全 文 ：评述与展望
Review and Progress
象耳豆根结线虫分子诊断技术研究进展
王会芳 芮凯 符美英 王三勇 云霞 陈绵才 吴凤芝 *
海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所,海南省植物病虫害防控重点实验室,海口, 571100
*通讯作者, wufengzhi0898@163.com
摘 要 象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)，被公认为是世界上最危险的根结线虫之一，它有非常广
泛的寄主范围，并能克服 Mi基因。因其重要性，其分子诊断技术近年来不断得到发展，其主要的分子诊断技
术有直接 PCR、RFLP、RAPD、LAMP及 SCAR等。本文对几种主要诊断技术近年来的研究进展进行了概述。
关键词 象耳豆根结线虫, PCR,分子诊断
Molecular Diagnosis Review of Meloidogyne enterolobii
Wang Huifang Rui Kai Fu Meiying Wang Sanyong Yun Xia Chen Miancai Wu Fengzhi *
Institute of Agro-environment & Plant Protection, Hainan Academy of Agricultural Sciences, Hainan Key Laboratory for Prevention and Control of Plant
Diseases and Insect Pests, Haikou, 571100
* Corresponding author, wufengzhi0898@163.com
DOI: 10.13417/j.gab.034.002044
Abstract Meloidogyne enterolobii is considered as one of the most damaging RKN species because of its
entremely wide host range and ability to overcome the resistance genes (Mi). Its molecular diagnostic technology
continuously is developed in recent years, which include PCR, RFLP, RAPD, LAMP and SCAR diagnosis
technology. Research progress are reviewed in recent years.
Keywords Meloidogyne enterolobii, PCR, Molecular diagnosis
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31260424)、公益性行业(农业)科研专项项目(201103018)和 973前期项目(2014CB1-
60307)共同资助
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 9期，第 2044-2050页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.9, 2044-2050
根结线虫病是世界性广泛分布的植物土传病
害，其病原线虫种类复杂，为害严重而隐蔽，诱发的
作物减产不易估测。目前全世界已报道的根结线虫
有一百多种。我国已报道的根结线虫有三十多种，其
中包括分布最为广泛的常见 4种，即南方根结线虫
(M. incognita)、花生根结线虫(M. arenaria)、北方根结
线虫(M. hapla)和爪哇根结线虫(M. javaniea) (赵鸿等,
2003)，以及具有广泛寄主范围、繁殖速度快、致害性
强、可克服携带Mi基因抗病番茄和辣椒的象耳豆根结
线虫(M. enterolobii) (Fargette and Braaksma, 1990; Far-
gette et al., 1996)。
象耳豆根结线虫最早于 1983年在海南儋州的象
耳豆树上发现并被鉴定和命名(Yang and Eisenback,
1983)。国内外学者报道 M. enterolobii和玛雅根结线
虫(M. mayaguensis)是同一种线虫(Xu et al., 2004)，并
已被国际上大多数学者承认。M. enterolobii传播迅速
快，在美洲、非洲、欧洲等均有分布。2008年，瑞士首
