全 文 ：上海农业学报 198 9 , 5 ( 1 ) : 31一 3 6
A e t a 卫夕 r该e “ I t “ r a e S h a n 夕h a f
赤豆叶肉原生质体愈伤组织再生植株 `
黄培铭株 葛扣麟
(复旦大学遗传研究所 , 上海 )
摘 要 来源于赤豆叶肉细胞原生质体的愈伤组 织 , 在含有 3m g l/ 2 , 4一D和 0 . Zm g l/ 6侣 A 的
D , 或 M S培养基上 扩增培养约 3个月 ,随后 , 转移到含有 o . l m g 1/ I A 人 、 0 . 2坦 g l/ N人 A 和 s m g l/
6一 B A 或无生长素而含有 l m g / 1 6一 B A 的M S固体培养基上分化长出了嫩绿的小芽 , 但在前一培养
基中分化出的小芽不能进一步发育 。 当在后一培养基中分化出的芽长至 3一 5厘米时 , 将其从愈
伤组织上切下 , 转移至无激素的 M S 减半培养基 , 或含 l m g / 1 I A A 的 M S 固体培养基中 , 经过
一星期的培养均诱导出了根 , 从而形成了完整的植株 。
关健词 豆科植物 ; 赤豆 ; 原生质体愈伤组织 ; 植株再生
引 言
自从 C oc k i n g 〔 ’ ]首次用酶法成功地分离制备番 茄苗根尖原生质体以来 , 植物原生质体技
术作为一项新型的细胞工程技术迅速地得到发展 。 由于植物原生质体不具备细胞壁 , 很容易
摄取外来的遗传物质— D N A 和细胞器等 , 因 此 , 它是植物基因程工中的良好受体 ; 又 由于原生质体在一定条件下可以诱导融合而形成体细胞杂种 , 从而克服远缘杂交种间的不亲和
性 , 所以它为植物细胞杂交和遗传育种开辟了新的广阔前景 。 目前 , 在国际上对植物原生质
体培养和应用的研究 日渐深入 , 特别是对具有重要经济价值的种子植物的研究更多 , 但进展
缓慢 。 豆科植物作为种子植物之一 , 其重要性不亚于禾本科植物 , 而且豆科植物能与根瘤菌
共生固氮 , 人们期望能转移其 固氮基因 , 以造福于人 类 。 因此七十年代初期 , 人们开始加强
对豆科植物原生质体的培养研究 。 1 9 8 0 年 K a o 和 M i e h a y l u k [ 2 ]首次报道了首借 (M e d i c a夕。
as :t’ 洲 )叶肉原生质体培养再生植株的研究 。 迄今 , 在豆科植物中能分离培养原生质体并分化
成功的种类很少 [ 3 ] ,且大多数都局限于三叶草 ( T r i f o l i 、 。 ) t ` ’ 5 ’ 日 ] 、 首着 ( M e d i c a 习。 ) [ ” 8 ” ’ 。 , ’ 。 ]
等非籽粒用豆科植物 ,对于栽培型籽粒用豆科植物未见有成功的报道 。 赤豆 (尸h o se ol “ : 。 ng -
“ l a r `s )属于豆科植物菜豆属 , 在菜豆属中只有绿豆 ( P . a u r e u s )〔` ’ ] 、 硬毛菜豆 ( P . 二 u n 夕。 ) [ ` “ ]
和菜豆 (尸 . 。 。 19 。 : i : )[ ` 3 J三种从原生质体培养至愈伤组织阶段 , 但均未能分化出苗 。
关于赤豆细胞和组织培养方面的研究 ,至今所见 的报道不多 ,许智宏 ( 198 4) 〔’ ` l 将来源于
赤豆上胚轴的愈伤组织进行培养分化再生了植株 ; 19 85年鲁明塾等【’ 5 〕又将赤豆子叶愈伤组
织分化再生植株成功 , 关于赤豆原生质体再生植株方面的研究迄今未见有成功的报道 。 本实
验在袁勋梅 〔` 6 1从赤豆叶肉细胞原生质体 分离 培养得到愈伤组织的基础上 , 成功地将赤豆原
本于 19 87 年 12 月 8 日收到 , 艺9 88 年 7 月 10 日收到修改稿 。
水 本文结果 已申请中国专利 , 专利号为 87 10 10 02 一 4 。
料现在上海市农业科学院作物育种栽培研究所工作 。
H u a n g P e i m i n g n o w w o r k s : t t h e C r o p B r e e d i n g a n d C u l t i v a t io n R e o e a r e h I n s t i t u t e
,
S h a n g h a i A e a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S e i e n e e s
.
