全 文 ：峨眉黄连及其近缘种的遗传多样性分析
韩 凡，邹嘉欣，宋良科，王万军* (西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都 610031)
摘要 ［目的］对峨眉黄连及其近缘种进行遗传多样性分析。［方法］利用优化的 RAPD-PCR反应体系及 82条 RAPD引物对 11个不同
生境的黄连属植物样本进行遗传多样性分析。［结果］11个黄连植物样本的多态率为 89． 23%，而对来源于 4个生境的 7个峨眉黄连样
本，其多态率为 38． 80%。POPGENE结果显示，峨眉黄连种内遗传多样性水平不高，Nei’s基因多样性指数为 0． 125 0、Shannon信息指数
为 0． 185 2、遗传分化指数 Gst为 0． 368 0。［结论］该试验表明生境差异和基因流障碍可能是导致峨眉黄连生境间遗传差异的主要原因，
遗传多样性与生长环境之间表现出了明显的相关性。
关键词 遗传多样性; RAPD;峨眉黄连
中图分类号 S567． 5 + 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2012) 30 －14648 －03
Genetic Diversity Analysis of Coptis omeinesis and Its Relative Species
HAN Fan et al ( School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu，Sichuan 610031)
Abstract ［Objective］Genetic diversity analysis was carried out on C． omeinesis ( Chen) C． Y． Cheng． ［Method］The genetic diversity of
11 Coptis plants was analyzed with an optimized RAPD-PCR system and 82 RAPD primers． ［Result］The results showed that the polymorphism
rate in 11 Coptis plants were 89． 23%，while the rate were 38． 8% in 7 kinds of C． omeinesis ( Chen) C． Y． Cheng． The results of POPGENE
calculation indicated that the level of genetic diversity within C． omeinesis is not high． Nei’s gene diversity，Shannon information，genetic dif-
ferentiation ( Gst) index are 0． 125 0，0． 185 2，0． 368 0，respectively． ［Conclusion］The differences of the habitats and the barriers of the
gene flow may be the main reason of genetic differences in populations． It shows an obvious correlation between genetic diversity and growth
environment．
Key words Genetic diversity; RAPD; C． omeinesis ( Chen) C． Y． Cheng
基金项目 国家自然科学基金项目( 2008 ～ 2010，30772742) 资助。
作者简介 韩凡( 1986 － ) ，女，湖北宜昌人，硕士研究生，研究方向:生
物化学与分子生物学，E-mail: luckycathf@ gmail． com。* 通
讯作者，教授，博士，从事植物生物技术研究，E-mail: wan-
junwang@ home． swjtu． edu． cn。
收稿日期 2012-07-26
峨眉黄连为毛茛科黄连属(Coptis)植物，主要分布于我
国四川省西部的峨眉、雅安与洪雅地区海拔 800 ～2 000 m的