次报道象耳豆根结线虫(Kiewnick et al., 2008)，随后欧
洲植物保护组织(EPPO)报道，在来自中国的玫瑰花
上截获到 M. enterolobii，经评估，认为该线虫是中欧
地区作物生产的极大潜在威胁。至 2011年，已有近 20
个国家和地区报道该线虫的发生与危害(Meloidogyne
enterolobii, 2014, http://en.wikipedia.org/wiki/Meloido-
gyne_enterolobii)。国内，近年来 M. enterolobii已在海
南岛普遍分布，广东省包括深圳市、福建省等地陆续
发现 M. enterolobii的侵染(卓侃等, 2008; 赵传波等,
2015;杨意伯, 2015)。据调查，海南岛主栽的葫芦科
蔬菜、茄果类蔬菜、南药植物和热带果树均已发现有
M. enterolobii广泛寄生(黄伟明等, 2011;贾本凯等, 2012;
龙海波等, 2015)，显示出取代南方根结线虫而成为我
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
国热带亚热带地区最重要根结线虫种类的趋势。随
着我国现代设施农业的发展，温室和设施大棚等措
施使环境温度的不断上升，因此 M. enterolobii为害
地区进一步扩大，给我国相关农作物的生产安全带
来极大威胁(练冬梅等, 2014)。
随着 M. enterolobii危险地位的上升，其快速灵
敏的检测方法成为近年来的研究热点，并逐渐朝着
样本多样性 (土样或根样中混合群体的检测)、灵敏
(检测微量线虫 DNA)、便捷(从病组织中直接检测)和
根结线虫病早期诊断的方向发展。目前以基因检测
为基础的 M. enterolobii 分子诊断方法包括 RFLP、
DNA探针、PCR-RFLP、RAPD-SCAR等(刘培磊, 2002)
及近几年发展起来的多重 PCR、LAMP、微卫星序列标
记等方法，这些基于 DNA不同区域的分子检测方法，
极大的提高了M. enterolobii的检测准确度和效率。
1 RFLP诊断技术
作为根结线虫重要的线虫种群，M. enterolobii的
检测方法是在其它根结线虫分子检测方法基础上发
展起来的。根结线虫早期的分子诊断技术局限于基
因组 DNA的限制性片段多态性分析(RFLP)。由于根
结线虫基因组 DNA序列较长(南方根结线虫基因组
DNA达 5.1×107 bp)，经限制性酶切后的片段较多，结
果不易观察，因此，与物种专化性探针技术结合应用
是鉴定线虫的较为可靠的方法，并显著提高了其灵
敏度和特异性。Curran等(1986)用此方法对 4种常见
根结线虫种群进行了区分。1996 年，Fargette 等
(1996)通过 RFLP和探针研究了包括 M. mayaguensis
在内的几种热带种群的 DNA特点，通过酶切后谱带
的不同可以将它们区分开来，同时，他还就 M.
mayaguensis 和 M. enterolobii的寄主范围、同工酶谱
以及基因结构进行了对比，得到一致的结果，这是关
于 RFLP 技术应用于 M. enterolobii 的最早报道。
RFLP酶切位点遍布低拷贝编码序列，并且非常稳
定，与探针技术结合明显可以区分几种根结线虫并
显示其之间的亲缘关系。但是由于这种方法需要的
DNA量大、敏感性低、限制酶消化步骤繁琐、同位素
标记限制 DNA探针使用等原因，其使用也受到限
制。同时 RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高
昂，不适于大规模的分子检测，在分子标记中需要将
RFLP转换成以 PCR为基础的标记。根结线虫 PCR-
RFLP避免了 RFLP繁琐步骤，大大提高了 RFLP的
效率。mtDNA 的 COⅡ与 lrRNA 间序列和 rDNA-
IGS2是 PCR-RFLP研究利用最多的区域。
2 mtDNA-PCR-RFLP诊断技术
mtDNA (mitochondrial DNA)是一种小的核外基
因组，是独立于细胞核外的遗传物质。它具有进化速
度快(DNA序列多态性丰富)、拷贝数多、不易重组、
基因组小(15~20 kb)、严格偏母遗传等优点，因此其
用于分子诊断具备多重优势。根结线虫的 mtDNA含
有 3组高度变异的串联重复单元，常用于根结线虫
种间甚至种内的多态性研究(Dautova et al., 2002)。而
多个根结线虫 mtDNA具有低多样性和稳定的结构
性，与酯酶酶谱的遗传多样性具有一致性，可作为根
结线虫分子诊断的重要参考依据(Hugall et al., 1994 )。
因 mtDNA的 COⅡ和 lrRNA基因间的序列具有相