沁 上 海 农 业 学 报 S卷
生质体愈伤组织分化成为完整的植株 .
材 料 与 方 法
( 一 ) 赤豆叶肉细胞原生质体愈伤组织 此愈伤组织由复旦大学遗 传 研 究所 袁 勋 梅 提
供 〔` “ 1。 得到的愈伤组织在含有 3mg l /2 ,奋 D 和 0 . Z m g l/ 6一 B A 的 D : a 或M S培养基上扩增培
养约 3 个月 .
(二 )绿苗的分化 将扩增后 的愈伤组织切割成 1 . 6 一 2 . 0 毫米大小 , 接种在含不同激素
配比的M S培养基 (表 1 )中 , 该培养基同时还附加 : 2 %蔗糖 , 60 m g l/ 水解乳蛋白 , 0 . 7 %
琼脂 。 p H 调至 5 . 6一 5 . 8 , 在 16磅 /时 “ 压力下灭菌 加 分钟 . 培养物分两个阶段培养 , 第一
阶段为短周期快速继代 , 即每 7 一 8 天转接一次 , 约进行一个半月 ; 第二阶段为长周期稳定
培养 , 即每隔 弱 一 30 天转移一次 。 当培养物培养了约 1 个月 , 将培养基分为两大组 , 在其
它激素成分与浓度均不变的情况下 , 一组加入 G A 。 , 另一组则不加 G A 3 。 培养物分别置于红
光 ( 72 0 n m )和白光 ( 6 2 J n m ) 、 温度为 2 8 士 1 ℃ 的培养室内培养 , 每天光照 10 小时 。
表 1 不同分化培养甚中傲索的配比
T a b l e 1 H o r m o n e m i x i n g r a t i o i n v a r i o u s d i f f e r e n t i a t i o 立 m e d i u ms
代 号
S y m bo l
激素配比 ( m g / l )
H o r nt o n e m i x i n g r a t i o
激素配比 ( m g l/ )
H o r m o n e m i x i n g r a t i o
6一B A I人人 N A A G人
代 号
S y m b o l
6一B A I A A N A A G A
M s
一 ,
{
。 。 。 。
1 M
s 一 1。
}
1
. 。 。 . 1 。 . 4 。
M S
一 2 】 1 . 0 0 0 0 } M S一 11 1 5 . 0 0 . 1 0 . 4 0
M S
一 3 } 5
.
0 0 0 0 } M S
一 12 { 7
.
0 0
.
1 0
.
4 0
M S
一 4 } 7
.
0 0 0 0 } M冬一 13 } 10 . 0 0 . 1 0 . 4 0
M S
一 5 1 10
.
0 0 0 0 } M冬一 14 { 1 . 0 0 . 1 0 . 4 0 . 3
M S
一 6 } 1
.
0 0
.
1 0
.
2 0 } M S
一 15 } 5
.
0 0
.
] 0
.
4 0
.
3
M S刀 } 5 . 0 0 . 1 0 . 2 0 } M冬一 1 6 } 7 . 0 0 . 1 0 . 4 0 . 3
M S
一 8 { 7
.
0 0
.
1 0
.
2 0 { M s
一 17 } 10
.
0 0
.
1 0
.
4 0
.