悬崖陡壁上［1］;性喜阴湿，结实率不高;根据其叶片的形态特
征，可分为“凤尾型”和“双翼型”2种类型［2］。由于其居群数
量及个体数濒危稀少，资源相当匮乏，而被列为国家二级濒
危保护植物［3］。峨眉黄连性寒、味苦，药用价值主要集中在
其根茎及叶部所含的小檗碱上，该物质具有清热、解毒、泻火
和良好的抗菌作用［4］。目前，对于峨眉黄连的研究主要集中
在其生理、形态、药理成分等方面［5］，在分子水平上的研究较
少，尤其少见不同居群之间基因组差异的相关报道。笔者利
用 RAPD分子标记方法，研究峨眉黄连与其近缘种的亲缘关
系以及不同生境之间在基因组水平上的遗传特异性，为进一
步对峨眉黄连的鉴定和种质资源的特征研究提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料 中国黄连(Coptis chinensis Franch)样本采自四川
省峨眉山市黄湾茶地;2 个三角叶黄连(C． deltoidea)样本分
别采自四川省雅安市望鱼乡田坪(俗称杂白子)和峨眉山
(俗称大红袍) ;7 个峨眉黄连(C． omeinesis(Chen)C． Y．
Cheng)样本分别采自峨眉山市黄湾茶地、三道河、人棚子沟
的“凤尾型”与“双翼型”材料及峨眉山市白崖的“凤尾型”材
料;线萼黄连(C． linearisepala)样本采自峨眉山。试验所用随
机引物购于上海生工生物工程技术服务有限公司，PCR Buff-
er、MgCl2、dNTPs、Ex Taq DNA聚合酶购于大连宝生物工程有
限公司。
1． 2 基因组 DNA的提取 每个材料选取 3 株成年植株，从
每株植物的顶端采摘 3 片幼嫩叶片，采用改进的 SDS法［6］，
分别提取 11个黄连属植物样本的基因组 DNA。用核酸蛋白
定量仪测试所提 DNA浓度及纯度，同时用 1%琼脂糖凝胶电
泳检测基因组 DNA的完整性，最后将提取的 DNA浓度稀释
至 10 mg /ml，于 －20 ℃储存备用。
1． 3 TD-PCR扩增及产物鉴定 以 11 个黄连属植物的基
因组 DNA为模板进行 PCR扩增。利用 500条 RAPD随机引
物进行预试验，从中选取扩增产物稳定、重复性好的引物(表
1)进行 PCR扩增。反应体系总体积为 25 μl，包含 2． 5 μl 10
× Ex Taq PCR buffer、2 μl 25 mmol /L MgCl2、2． 5 μl 各 2． 5
mmol /L dNTPs、1． 5 μl 100 ng /μl 植物基因组 DNA、4 μl 10
μmol /L RAPD引物、0． 2 μl 5 U /μl Ex Taq DNA聚合酶、12. 3
μl无菌双蒸馏水。根据引物的理论 Tm值，设定 TD-PCR反
应循环参数，并根据预试验结果进行优化，最终确定 TD-PCR
的反应程序为:94 ℃预变性 2 min;94 ℃变性 50 s，39 ℃退火
1 min(每循环下降 0． 5 ℃直至 36 ℃)、72 ℃延伸 1 min，共 40
个循环;循环结束后，72 ℃延伸 3 min，4 ℃保存。反应产物
在含 EB的 1%琼脂糖凝胶中电泳分离，然后使用 SYNGENE
凝胶成像系统观察结果，拍照记录。
1． 4 数据采集与分析 记录清晰且可重复的 DNA 电泳条
带，对同一引物的扩增产物，迁移率相同的条带记为一个位
点，阳性记为 1，阴性记为 0，建立 Excel表征数据矩阵。分别
统计所有 11个黄连植物样本的扩增带、多态性条带与峨眉
黄连多态性带，计算多态性比率。运用 NTSYSpc2． 10e 计算
11个黄连植物种间的遗传距离，并进行 UPGMA 聚类分析。
对于采集于不同生境的 7 个峨眉黄连样本，采用 POP-
GENE32分别分析全部居群和各个居群的遗传参数，包括等
位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、基因多样性指数(h)、
责任编辑 朱琼琼 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(30):14648 － 14650
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.30.212
Shannon多样性指数(I)、总的基因多样度(Ht)、基因分化系
