全 文 ：收稿日期:2007-05-17;修回日期:2008-01-13
基金项目:国家自然科学基金(30471230)
作者简介:王瑜(1981- ),女 ,山东人 ,在读博士研究生 , 已发表
论文 1篇.
文章编号:1673-5021(2008)03-0065-04
苜蓿褐斑病抗性基因 ISSR标记研究
王 瑜1 ,袁庆华1 ,高建明2
(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 ,北京 100094;2.天津农学院 ,天津 300384)
摘要:运用 ISS R分子标记技术 ,结合集群分离分析法对 5 个苜蓿品种进行褐斑病抗性基因的分子标记研究。
结果表明 ,在 65 个 ISSR引物中 , 40 个引物能够产生清晰稳定的扩增条带 , 其中 11 个引物在 5 个品种所组成的混合
抗 、感病 DNA 池间产生特异性条带。在 5个品种的抗 、感病 DNA 池间对 11 个 ISS R标记进行验证 , 发现能够同时
在 3 个以上苜蓿品种抗 、感病 DNA池间稳定存在的标记为 4 个。
关键词:苜蓿;褐斑病;ISSR 标记
中图分类号:S432.2 文献标识码:A
苜蓿褐斑病是苜蓿最常见和破坏性较大的病害之
一 ,几乎遍布世界所有苜蓿种植区。抗病遗传资源的
利用及抗病育种是世界公认的植物病害防治最有前途
的方法 ,而抗病育种的关键是抗病材料的鉴定和筛选。
传统的基于田间病情调查的表型筛选工作量大 ,耗时
长 ,难以高效率地筛选出大量抗性种质。要提高选择
的效率 ,最理想的方法是能够直接对基因型进行选择 ,
分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能[ 1] 。
桂枝等[ 2] 采用 RAPD技术对苜蓿褐斑病抗性基因进行
分子标记研究 ,从 160个随机引物中筛选出 8个与抗
病性相关的多态性条带。ISSR与 RAPD相比具有较
好的稳定性和试验重复性 ,已广泛用于抗性基因的分
子标记研究 ,如:甜菜抗根腐病[ 3] 、大豆抗孢囊线虫[ 4] 、
小麦抗叶锈病[ 5] 等。本研究采用 ISSR分子标记技
术[ 6] ,结合集群分离分析法(Bulked Segregant Analysis ,
BSA)[ 7] 对褐斑病抗性基因进行分子标记研究 ,初步确
定几个与褐斑病抗性基因连锁的分子标记 ,为建立苜
蓿褐斑病的分子标记辅助选择(MAS)育种技术体系 、
抗病基因的定位克隆以及更深入的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
袁庆华等[ 8] 对伊鲁瑰斯(Medicago sativa
L.cv.Iroquois)、萨兰斯(Medicago sativa L.cv.
S aranac)、沙湾(Medicago sativa L.cv.Shaw an)、
沙河(Medicago sat iva L.cv.Shahe)和泾阳(Med i-
cago sat iva L.cv.Jingyang)5个苜蓿品种的离体叶
进行筛选 ,每品种筛选出最抗株和最感株各 5株 ,并
通过无性扦插扩繁单独收种。本试验在此基础上将
5个品种最抗和最感单株的后代培育成株系 ,每品
种抗 、感各 5个株系 ,每株系育苗 100株。
苜蓿假盘菌 [ Pseudopeziza medicaginis (Lib.)
