全 文 ：砂生槐种子生物碱诱导 SGC-7901细胞凋亡的实验研究
马兴铭1 , 2 , 　李红玉1＊ , 　尹少甫2 , 　王　波3
(1.兰州大学生命科学院 ,甘肃 兰州 730000;2.兰州医学院基础医学院免疫学教研室;3.甘肃省康复中心 ,
甘肃 兰州 730000)
收稿日期:2004-01-10
作者简介:马兴铭(1969～ ),甘肃人 ,硕士 ,副教授 ,主要从事中药免疫调控机理和抗菌药物合成与筛选的研究工作 ,电话:09313683993 , E-
mail:mingxm@163.com。
＊通讯联系人。
关键词:砂生槐;生成碱;抑瘤;细胞凋亡;SGC-7901 细胞
摘要:目的:研究砂生槐生物碱对 SGC-7901细胞系的增殖抑制和凋亡诱导作用。方法:M TT 比色法检测生物碱对 SGC-
7901 胃癌细胞增殖的抑制作用;荧光显微镜观察细胞的形态学改变;琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡过程中 DNA碎片
的形成;流式细胞仪分析并测定细胞凋亡率。结果:砂生槐生物碱在 0.6 ～ 4.8mg·mL-1的范围内对 SGC-7901 胃癌细胞
的增殖有明显抑制作用 ,与 SGC-7901 细胞株共培养 24h 后 , 观察到典型的细胞凋亡形态学特征 , DNA 凝胶电泳呈现梯
形条带 ,流式细胞仪检测形成一个 DNA 含量<2n 的分布区 ,即“亚 G1 峰” 。结论:砂生槐生物碱在体外明显抑制 SGC-
7901 胃癌细胞的增殖 ,诱导 SGC-7901 细胞系凋亡的作用 , 并呈浓度 、时间的依赖关系。
中图分类号:R285.5　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2004)08-0654-03
Apoptosis in SGC-7901 cells induced by alkaloids from Sophora moorcroftiana
seed
MA Xing-ming1 ,2 , 　LI Hong-yu1＊ , 　YIN Shao-fu2 , 　WANG Bo3
(1 .S chool of Li fe Sciences , Lanzhou Universi ty , Lanzhou 730000 , China;2.Lanzhou Medicine Univerisit y , Lanzhou 730000 , China;3 .
Gangsu Medica n Rehahi li lat ion Centra , Lanzhou 730000 , China)
KEYWORDS:Sophora Moorcrof tiana;alkaloid;inhibiting tumour;apoptosis;SGC-7901 cells
ABSTRACT:AIM:To study inhibit ing proliferation and inducting apoptosis activity of alkaloids f rom Sophora
moorcrof tiana seed in SGC-7901 cells.METHODS:Inhibition of proliferation w as measured by M TT assay ,
Morphological assessment of apoptosis w as performed wi th fluorescence microscope;DNA fragmentation was vi-
sualized by agarose gel electrophoresis;The amount of apoptosis cells w as measured by f low cy tometry.RE-
SULTS:SGC-7901 cells proliferation was inhibi ted by the alkaloids f rom Sophora moorcrof tiana seeds(0.6-4.
8 mg·mL-1).After t reatment w ith alkaloids fo r 24 h , morphological changes of typical apoptosis were observed
and agarose gel electropho resis of DNA revealed “ ladder” pat tern and the amount of apoptosis cells in sub-G1-
phase position was measured by flow cy tometry.CONCLUSION:Alkaloids f rom Sophora moorcrof t iana seed
inhibit proliferation and induct apoptosis of SGC-7901 cells with a alkaloid variety of time-and-dose in vit ro.