3
M S
一 g } 10
·
0 0
·
1 0
·
2 0 } M S
一 18 { 0 0 0
·
4 0
(三 ) 根的诱导 待分化出的无根苗长至 3一 5 厘米左右时 , 将其从愈伤 组 织上切下 ,
转移至 M S 减半无激素培养基上 , 或转移至含 I A A 1 . o m g l/ 的 M S 培 养基上诱导生根 。
结 果 与 讨 论
从扩增培养基上取出的愈伤组织呈黄白色 , 质地较松散 。 接种到含不同激素配比的分化
培养基上后 , 首先进行第一阶段短周期快速继代培养 , 即每隔7一8天转接一次 , 在此阶段 ,
愈伤组织的体积明显地增大 , 而且一般仅在愈伤组织的边缘呈黄 褐 色 。 G r os s e r 和 C ol l in s
( 19 84 )[
“ 1认为 , 在许多情况下 , 早期的继代培养可以防止愈伤组织的褐化 。 约培养了一个月
后 , 愈伤组织部分区域开始逐渐褐化 , 褐化区域的质地明显地较其它区域松散 , 且继续进行
第一阶段培养 , 发现褐化区越来越大 . 这可能是由于接种不久的愈伤组织体积小 , 吸收培养
基中的营养成分后 , 达到代谢平衡所需的时间短 , 如及时地转接 , 可以保证愈伤组织生长在
营养充分的环境中 , 对细胞的生长 、 分裂增殖有利 : 但当愈伤组织的体积扩大 至 1 . 6 一 2 . 0
厘米后 , 由于愈伤组织的吸收 、 运输营养成分的速度相对较慢 , 而愈伤组织上部远离培养基
1期 黄培铭等 : 赤豆叶肉原生质体愈伤组织再生植株
端的细胞吸收营养的速度又比下部近培养基端的细胞吸收的速度慢 , 所以愈伤组织与培养基
中各类成分达到代谢平衡的时间即相应延长 , 如这时仍保持第一阶段的培养 , 则愈伤组织一
直生长在相对不稳定的状态下 , 上部细胞的营养无法更好地供给 , L e o p ol d等 [ ` 7 ]指出 : 愈伤
组织移植到固体培养基上 , 分化能很好地进行 , 但当培养连续转移 , 没有一个固定的位置 ,
则分化受 阻 。 因此 , 一个半月后 , 采用了第二阶段长周期稳定培养 , 即每隔 2 5 一 3 0 天转接
一次 , 实验证明这种措施是有效的 .
愈伤组织接种到不同的分化培养基中后 ,培养了半个月 , 生长即表现出明显的差异 . 在含
有相 同浓度的 6一 B A 的情况下 , 愈伤组织在含较高浓度的 N A A 培养基上比在含较低浓度的
N A A 和不含 N A A 的培养基上生长速度快 , 且前者含水量比较丰富。 在约培养了 20 天时 ,
大部分愈伤组织出现瘤状结构 , 质地也趋于紧密 。 经过一个月的培养后 , 将培养基分成二大
组 , 在其它激素成分 、 浓度不变的情况下 , 一组加入 G A 3 , 另一组不加 GA 。 (对照 ) , 愈防组
织在含有G A 。的培养基上生长速度比对照快 , 且愈伤组织有的整块变绿 , 有的局部变绿 , 有
的出现了绿点 , 但是不论是哪一种愈伤组织 , 继续培养后均未见有苗的分化 ; 在无 G A 。的培
养基 M S一 10 、 M S一 11 组合中 , 根的分化十分强烈 , 比在无激素培 养 基 M S吐 上分化出的根
(图 1 )粗壮 、 生长茂盛 。 但 当这些培养基中一旦加入 了 G A : , 如 M S一14 、 M S一场 组合中 ,
则没有发现有根的分化 。 很明显 , 赤霉 素 对 根 的 分 化 似 有一 定 的 抑 制作用 . 美国学者
L e o p ol d等 [ ’ 7 ]指出 , 每一类激素对生根 、 发芽都有效果 , 根的分化主要是受生长素刺激的结
果 , 而赤霉素则抑制根的分化 ; 同时赤霉素对芽 的分化亦有抑制作用 。 本实验的结果 (表 2 )
似乎符合上述观点 .
图 1 在无激素培养基中诱导出的根
F i g
.