Sacc.]菌种采自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
生长6年的苜蓿试验地 ,经室内分离纯化扩繁后接种
于保定苜蓿上 ,隔离小区内活体保存备用。
ISSR引物由上海生物工程公司合成 ,Taq DNA 聚
合酶为 TaKaRa 产品 , dNTP购自北京汇天东方公司 ,
去离子甲酰胺购自上海生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 育苗
先将苜蓿种子经 0.1%升汞消毒 3min ,然后用
无菌水冲洗 4次 ,放在消毒培养皿的滤纸上 ,加适量
灭菌水以保持种子吸水膨胀 ,放入 20℃生长箱 ,发
芽至幼根长到 1cm 长时移植到装有蛭石和草炭(比
例为 1∶2)的塑料盆中 ,花盆规格为 5cm ×7cm(直
径×高度),每品种育 5个抗病株系和 5 个感病株
系 ,每株系育苗 10盆 ,每盆 10株 ,接种根瘤菌后 ,放
入温室 ,温度控制在 15 ～ 25℃。
1.2.2 接种鉴定
采用活体整株接种法。待幼苗长至 40d ,将褐
斑病发生严重的保定苜蓿枝条覆盖在供试苜蓿材料
上 , 盖塑料布 , 高度 15 ～ 20cm , 温度 25℃, 湿度
100%,喷水保湿 72h ,然后将覆盖的苜蓿枝条移去 ,
接种幼苗进行正常管理 。20d后进行病情调查:0级
为无病斑;1级为小叶病斑数 1 ～ 3个;2级为小叶病
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第 30 卷 第 3 期 中 国 草 地 学 报 2008 年 5 月
Vo l.30 No.3 Chinese Journal of G ra ssland May 2008
斑数 4 ～ 6个;3级为小叶病斑数 7 ～ 10个;4级为小
叶病斑数 11 ～ 15个;5级为小叶病斑数 16个以上 。
根据病情 ,计算单株的病情指数 ,计算公式:
病情指数= (各级病叶数×该级代表数值)调查总叶数×发病最高级的代表数值×100
1.2.3 DNA提取及定量
苜蓿基因组 DNA 提取采用改进 CTAB 法[ 9] 。
用 0.8%琼脂糖凝胶对 DNA质量进行电泳检测 ,并
以一定浓度λDNA 作为定量参照标准 , 将各单株
DNA 浓度定为 10 ng/μL , -20℃保存备用 。
1.2.4 品种抗 、感病 DNA 池和混合抗 、感病 DNA
池的建立
对每一品种 ,从其抗病株系中挑选出 10高抗单
株(病情指数为 0),将其 DNA 等量混合 ,建立该品
种的抗病 DNA 池;从其感病株系(病情指数大于
30)中挑选 10 高感单株 ,建立该品种的感病 DNA
池;依此分别建立 5个品种的抗 、感病 DNA 池 。将
5个品种抗病池 DNA 等量混合 , 建立混合抗病
DNA 池;5个品种感病池 DNA 等量混合 ,建立混合
感病 DNA池 。
1.2.5 ISSR-PCR扩增与产物检测
ISSR扩增反应体系和反应程序见文献 10。扩
增结束后 , 取 7.5μl PCR 扩增产物与 1.5μl 6 ×
Loading Buf fe r(TaKaRa)混匀 , 点入含 0.5μg/mL
EB的 2%琼脂糖凝胶中 ,在 5V/cm 电场强度下电
泳 1 ～ 2h ,取出凝胶 ,紫外灯下观察照相。
1.2.6 ISS R标记的筛选
采用 BSA 法 ,首先用混合抗 、感病 DNA 池对
ISSR引物进行筛选 ,挑选在混合抗 、感病池间能够
产生特异性条带的引物 ,再用品种抗 、感病 DNA 池
对筛选出的引物进行验证 , 保留在品种抗 、感病
DNA 池间仍能稳定出现差异性条带的 ISSR引物 。
2 结果与分析
对 65个 ISSR引物进行扩增的结果表明 , 40个
引物有扩增产物(占 61.54%),其中 11个引物在混
合抗 、感病 DNA 池间产生特异性条带(占 27.5%)。
在混合抗病 DNA 池中产生特异性条带的引物有 7
个 ,依次为 2 、9 、10 、18 、21 、834 、836号引物 ,在混合
感病 DNA 池中产生特异性条带的引物有 4 个 ,依
次为 6 、19 、22 、818号引物。
随后 ,对筛选出的 11个 ISSR引物在 5个品种的
抗 、感病 DNA池间进行验证 ,能够同时在 3个以上苜
蓿品种抗 、感病 DNA池间产生特异性条带的引物为 3
个。3个引物的碱基序列见表 1。它们在 5个苜蓿品
种抗 、感材料间的特异性扩增结果见表 2;22号和 834
号引物的 ISSR电泳图谱见图1。
表 1 ISSR引物及其 PCR 扩增情况
Table 1 The primeres of ISSR and the results of PCR amplif ication
引物
Primer
序列 5′-3′
Sequ ence
扩增位点
Total si tes
多态性位点
Polymorphic sites
多态位点百分率(%)
Percen tage of polym orphic sites
6 ACACACACACACACACTC 9 7 77.78
22 TCTCTCTCTCTCTCTCCC 7 4 57.14
834 AGAGAG AGAGAGAGAGYT 8 5 62.50
总计 24 16 66.67
3个引物扩增谱带的总数为 24条 ,其中多态
带为 16 条 ,占总扩增片段的 66.67%;每个引物
扩增所得的条带数平均为 8 条 ,多态性位点在 4
～ 7条 ,多态频率为 57.14%～ 77.78%;扩增所
得 DNA 片段的分子量在 300 ～ 1500bp ,且在特
定位点所表现出的 DNA 多态性的稳定程度较
好 。
3 讨论与结论
由于苜蓿属于异花授粉植物 ,在长期的人工栽