数(Gst)、基因流(Nm) ，并计算遗传距离。
2 结果与分析
2． 1 黄连属植物的 RAPD多态性分析 从 500条 RAPD随
机引物的 PCR扩增产物中，选取条带清晰、重复性好的 82条
引物进行多态性分析，结果如表 1所示，利用 82 条引物共扩
增出 771条带，平均每个引物 9． 5 条带;多态性位点 688 个，
占总扩增带数的 89． 37%;所得到的 DNA片段大小在 250 ～
4 500 bp之间。这些说明黄连属植物之间具有较为丰富的
遗传多态性。对峨眉黄连，共扩增出510条带，其中有198个
多态性位点，多态率为 38. 80%，可见采集于不同生境的峨眉
黄连之间的遗传多态性有限。
表 1 82条随机引物 RAPD分析
引物
编号
引物序列
11种
黄连扩
增带
11种黄
连多态
性条带
11种黄
连多
态率
峨眉黄
连多态
性条带
峨眉黄
连多
态率
s14 TCCGCTCTGG 7 3 0． 43 0 0． 00
s21 CAGGCCCTTC 8 4 0． 50 2 0． 29
s22 TGCCGAGCTG 6 3 0． 50 1 0． 20
s34 TCTGTGCTGG 8 6 0． 75 2 0． 33
s40 GTTGCGATCC 6 5 0． 83 2 0． 29
s46 ACCTGAACGG 5 5 1． 00 1 0． 25
s47 TTGGCACGGG 10 10 1． 00 3 0． 43
s59 CTGGGGACTT 6 5 0． 83 0 0． 00
s67 GTCCCGACGA 6 5 0． 83 2 0． 50
s73 AAGCCTCGTC 8 8 1． 00 1 0． 33
s82 GGCACTGAGG 5 3 0． 60 0 0． 00
s84 AGCGTGTCTG 4 2 0． 50 0 0． 00
s89 CTGACGTCAC 7 5 0． 71 2 0． 40
s97 ACGACCGACA 6 5 0． 83 1 0． 20
s105 AGTCGTCCCC 7 6 0． 86 0 0． 00
s108 GAAACACCCC 5 4 0． 80 0 0． 00
s114 ACCAGGTTGG 9 7 0． 78 2 0． 33
s118 GAATCGGCCA 4 3 0． 75 0 0． 00
s123 CCTGATCACC 4 3 0． 75 0 0． 00
s181 CTACTGCGCT 10 8 0． 80 3 0． 43
s182 CCTCTGACTG 8 6 0． 75 3 0． 60
s187 TCCGATGCTG 10 8 0． 80 4 0． 57
s190 ACCGTTCCAG 11 10 0． 91 6 0． 67
s194 AAAGGGGTCC 7 6 0． 86 2 0． 50
s197 TGGGGACCAC 11 11 1． 00 5 0． 63
s198 CTGGCGAACT 12 12 1． 00 6 0． 75
s221 TGACGCATGG 7 7 1． 00 1 0． 17
s229 TGTACCCGTC 12 12 1． 00 4 0． 40
s243 CTATGCCGAC 10 10 1． 00 2 0． 50
s246 ACCTTTGCGG 10 10 1． 00 2 0． 67
s254 TGGGTCCCTC 9 8 0． 89 3 0． 50
s261 CTCAGTGTCC 13 12 0． 92 4 0． 50
s262 ACCCCGCCAA 11 11 1． 00 3 0． 43
s263 GTCCGGAGTG 10 8 0． 80 2 0． 33
s264 CAGAAGCGGA 9 9 1． 00 4 0． 57
s275 ACACCGGAAC 10 9 0． 90 3 0． 33
s277 GTCCTGGGTT 9 8 0． 89 3 0． 43
s300 AGCCGTGGAA 9 9 1． 00 3 0． 43
s304 CCGCTACCGA 10 10 1． 00 2 0． 50
s317 GACACGGACC 12 12 1． 00 3 0． 60
s318 GACTAGGTGG 11 9 0． 82 3 0． 60
s327 CCAGGAGGAC 8 8 1． 00 1 0． 14
s328 GGGTGGGTAA 8 7 0． 88 0 0． 00
接下表
续表 1
引物