1 R o o t s d i f f e r e n t i a t i o n o n h o r m o n e
一 f r e e m e d i u m
一般认为 , 愈伤组织的来源对苗的分化具有 重大影响 , 许智宏等〔’ 4 〕、 鲁明塾等〔` 5 ]分别
对赤豆上胚轴和子叶愈伤组织分化出苗进行了研究 , 他们的实验结果表明 , 在含较低浓度的
细胞分裂素6一B A (加 g 1/ ) 的M S 培养基中 , 上胚轴和子叶愈伤组织均未有幼苗分化 , 本实验
的结果则恰恰与他们的结果相反 , 在含有于 B A l m g 1/ 的 M S培养基上 , 原 生质体来源的愈伤
组织能被诱导进行绿苗分化 ( 图 2 ) , 但是 诱导苗 分 化的时间比较长 , 约经过了 3 个月的培
养 . 虽在M S一2 分化培养基中没有加入生长素 , 但在扩增培养基中 ,加入了高浓度的 2 , -4 D ,
一般认为 , 高含量的2 , 4一D 对诱导产 生胚性细 胞是 有 利的 . 因此 , 在扩增培养基中培养一
急 4上 海 农 业 学 报 5卷
裹 2 生长滋素对赤豆原生质体愈伤组织分化的影晌
T a b l e 2 E f f e e t s o f g r o w t l i ho
rm o n e s o n d if f e r e n t ia t io n o f e a l l往s
d e r ie vd f rom p
r o t o p l a s t o f P ha s e o l s a u” 夕 ul a r s`
代号
Sy 扭b o l
苗分化频率 (% )宋
Fr e q
.
o f s ho o t
苗分化频率 (% ) l 根分化频率 (% )
Fr e q
.
o f s ho
o t } F
r e q
.
o f r o o t
d if f e
r e n t ia t io n
(% )
根分化频率 (% )米
Fr e q
.
o f r o o t
d if f e r e n t ia t io n
(% )
代号
Sym b o l
d if f e
r e n t ia t io n
(% )
d if f e r e n t ia t io
且
(% )
q`一日
:
月任J毯nU一1ónnUnUd`n乙…1..!…nU Cl Cà“曰八nn曰ù,ndU….皿通0nU一lnIó曰nnUl月任qM S 一 1M S 一 2 033 . 3 一
!
日1-
M S -7
M S
一 8
M S
一 9
37
.
5
0
O
M S
一 10
M S
一 11
M S
一 12
M S
一
13
M S
一 1 4
M S
一 15
M S
一 16
M S
一 17
M S
一
18
苗分化频率 = 分化出苗愈伤组织块数接种愈伤组织块数 x 1 0 0%
F r e q
.
o f s h o o t d i f f
e r e n t i a t i o n 二
N o
.
o f e a l l u s e s w i t h s h o o t d i f f e r e n t i
a t i o n
N o
.
o f e a l l u s e s i n o e u l a t e d
x 100%
根分化频率 = 分化出根愈伤组织块数接种愈伤组织块数 x 1 00%
F r e q
.
o f r o o t d i f f e r e n t i a t i o n =
N o
.
o f e a l l u s e s w i t h r o o t d i f f e r e n t i a t i o n
N o
.
o f e a l l u s e s i n o e u l a t e d
x 1 00%
t到 ` 住 工杜 。 一` 〕苟 刁下理窿 甲 J才日 U力一 ` }七
F 19
.
2 S h o o t b u d s d i f f e
r e n t i a t i o n o n M S
一
2 m e d i u m
段时间后 , 再转移至分化培养基中培养 , 可能对分化起了很大的作用 。 另外 , 在 M S一2 培养
基中 , 同一愈伤组织上可以产生许多不定芽 , 但这些芽中只有一个能正常发育 , 其它不定芽
的生长发育都受到抑制 , 当正常发育的芽长至 3 一 5 厘米时 (图 3 ) . 及时地从愈伤组织上切
下 , 那么 , 其它不定芽中则有一个芽进行发育 , 其余芽的生长再次受到抑制 . 若发育正常的
芽不及时地从愈伤组织上切下 , 那么 , 经过两个多星期的培养 , 其它不定芽全部褐化死亡 .
另外 , 从本实验中还观察到一个有趣的现象 , 即在 M S一 2 培养基中生长的愈伤组织不但有芽的
分化 , 而且也有根的分化生长 . 但根和芽分别长在不 同的愈伤组织块上 , 没有一块愈伤组织
上既长根又长芽 。 在 M S一2 培养基上分化出的根显得比较纤细 、 短小 , 约长到 1 厘米就不再
伸长 , 关于这一现象 , 有待进一步分析研究 。 不仅在培养基 M S一 2 中 有芽的分化 , 在 M S一7
1 期 黄培铭等 : 赤豆叶肉原生质体愈伤组织再生植株
图 3转移前长至 s c m 长的苗
F 19
.