　　砂生槐(Sophora Moorcrof tiana)又名“西藏狼
牙刺” 、“刺柴” ,豆科槐属 。多年生矮灌木 ,其茎尖和
托叶硬化为尖长刺 ,产于西藏波密 、拉萨 、米林等地 ,
为西藏高原特有植物种 ,具有极强的抗旱 、耐瘠薄 、
抗风沙等生态适应性和很好的防风固沙 、保持水土
的功能。在雅鲁藏布江河谷呈大片分布[ 1] 。藏医
药记载[ 2]砂生槐多以种子入药 ,味苦性凉 ,消炎解
毒 、催吐 ,主治湿热黄疸 、白喉 、痢疾 、赤巴病 、消化不
良 、虫病等。是一种极为宝贵的药用植物资源 。但
是目前当地群众仅利用其植株作为生活燃料或牲畜
饲料 ,造成极大地浪费 。为充分开发其药物利用价
值 ,我们首次从砂生槐种子中提取了亲脂性总生物
碱 ,以人胃癌 SGC-7901细胞为研究对象 ,研究砂生
槐生物碱对 SGC-7901细胞系的增殖抑制和凋亡诱
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导作用 ,为开发砂生槐这一宝贵植物资源的药用价
值积累理论依据 。
1　材料与方法
1.1　细胞系与药物　人胃癌 SGC-7901 细胞引自
兰州军区总医院 ,砂生槐生物碱用二甲亚砜(DM-
SO)配成 70.4mg·mL-1储液。DMSO 终浓度小于
0.1%, -20°C 冰箱保存 ,实验时用细胞培养液稀
释。
1.2　试剂与仪器　RPM I-1640粉剂 、四氮噻唑蓝
(MTT)、琼脂糖 、吖啶橙 、碘化丙锭(PI)均为华美公
司产品;DG-3022酶联免疫测定仪(华东电子医疗设
备厂);超净工作台;CO2 细胞培养箱;倒置显微镜
(OLYMPUS);荧光显微镜(OLYMPUS VANOX);
HV-3000 多用电泳仪;流式细胞仪(EPICS XL;
Coulter ,USA)。
1.3　MTT 比色法[ 3] 　生长于 RPM I-1640 完全细
胞培养液(含 10%灭活小牛血清 、L-谷氨酰胺
2mmol·L-1 、青霉素和链霉素各 100IU·L-1)中的指
数生长期细胞 ,以 1.5×105 个·mL -1的浓度接种于
96孔塑料培养板 ,每孔 100μL。设阴性对照组(不
加药物 ,加 0.1%二甲亚砜)、药物组(分别加不同浓
度的生物碱 ,每组 4 复孔)和调零孔(RPMI-1640 全
培养液)。置 37°C 、5%CO2 饱和湿度的培养箱中培
养 24 , 48 , 72h ,实验终止前 4h 每孔加入 MTT 液
10μL , 孵育结束时 , 弃取上清 , 加入二甲亚砜
150μL ,振荡器振荡摇匀 , 用酶联免疫检测仪于
570nm波长处测定各孔的 OD值 。实验重复 3次 ,
按下式求出抑制率:抑制率(%)=(对照组 OD均值
-实验组 OD均值)/对照组OD均值×100%。
1.4　荧光显微镜细胞形态观察[ 4] 　对数生长的胃
癌SGC-7901细胞 1×105/mL 分别与不同浓度的砂
生槐生物碱共同孵育 24h 后 ,收集细胞 , PBS(pH =
7.2)洗涤 ,取 100μL 细胞悬液涂于洁净的载玻片
上 ,吖啶橙荧光染色 ,加盖玻片封片 ,置荧光显微镜
下观察细胞凋亡形态并照相 。
1.5　细胞群染色体 DNA 断裂的测定[ 5] 　培养 48h
后的细胞悬液(约 2×106 个),离心收集 , PBS洗涤1
次 ,在 1.5mL 离心管中 ,离心去上清 ,加 50μL 细胞
裂解液 ,10μL 蛋白酶 K ,混匀 ,于 37°C 水浴保温至
混合物变清亮 ,以室温离心 5min ,将上清液移至另
一 1.5mL 离心管中 ,以等体积的苯砜-氯仿(1∶1)、
苯砜-氯仿-异丙醇(25∶24∶1)和氯仿各抽提 1次 ,在
上清液中加入 1/10体积 3mol·L-1醋酸钠和二倍体
积冷乙醇 , -20 °C 沉淀过夜。次日 , 4°C , 离心
10min ,收集沉淀 , 溶于 20μLTE 缓冲液中 , 加入
1μLRNase , 37 °C 保温 1h。取 10μL DNA 溶液于