编号
引物序列
11种
黄连扩
增带
11种黄
连多态
性条带
11种黄
连多
态率
峨眉黄
连多态
性条带
峨眉黄
连多
态率
s331 CTCAGTCGCA 9 8 0． 89 2 0． 50
s345 CTCCATGGGG 8 7 0． 88 2 0． 29
s348 CATACCGTGG 9 9 1． 00 2 0． 50
s350 AAGCCCGAGG 12 11 0． 92 1 0． 25
s352 GTCCCGTGGT 11 11 1． 00 5 0． 71
s353 CCACACTACC 9 8 0． 89 2 0． 33
s361 CATTCGAGCC 13 12 0． 92 4 0． 50
s363 CCAGCTTAGG 9 9 1． 00 3 0． 43
s368 GAACACTGGG 11 11 1． 00 5 0． 45
s392 GGGCGGTACT 9 8 0． 89 3 0． 50
s404 GGCGGTTGTC 11 9 0． 82 4 0． 57
s407 CCGTGACTCA 10 8 0． 80 3 0． 43
s410 TCTGGCGCAC 8 5 0． 63 3 0． 50
s418 CACCATCCGT 11 11 1． 00 2 0． 22
s422 ACCAGGGGCA 9 8 0． 89 2 0． 40
s442 ACGTAGCGTC 11 10 0． 91 3 0． 38
s448 CCTCCAGTGT 12 12 1． 00 3 0． 38
s452 CAGTGCTGTG 11 11 1． 00 3 0． 60
s453 GTCAGAGTCC 11 10 0． 91 4 0． 44
s454 AGCATGGCTC 11 10 0． 91 2 0． 25
s463 CTGATACGCC 13 13 1． 00 3 0． 60
s464 GTGTCTCAGG 10 10 1． 00 4 0． 50
s465 CCCCGGTAAC 11 8 0． 73 3 0． 38
s489 GGCTAACCGA 10 10 1． 00 3 0． 60
s490 TGTGCCCGAA 10 10 1． 00 2 0． 33
s497 GAAGCCCTTG 10 10 1． 00 0 0． 00
s498 AGGCTGGGTG 7 6 0． 86 2 0． 33
s500 TCGCCCAGTC 10 9 0． 90 3 0． 50
s501 TGCGGGTCCT 14 13 0． 93 3 0． 30
s503 ACACAGAGGG 14 14 1． 00 5 0． 56
s515 GGACAACGAG 11 7 0． 64 2 0． 25
s519 CCTCCTCATC 9 7 0． 78 3 0． 43
s1015 CTACAGCGAG 11 11 1． 00 2 0． 33
s1017 CAGTGGGGAG 10 9 0． 90 0 0． 00
s1019 GGCAGTTCTC 12 12 1． 00 3 0． 43
s1022 AGCCGTTCAG 13 10 0． 77 2 0． 20
s1024 CTATCCTGCC 12 10 0． 83 2 0． 25
s1037 CCTCACGTCC 13 12 0． 92 2 0． 29
s1042 TCGCACAGTC 8 7 0． 88 1 0． 25
总数 771 688 0． 89 194 0． 38
2． 2 黄连属植物的聚类分析 基于 RAPD分析建立的 UP-
GMA聚类结果如图 1所示，在相似性系数 0． 72 的水平上可
将 11个样本分为中国黄连、三角叶黄连、峨眉黄连和线萼黄
连 4类，它们之间的明显差异主要是基于黄连属植物种间的
基因组不同。从图 1可看出，中国黄连与其他 3种黄连的亲
缘关系最远，单独聚为一支;其次是三角叶黄连，在同种水平
上(相似性系数大于 0． 84) ，相距很远的 2个生境的三角叶黄
连相似性极高而聚为一支;7个峨眉黄连样本聚为 2支，其中
采集于黄湾的峨眉黄连和采集于三道河的双翼型峨眉黄连
聚为一支，采集于白崖、人棚子沟的样本和三道河的凤尾型
蛾眉黄连聚为一支。
2． 3 峨眉黄连的遗传结构和基因流分析 从表 2 可见，由
Shannon指数估算的峨眉黄连遗传多样性指数为 0． 185 2，遗
传多样性在人棚子沟居群中最高(0． 094 1) ，在黄湾居群中