S h 3o o ts gr o w in guP to
s e m inl e n g t五 b e f o r e m e d i以m
图 4完整的植株
F i g
.
4C o m Pl e te pl a n t
培养基中也有芽的分化 (表 2 ) , 但与 M S一2 培养基上培养的情况相比 , 诱导芽分化的时间更
长 , 且其芽的生长速度也十分缓慢 , 经过两星期的培养 , 芽只长至约 1 厘米 , 以后则不再生
长 , 虽然在 M S一7 培二养基上的一块愈伤组织能同时诱导出许多不定芽 , 但这些芽均不能进一
步发育 , 最后枯黄死亡 .
在M S一2培养基上愈伤组织分化长出的 幼苗 , 若不转移 , 则始终没有根的长出 。 当苗长
到约 3 一 6 厘米时 , 将其从愈伤组织上切下 , 转移到M S减半无激素培养 基或含 l m g / 1 I A A
的 M S 固体培养基中 , 经过 7 天的培养都长出了根 , 从而形成了完整的再生植株 ( 图 4 ) . 但
苗在含 l m g 1/ I A A 的 M S 培养基中长出的根则 明显强壮 、 发达 。
另外 , 本实验初步探索了不 同 来 源 的光对赤豆叶肉细胞原生质体愈伤组织分化的影响
(表 3 ) , 结果表明 , 光源对愈伤组织的分化有一定的影响 , 红光的效果比白光的好 , 但在红
光和 白光下培养的愈伤组织的色泽 、 质地等均无明显 的差异 , 关于单色光和杂色光在植物组
织培养中的影响 , 有必要进一步深入研究 。
从本实验得 出的结果为 : 1 . 赤豆叶肉细胞原生质体愈伤组织可以在单附加细胞分裂素的
培养基上继代培养 ; 2 . 愈伤组织可以在无激素培养基上生长 , 并能诱导根的分化 ; 3 . 愈伤组
织可以在单附加细胞分裂素的培养基中诱导出芽 ; 4 . 再生芽的发根也可以不需要生长素 。 因
T a b l e
表 3 光派对赤豆原生质休愈伤组织分化的影晌
E f f e e t s o f l i g il t s o u r e e s o n d i f f e r e n t i a t i o n o f e a l l u s d e r i v e d f r o m
p r o t o P l a : t o f P h a s e o l u s a ” g “ l a r i s
光源
L i g h t
愈伤组织总数
N o
.
o f
e a l l u s
e忿
分化出苗愈伤组织块数
N o
.
o f ca l l u s e s
w i t h s h o o t
苗分化频率 ( % )
F r e q
.
o f s h o o t
d i f f e er n t i a t i o n
( % )
、 , 分侈剪数州 0 。 0 1 S l 0 O t S
S O U r C e
d i f f e r e n t i a t i o n
d i f f e r e n t i a t io n } d i f f e r e n t i a t i o n
R e d
W il i t e
1
;; }
,
: { ) { }
.
2
米 苗分化频率同表 2 。
T h e f r e q
.
o f o h o o t d i f f e r e典 t i o t i o o 15 e o l e u l a t e d s i m i l a r l y a s 10 t a b l e Z,
36 上 海 农 \ !卜 学 报 5 卷
此 , 我们的实验似乎说明 : 赤豆叶肉细胞原生质体来源的愈伤组织中的内源激素特别是生长
素类激素的含最可能比较高 , 而内源分裂素类激素的含量可能比较低 。 关于这一点 , 尚有待
进一步加以证实 。
参 考 文 献
〔 1 〕 C o e k i n g , E . C . , N a t u r e , 187 ( 19 60 ) : 962一 gG3
〔 2 〕 K a o , K . N . , M i e h a y l u k , M . R . , 2 . P f l a n z e n p h y s i o l . , 96 ( 198 0 ) : 13 5一 14 1
[ 3 〕 张 谦 , 19 86 : 植物生理学通讯 : ( 5 ) : 0 6一 7 6
【4 〕 B h o jw a n i , 5 . , W h i t , D . W . R . , P l a n t S e i . L e t t . , ZB( 1 98 2 ) : 2 65一 27 1
【5 〕 G r o s s e r , J . W . , C o l l i n s , G . B . , P l a n t S e i . L e t t . , 37 ( 19 84 ) : 16 5一 17 0
〔 6 〕 H o n k a n e n , J . e t a l . , I n , , A b , t r a e t s , ’ I n t l . S y m . o n G e n e t i e M a n i p . i n C r o p s .