对保守的特点，因此成为根结线虫种类鉴定的最重
要研究区域之一。
实践也证明 mtDNA 的 COⅡ和 lrRNA 基因间
的序列是根结线虫鉴定中应用最多的位点。Harris等
(1990)根据mtDNA限制性酶切位点多态性设计引物，
直接扩增单条根结线虫二龄幼虫(J2)或卵的 mtDNA，
并通过酶切 PCR扩增片段大小来区分 M. incognita、
M. javanica和 M. arenaria几种常见根结线虫。在此
基础上，Power 和 Harris (1993)进一步发展，设计引
物扩增 mtNDA的 COⅡ和 16SrRNA间序列，通过
PCR-RFLP得到大小不同的片段来鉴定根结线虫的种
类，成功鉴定了 M. incognita、M. javanica、M. arenaria、
M. hapla 和 M. chitwoodi 在内的 5 种根结线虫的
mtDNA，但是此方法并未包含 M. enterolobii 在内。
2002年，Blok等(2002)利用 Power和 Harris (1993)设
计的引物对M. mayaguensismtDNA的 COⅡ和 lrRNA
间序列进行扩增，得到 705 bp的片段，可区别于主要
热带地区根结线虫种。2004年，Xu等(2004)再次将
该技术应用于 M. enterolobii上的鉴定，以 mtDNA的
COⅡ和 lrRNA间序列为基础，利用 mtDNA-RFLP-
PCR技术对中国 5种根结线虫，扩增到区别于其它常
见 4种根结线虫的 850 bp的片段，并且不能被酶切；
结合其它鉴定特征，提出 M. enterolobii是玛雅根结线
虫(M. mayaguensis)的异名。为了明确M. enterolobii的
系统分类地位，提供该线虫分子检测 PCR引物设计
的有用靶点，刘昊(2005)选取 Power和 Harris (1993)、
Stanton等(1997)设计的引物组合 C2F3 和 MRH106
扩增了 M. enterolobii代表性群体的 mtDNA的 COⅡ
lrRNA基因间隔区，发现其扩增产物约 0.85 kb，与 Xu
等(2008)研究结果一致，所得到的扩增产物片段大小
与M. arenaria、M. hapla、M. incognita、M. javanica等其
2045
它常见根结线虫有明显差异，据此可以区分 M.
enterolobii与其它根结线虫种。此后利用mtDNA-PCR-
RFLP扩增 M. enterolobii的 mtDNA-COⅡ/lrRNA区
域，已得到越来越多的应用(Brito et al., 2004; Tigano
et al., 2005; Adam et al., 2007)。国内学者利用此方法
对采自海南省和广东省作物上的根结线虫种类进行
了鉴定(卓侃等, 2008; Fu et al., 2011)。杨意伯(2013)
利用此方法鉴定了来自福建荔枝和番石榴上的 16个
M. enterolobii。
3 rDNA-PCR诊断技术
核糖体 DNA (rDNA)重复单元也是根结线虫分
子诊断中最有价值的区域之一。通过比较分析 rDNA
编码和非编码区，可诊断鉴定许多生物的种和亚种。
大多真核生物基因组中，从 5到 3端分别由外转录
间隔区(ETS)、18S、内转录间隔区(ITS)、5.8S、25S和
基因间隔区(IGS) 6个部分组成一个重复 rDNA基因
家簇。大多数生物中，18S、5.8S和 28S基因序列趋于
保守，生物种间变化较小；内转录间隔区的 TIS1和
ITS2变化相对较大，是最早用于根结线虫鉴定的区
域；基因间隔区 IGS的序列变化最大，甚至在生理小
种之间表现出显著差异(赵鸿等, 2004,植物检疫, 18
(2): 100-105)。
对 M. enterolobii研究表明，其 ITS区扩增片段
大小在 760~770 bp之间，与常见根结线虫的扩增片
段基本一致，因此，难以通过 ITS区片段的大小区分
M. enterolobii与常见几种根结线虫(符美英等, 2012)。
因此，大多数学者将目光聚集到了序列变化更大的
rDNA-IGS2区。
Blok等(1997a)研究了 M. incognita、M. javanica、
M. arenaria、M. hapla 和 M. mayaguensis 等 5 种根结
线虫的 rDNA-IGS2，设计一对引物，成功扩增到上述
5种根结线虫的 IGS2区，研究表明，M. mayaguensis
的 IGS2区大小为 831 bp，区别于上述 5种根结线虫
的 715 bp，这个结果为 M. mayaguensis的检测提供了