最低(0． 083 1) ，而白崖居群由于样本数量为 1，所以不存在
9464140 卷 30 期 韩 凡等 峨眉黄连及其近缘种的遗传多样性分析
图 1 11个不同生境黄连属植物的聚类分析
比较意义。但总体来说，3 个居群的 Shannon信息指数都偏
低，说明各居群之间的遗传差异并不大。由 Nei 指数计算的
基因多样性较 Shannon指数偏低，但 2 个指数所显示的遗传
多样性顺序保持一致，均为人棚子沟 ＞三道河 ＞黄湾。
表 2 峨眉黄连居群间遗传结构指数
居群 样本数
等位基因
数(na)
有效等位基
因数(ne)
Nei’s基因多
样性指数(h)
Shannon信息
指数(I)
黄湾 2 1． 137 5 1． 097 2 0． 056 9 0． 083 1
三道河 2 1． 145 3 1． 102 7 0． 060 2 0． 087 8
人棚子沟 2 1． 155 6 1． 110 1 0． 064 5 0． 094 1
白崖 1 1 1 0 0
居群水平 7 1． 333 3 1． 215 9 0． 012 5 0． 185 2
POPGENE分析结果显示(表 3) ，各居群之间的遗传距
离在 0． 070 6 ～0． 132 2之间，平均为 0． 098 7;遗传一致度在
0． 876 1 ～0． 931 9 之间，平均为 0． 906 3。根据遗传距离，构
建 4个居群的聚类图(图 2) ，黄湾居群和三道河居群的遗传
关系最近，聚为一支;其次是人棚子沟居群;白崖居群的遗传
距离最远。
表 3 峨眉黄连居群间遗传一致度和遗传距离
居群 黄湾 三道河 人棚子沟 白崖
黄湾 － 0． 931 9 0． 906 8 0． 876 1
三道河 0． 070 6 － 0． 931 7 0． 894 2
人棚子沟 0． 097 8 0． 070 8 － 0． 896 9
白崖 0． 132 2 0． 111 8 0． 108 8 －
注:对角线上方为 Nei遗传一致度，对角线下方为遗传距离。
IY :pop1．黄湾;pop2．三道河;pop3．人棚子沟;pop4．白崖。
图 2 峨眉黄连 4个居群间的遗传关系
3 讨论
该研究以 11 个黄连属植物样本为研究对象，利用
RAPD-PCR分子标记技术分析了种间的遗传多样性，并重点
探讨了采集于 4个生境峨眉黄连的遗传结构和基因流，结果
发现，黄连属植物种间具有较高的遗传多样性，通过分子标
记得到的 11个黄连属植物样本的遗传差异与形态学分类相
符，即可分为中国黄连、三角叶黄连、峨眉黄连和线萼黄连 4
种。在物种水平上，82 个引物扩增产物的多态率达
89. 37%。在居群水平上，峨眉黄连的多态率为 26%，shannon
信息指数为 0． 185 2。在单独分析了峨眉黄连 4个居群的遗
传结构后发现，黄湾和三道河居群间的亲缘关系较近，这与
宋良科等的研究结果基本一致［2，9］。对于唯一存在差异的样
本(凤尾型、三道河) ，笔者推测是不同表型(凤尾型、双翼
型)个体之间存在微小的遗传差异，但这个差异只存在于特
殊个体中。对于峨眉黄连基因组的遗传结构，生长环境仍然
起主导作用。
峨眉黄连各居群间的遗传分化指数(Gst)为 0． 368 0，基
因流(Nm)为 0． 291 2，表明有 36． 80%的变异是源于居群间
的，而 63． 20%的变异是存在于居群内的。峨眉黄连属有性
生殖，4个居群在地理位置上相隔较远，而居群间的基因流是
借助于花粉、种子、植株个体及携带遗传物质的物体为媒介
进行的［7］，相对低的基因流(Nm ＜1)可能是造成居群间遗传
分化的主要原因［8］。峨眉黄连在幼龄期植株小，根系不发
达，若在该时期遭遇稍大雨量会导致其的高死亡率［9］。因此
样本采集地的平均年降雨量(黄湾茶地 ＜ 三道河 ＜ 人棚子
沟) ，及黄湾茶地和三道河 2处生境在土壤酸碱度、年平均温
度方面较人棚子沟更为相似，为居群间的遗传差异提供了一
定的依据。
从遗传学的角度来看，丰富的遗传多样性意味着比较高
的适应能力和具有较大的育种和遗传改良能力［10］。通过以
上研究，笔者发现在自然条件下，峨眉黄连的野生种变异能
力有限，对生长环境的要求比较高。因而，应根据不同居群
的最佳生长条件对峨眉黄连实施就地保护，以维护其遗传多
样性。
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