1μL 0.25%溴砜蓝混匀 ,立即加入含 0.4μg·mL-1
溴化乙锭的 1.5%琼脂糖凝胶的样品孔中 ,室温 、恒
压恒流 ,于 1×TAE缓冲液中电泳 1 ～ 2h ,紫外灯下
观察并照相 。
1.6　流式细胞仪测定凋亡细胞百分率　药物作用
过的细胞悬液(细胞数约 2×106 个)离心 , PBS 洗涤
2次 , 70%冷乙醇固定 24h ,离心弃乙醇 ,PBS洗涤 1
次 ,滴加已配好的 200μL·mL-1 RNase 0.5mL ,放置
4h以上 ,离心弃上清液 , PBS 洗涤 1次 ,加 0.5mL
碘化丙锭(PI),过夜 ,离心弃 PI , 再用 PBS 洗涤 1
次 ,立即上机 。
1.7　统计　实验数据经 SPSS(11.0)专业软件处
理 ,采用均数±标准差( x ±s)表示。
2　实验结果
2.1　对胃癌 SGC-7901细胞增殖的抑制作用　由
Tab 1 可以看出砂生槐生物碱在 0.6 ～ 4.8mg·
mL-1的范围内均对人胃癌 SGC-7901 细胞的增殖
有明显的抑制作用 ,且抑制作用随药物浓度的增加
和作用时间的延长而增强。
Table 1　 Antiproliferative effect of alkaloids on SGC-7901 cells(n=6 x±s)
Concent rat ion
(mg·mL -1)
24h 48h 72h
OD570nm IR OD570nm IR OD 570nm I R
0.0 0.76±0.03 0.00 0.93±0.05 0.00 1.01±0.13 0.00
0.6 0.65±0.051) 13.53 0.71±0.042) 23.26 0.74±0.012) 27.16
1.2 0.57±0.042) 25.41 0.62±0.032) 33.06 0.61±0.033) 39.75
2.4 0.43±0.042) 42.89 0.31±0.053) 61.13 0.32±0.043) 68.64
4.8 0.40±0.053) 47.76 0.36±0.013) 66.39 0.18±0.033) 82.22
　　(I R:Inhibitory rate %)1)P>0.05 , 2)P<0.05 , 3)P<0.01 vs cont rol.
2.2　诱导 SGC-7901 胃癌细胞凋亡的细胞形态学
观察　0.8 ～ 3.2mg·mL-1的砂生槐子生物碱与
SGC-7901胃癌细胞株共培养 24h ,在荧光显微镜下
可观察到凋亡细胞形态特征:如细胞皱缩 、膜起泡 、
核碎裂和凋亡小体形成等(Fig1)。
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Fig 1　Fluorescence(Acridine orange stain)of SGC-7901 cells
treated with alkaloids(1.6mg·mL-1)for 24h
(A)cont rol , ×200　(B)cells t reated w ith alkaloids, ×200
2.3　砂生槐子生物碱诱导 SGC-7901 胃癌细胞凋
亡的 DNA电泳结果　0.8 ～ 1.6mg·mL-1的砂生槐
子生物碱与SGC-7901胃癌细胞株共培养 48h ,在琼
脂糖凝胶上进行电泳 ,出现明显的具有生化特征的
“DNA Ladder” ,而对照组(0.1%DMSO)则无此特
征出现(Fig2)。
Fig 2 　Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from
SGC-7901 cells treated with alkaloids for 48h
A:cont rol;B:0.8mg·mL -1;C:1.6mg·mL -1
2.4　诱导 SGC-7901 胃癌细胞凋亡的流式细胞仪
测定结果　指数生长的胃癌 SGC-7901细胞株与 0.
