliminary analysis of population dynamics of the parasitic natural
enemies of the alfalfa weevil , Hypera postica
Zhu Xiao feng , 　Zhao Li
(Collegeo f A gronomy , Laboratory o f Grassland Resources and Ecology , X injiang
Agricultural University , Urumqi　830052 , China)
Abstract　The popula tion dynamics o f the lar vae of the alfa lfa weevil H ypera postica(Gyllenha l)and their pa rasitic
natural enemies and par asitism rates o f the a lfalfa weevil larvae we re analy zed.The results showed tha t three popula-
tion peaks o f Tetrastichus incertus and the alfalfa weevil occurred in alfa lfa fields during the w hole g row th stag e of al-
falfa.In spring , the population of T.incertus w as la rge at the initial stag e o f emergency o f the alfalfa larv ae , in-
creasing with the inc rease o f their ho st in summer and fall.The dominant para sitoid of alfalfa weevil w as T.incer-
tus.The parasitic natural enemies play an impo r tant ro le in contr olling the alfalfa w eevil.The par asitic rates to a lfal-
fa weevil larvae range from 5.10% to 78.95%, with an average rate of 30.55%.
Key words　alfalfa w eevil;　para sitic na tural enemy;　Tetrastichus incertus;　population dynamics
　　在新疆 ,紫苜蓿叶象甲[ Hypera post ica (Gyl- lenhal)]是苜蓿的主要害虫 ,初孵幼虫潜食叶芽延缓
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