培和选育过程中发生了遗传物质的交流 ,品种混杂
程度大 、遗传组成的变异也较大 ,所以 ,在用同一引
物对 5个不同品种抗 、感病 DNA 池进行扩增时 ,得
到的共有片段较少 ,片段共享度较低 ,产物间表现出
很大的差异 ,多态百分率高(表 1),提高了筛选 IS-
SR标记的难度 。因此 ,我们首先建立 5个品种的混
合抗 、感病 DNA 池 ,可将混合抗 、感病 DNA 池看成
一对近等基因 DNA 池 ,其仅在目标区域上不同 ,而
整个遗传背景是相同的 ,在这两个池间表现出多态
性的 DNA 标记 ,就有可能与目标基因连锁 ,降低了
筛选 ISSR标记的难度。由混合抗 、感病 DNA 池筛
选出的 ISSR引物 ,还需要在每个品种抗 、感病DNA
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中国草地学报 2008年 第 30 卷 第 3 期
表 2 与褐斑病抗性基因连锁的 ISSR标记
Table 2 ISSR markers linked to resistance gene of
common blot
品种
Populat ion
引 物 Primer
6 22 22 834
伊鲁瑰斯 R — — — 450bp
伊鲁瑰斯 S 640bp — 660bp —
萨兰斯 R — — — 450bp
萨兰斯 S 640bp — 660bp —
沙 河 R — — — —
沙 河 S 640bp 450bp — —
泾 阳 R — — — —
泾 阳 S 640bp 450bp 660bp —
沙 湾 R — — — 450bp
沙 湾 S 640bp 450bp 660bp —
注:R表示抗性材料;S 表示感性材料。
Note:R means resis tant m aterial s , S means sensit ive materials.
池间进行验证 ,只有混合抗 、感病 DNA 池中产生的特
异性条带能够同时在 3个以上品种抗感病池间稳定
出现的标记才可能是与目标基因连锁的标记。本研
究中 ,在混合抗感病池间能够产生特异性条带的引物
有 11个 ,其中3个引物所产生的 4条特异性条带能
够在 3个以上品种抗 、感病池间稳定出现 ,初步判断
这 4个标记有可能与褐斑病抗性基因连锁。
在筛选出较理想的 4 个 ISS R标记后 , 一方
面应该建立 F 2 分离群体 ,采用同样的引物对 F 2
代植株进行扩增 , 以验证各 ISS R标记的可靠程
度以及与目的基因间的遗传距离 ;另一方面回收
ISS R标记的特异性条带 , 进行克隆 、测序 , 设计
用于做 SCAR标记的引物 , 提高试验的重复性和
稳定性 。
1R.伊鲁瑰斯抗;2R.萨兰斯抗;3R.沙河抗;4R.泾阳抗;5R.沙湾抗;
1S.伊鲁瑰斯感;2S.萨兰斯感;3S.沙河感;4S.泾阳感;5S.沙湾感。
Note:M.Marker;1R.Iroquois R;2R.Saran ac R;3R.Sh ahe R;4R.Jingyang R;
5R.Shaw an R;1S.Iroqu ois S;2S.Saranac S;3S.Shahe S;4S.Jingyang S;5S.Shaw an S.
图 1 不同引物对 5个品种抗 、感病 DNA 池的扩增结果
Fig.1 Amplified r esults o f different primer in susceptible and resistant DNA pools o f five alfalfa cultivar s
—67—
王 瑜 袁庆华 高建明 苜蓿褐斑病抗性基因 ISSR标记研究
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WANG Yu
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(1.Insti tute o f Animal S ciences , CAAS , Beij ing 100094 ,China;
2.Tianj in Agricultural Col lege , Tianj in 300384 , China)
Abstract:Molecular markers linked to the resistant gene of brow n blot in 5 alfalfa varieties we re studied
based on ISSR combined wi th BSA.The results show ed that 40 of 65 ISSR primers could amplify clear and
steady bands , and 11 primers could amplify distinctive bands betw een resistant and suscept ible DNA pools
composed o f 5 va rieties of alfalfa.After that the 11 marke rs w ere verified betw een resistant and susceptible
DNA poo ls of 5 varie ties of alfalfa and 4 markers existing steadily in more than 3 varie ties of alfalfa w as
found.T hese 4 ISSR marker s w as linked to the resistant gene of brow n blot.
Key words:Alfalfa;Brown blot;ISS R markers
—68—
中国草地学报 2008年 第 30 卷 第 3 期