一个可靠的途径。在此基础上，Long等(2006)根据不
同种根结线虫 IGS序列的差异设计出 M. enterolobii
特异性 PCR检测引物，开发了该线虫的快速 PCR鉴
定诊断方法。对来自不同地理群体及自然土壤的 6种
近似根结线虫线虫群体进行测试，结果进一步证明
设计的特异 PCR 引物针对 M. enterolobii 的可靠性
和特异性。此方法还具备快速灵敏的特点，可用于
M. enterolobii单条幼虫的直接检测和土壤混合线虫
群体中 M. enterolobii的检测。
4其它特异性片段 PCR诊断技术
以 PCR技术为基础，选择不同的或特异靶标序
列，也可以对 M. enterolobii进行诊断。Jeyaprakash等
(2006)利用高保真 PCR技术扩增了 COⅡ和 16SrDNA
也是重要的研究区域片段，发现包括 M. enterolobii在
内 5种根结线虫的 AT富集区长度不一，可以作为区
分几种根结线虫的标记。除了扩增 mtNDA COⅡ和
lrRNA基因间隔区和 rDNA-IGS2区，通过扩增片段
的长度来区分根结线虫的种外，许多学者对其它区
域进行了研究。Bolk等(2002)利用引物对 mtDNA的
63 bp串联重复区域进行扩增，发现 M. enterolobii可
以扩增到 322 bp的片段，此片段的大小区别于 M.
arenaria、M. incognita 和 M. javanica。而 2014 年，针
对 mtDNA异质性现象的存在，Kiewnick等(2014)以
mtDNA的 COⅠ、COⅡ两个短基因和 SSU、LSU 两
个长基因的基础上得到 4个标记，这一标记可以很
好的区分热带根结线虫的混合群体及 M. hapla、M.
maritima等群体。
Randig等(2009)发现具有M. mayaguensis的种特
异性卫星 DNA家族，研究表明来自M. enterolobii的
pMmPet由分别为 174 bp和 180 bp的两个 AT富集
的串联重复单元组成，以此序列为靶标，通过杂交和
PCR技术，可以利用单条线虫将M. mayaguensis从四
十多个其它种中区分出来。这是关于 M. enterolobii
satDNA的唯一报道。
28S rDNA 是基因组中最保守的区域之一，而
28S rDNA-D2/D3区是进行不同物种间的同源性和
系统进化研究的常用区域，在植物寄生线虫中也有
很多的应用(蒋立琴和郑经武, 2007;李佳等, 2008;叶
文兴等, 2010)。Hu等(2011)直接从染病植株的根系
中提取线虫 DNA，利用 28S rRNA D2D3区设计引物
及已报道的特异性引物组合，开发出从植物根结中
检测 M. enterolobii的多重 PCR检测方法。
5 RAPD-SCAR技术
PCR技术的发展，除直接用于根结线虫检测外，
也促使许多新的检测方法如多重 PCR、LAMP、微卫
星序列标记等方法的诞生。随着分子生物技术的发
展，一些新兴的分子诊断技术如 RAPD、SCAR等研
究技术为 M. enterolobii的诊断提供了可靠的途径。
Blok等(1997)运用 RAPD技术对热带地区常见
的四种根结线虫进行了 DNA多态性分析。Adam等
(2007)对前人报道的 10对引物进行了评价，发现其
象耳豆根结线虫分子诊断技术研究进展
Molecular Diagnosis Review of Meloidogyne enterolobii
2046
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
中任一单一的引物并不能区分 M. arenaria、M. hapla、
M. incognita、M. javanica、M. mayaguensis、奇氏根结
线虫(M. chitwoodi)和虚假根结线虫(M. fallax) 7种根
结线虫，并利用 RAPD标记设计的 SCAR引物，通过
单条 J2的 DNA，就能区分包括 M. mayaguensis在内
的上述 7种线虫，并使其对环境的要求进一步降低。
同样，利用 RAPD技术，Tigano等(2010)除了对从多
地收集的 M. enterolobii种群重新扩增了其 IGS区和
rDNA外，还使用了 AFLP、ISSR和 RAPD技术对多
个种群的多态性进行了研究，并在 RAPD的基础上
研发了专门用于 M. enterolobii的 SCAR引物，检测
发现其它 10种根结线虫均不能获得目的片段，并且
此方法可以检测单条雌虫、卵块及 J2，对检测样本要
求大大降低。
6 LAMP技术
M. enterolobii 的检测技术越来越向着简单、灵