C h i n a
. ,
( 19 8 4) : P
.
95
「 7 ] A r e i o n o , 5 . e t a l , Z . P 五l a n z e n p h y s i o l . , 106 ( 19 82 ) : 10 3一 110
【8 」 A t a n a s s o v , A . , B r o w z , D . C . W . , P l a n t C e l l T i s s u e O r g a n C u l t u r e , 3 ( 19 8 4 ) :
〔 9 〕 L u , D . Y . e t a l . , P l a n t S e i L e t t . , 3 1( 19 83 ) : 87一 9 9
仁10」 M a r i o t t i , D . e t a l . , P l a n t S e i . L e t t . 37 ( 19 8 4) : 149一 15 9
〔 1月 黄美娟 、 李向辉等 , 19 82 : 中国科学院遗传研究所编 , 研究工作年报 , p . 3 4
[ 12〕 X u , 2 . H . e t a l . , 2 . P f l a n z e n p h y s i o l . , 10 4( 19 8 1 ) : 2 89一 29 8
仁13 1 P e l e h e r , L . E . e t a l . , P l a n t S e i L e t t . , 3 2 ( 19 84 ) : 107一 1 11
〔14〕 许智宏等 , 19 84 : 实验生物学报 , 17 ( 4) , 484一理8 8
仁15〕 鲁明塾等 , 19 85 : 上海农业学报 , 1 ( 4 ) : 3 5一 3 8
仁16〕 袁勋梅等 , 19 8于 复旦大学遗传研究所 19 86年硕士毕业论文
〔 17〕 A , C . L e o p o l d 等著 , 颜季琼等译 , 19 8 4 : 植物的生长和发育 , p p . 95一 187
B e i j i n g
.
14 9一 16 2
P LAN T R E G EN E RAT旧N B Y C AL LU S D E R IV ED F R OM ME SO P H Y LL
P RO T O P L AS T O F P H A S E O L U S A N G U L A R I S
H u a n g P e i m i n g G e K o u l i n
( I n s t `才u t e o f G e n e t i e s , F u d a , U n `v e r : i t夕 , S h a n g h a ` )
Ab s t r a e t A f t e r t h e e a l l u s e s d e r i v e d f r o m m e s o p h y l l p r o t o p l a s t s o f P h a s e o l“ s
a n g u l a r f s h a d p r o l i f e r a t e d f o r a b o u 七 t h r e e m o n t h s o n D Z。 o r M S m e d i u m e o n 七a i n -
i n g 3 m g l
一 `
2
,
4一D a n d o
.
Zm g l
一 ’
6一 BA , 七h e y w e r e 七r a n s f e r r e d o n 七0 v a r i o u s M S
m e d i u m s f o r a n o t h e r t h r e e m o n t h o
.
S h o o * b u d s r e g e n e r a t e d o n M S m
e d i u m s u p
-
p l e m e n t e d w i七h 0 . l m g l 一 ’ IA A , 0 . 2 m g l 一 ` N A A a n d 6 m g l 一 ` 6一 B A o r a u x i n 一 f r e e
M S m e d i u m s u p p l e m e n 七e d w i t h 1 . o m g l一 ` 6一B A . o n t h e f o r m e r m e d i u m 七h e b u d s
d i d
n o t d e v e l o p f u r t h e r
.
W h
e n s h o o t s f o r m e d o n l a t t e r m e d i u m g r e w t o a b o u t 于6
e m i n l e n g t h
,
t h e y w e r e e u t d o w n f r o m e a l l u s e s a n d t r a n s f e r r e d o n 七0 h o r m o n e ,
f r e e s e m i一M S m e d i u m o r M S m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h l m g l 一 1 I A A
.
R o o t f o r
-
m a七i o n w a s i n d u e e d a f t e r 7 d a y s a n d 七h e r e f o r e e o m p l e 七e p l a n t s w e r e o b t a i n e d .
K e v w o r d s L e g u m e
,
P h a se o l“ s a ” 夕u l a r i s , C a l [ u , d e r i v e d f r o m p r o t o p l a s t ,
P l
a n t r e g e n e r a t i o n