敏、环境要求低、可操作性强的方向发展，在此环境
下，LAMP (loop-mediated isothermal amplification)技
术应运而生。LAMP技术，其原理是在 65℃左右，采
用 4条特异性引物和 1种具有链置换活性的 DNA
聚合酶，对核酸进行扩增。LAMP法具有高效性特
点，短时间扩增效率即可达到 109~1 010个拷贝。其
还具有高特异性、快速、廉价、易检测等特点，已在松
材线虫(Bursaphelenchuh xylophilus)、香蕉穿孔线虫
(Radopholus similis)和根结线虫中得到应用(Kikuchi
et al., 2009; Niu et al., 2011; Peng et al., 2012)。Niu等
(2012)首次根据 M. enterolobii IGS序列的差异建立
了 LAMP检测体系；何旭峰等(2013)报道了植物罹
病组织中 M. enterolobii的 LAMP快速检测方法，以
M. enterolobii rDNA-ITS区为靶标，具有特异性强、
灵敏度高、简单、快速等特征，能够在 1 h内直接从罹
病植物组织中检测到 M. enterolobii，检测灵敏度达
1头雌虫 DNA的 1/200 000，结果可通过肉眼直接观
察，该技术有望应用于 M. enterolobii田间监测与口
岸检测。
7结论与展望
快速、灵敏、可靠的检测鉴定方法是根结线虫研
究的基础。只有在弄清根结线虫的种类后，才能更好
地利用相应措施来阻止根结线虫传播、扩散和危害，
才能更好地开展根结线虫的群体动态、抗线虫基因
的筛选和利用、根结线虫抗病育种、根结线虫与寄主
植物的相互关系以及防控技术的研究。
M. enterolobii 作为最危险的根结线虫之一，其
分子诊断技术的研究一直受到学者的重视。M.
enterolobii分子诊断技术的发展，对于研究M. enterolobii
的生物学特性、侵染机制及抗病育种方面都有非常
重要的意义。基于 PCR 技术的分子检测能够克服
M. enterolobii 的传统检测方法工序繁杂、灵敏度差、
准确度低等缺陷，因此显示出良好的应用前景。到目
前为止，M. enterolobii 分子诊断技术主要有直接
PCR、RFLP、RAPD、LAMP 及 SCAR 等单用的方法
或者几种方法相结合的方法。纵观M. enterolobii象耳
豆根结线虫的分子诊断的方法，无论是 LAMP还是
由 rDNA-IGS2发展而来的 SCAR均解决了单条线虫
的检测，并将准确度和灵敏度都大大提高、检测的材
料也包括了线虫经常存在的土壤、植物罹病组织等。
目前发展的分子诊断技术，都是在已知的线虫
序列的基础上发展而来的，在一定范围内一般可以
区分几种到几十种根结线虫。人们在应用的过程中
一般采用两种或两种以上的检测方法才能对种进行
确认，对于新种的确认则需要结合形态学、同工酶等
更多的方法。现在，随着测序技术及其它分子生物学
技术的不断发展，越来越多的线虫基因被逐渐破译，
基于 M. enterolobii特定基因的分子诊断技术必将成
为研究热点，分子诊断技术也必将向着更快速、更灵
敏、更准确的方向发展。
作者贡献
王会芳负责论文的整体构思和撰写；吴凤芝在
论文的写作过程中给与很多宝贵意见；陈绵才和符
美英对论文的整体结构及细节提出建议并进行了修
改；芮凯、王三勇和云霞帮忙查阅了大量文献。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31260424)、公
益性行业(农业)科研专项项目(201103018)和 973前
期项目(2014CB160307)共同资助。
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象耳豆根结线虫分子诊断技术研究进展
Molecular Diagnosis Review of Meloidogyne enterolobii
Tree Genetics and Molecular Breeding (TGMB)
Tree Genetics and Molecular Breeding (ISSN 1927-5781) is an international, open
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breeding, particularly publishing innovative research findings in the basic and applied
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