8 ～ 1.6mg·mL-1的砂生槐子生物碱共培养 24h ,经
流式细胞仪测定 ,从细胞周期图上可以看出 , G1 峰
前出现的亚二倍体峰 ,即凋亡细胞所形成的凋亡峰
(亚 G1 峰),是凋亡细胞核固缩 、DNA 裂解的特征结
果 ,可通过凋亡峰的面积测出凋亡细胞在整个细胞
群中所占比例。流式细胞仪分析显示生物碱作用细
胞 24h后 ,G1 峰前出现了凋亡峰 ,凋亡细胞百分率
(AP)分别为12.9%、14.2%,而对照组细胞G1峰前
无凋亡峰存在。
3　分析讨论
文献报道[ 6] 细胞增殖与 G1 期发生的事件有
关 ,G1期可能存在一个限制点(R点),该点可能受
一系列环境信号的影响 ,如果能通过此点 ,细胞可以
继续生长进入S 期而完成细胞分裂 ,肿瘤细胞则失
去这种控制 。本实验用 MT T 法通过测定细胞线粒
体能量代谢水平间接反应细胞的增殖情况 ,结果表
明砂生槐子生物碱在 0.6 ～ 4.8mg·mL-1浓度范围
下均对胃癌 SGC-7901细胞的增殖有明显的抑制作
用 ,且抑制作用随药物浓度的增加和作用时间的延
长而增强 ,表明砂生槐子生物碱可能影响 G1期发
生的事件或调节 R点而抑制肿瘤细胞增殖 。
细胞凋亡[ 7]是有别于坏死的细胞主动性自杀 ,
是受多基因控制的有序性死亡过程。诱导肿瘤细胞
凋亡和进一步阐明凋亡的基因调控机制是目前肿瘤
治疗的研究热点 。本实验的荧光显微镜 、琼脂糖凝
胶电泳及流式细胞仪测定结果均证实砂生槐子生物
碱体外具有较为显著的诱导胃癌 SGC-7901 细胞凋
亡作用 ,由砂生槐 3还可看出 ,细胞经药物作用后 S
期细胞比例均明显减少 ,抑制细胞进入S 期 ,使细胞
在 G1期堆积 ,说明砂生槐子生物碱可能通过作用
于 G1期诱导细胞凋亡 。
崔建芳[ 8] 等人用薄层光密度法分析砂生槐种
子至少含有 4种生物碱:1.64%氧化苦参碱 、0.5%
氧化槐果碱 、0.172%苦参碱 、0.005%槐果碱。有关
来源于其它植物的 4种生物碱活性研究已经有多篇
报道 ,具有调节 Bcl-2蛋白表达 、抗肿瘤 、抑菌 、抑病
毒 、抗心率失常 、正性肌力 、抗缺氧 、扩血管 、降血脂 、
调节免疫等多种药理学作用 ,张百红[ 9]等报道苦参
碱具有诱导胃癌 SGC-7901 细胞凋亡的作用 ,但使
SGC-7901细胞阻滞于 S期 ,造成 S 期细胞堆积这一
点与本研究结果不同 ,砂生槐种子总生物碱诱导细
胞凋亡效应是否是由这些生物碱引起 ,还是由砂生
槐特有的生物碱引起 ,我们目前正在继续研究 ,而且
已经申请了这方面的专利(No:03134552.2)。
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肝长春口服液保肝抗纤维化作用的实验研究
朴云峰 , 　高普均 , 　王英凯 , 　郭晓林 , 　吴　扬 , 　时　阳
(吉林大学第一医院消化科 ,吉林 长春 130021)
收稿日期:2003-04-20
基金项目:本课题受吉林省科技厅资助(No:20000309)。
作者简介:朴云峰(1948～ ),男 ,长春市人 ,博士生导师 ,教授 , 消化科主任。研究方向:肝癌细胞端粒酶活性的检测及基因表达。联系电
话:0431-5612372。
关键词:肝长春口服液;肝纤维化;四氯化碳
摘要:目的:观察中药肝长春(鳖甲 、人参 、水蛭 、黄芪等)的保肝抗肝纤维化作用。方法:用四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模
型 ,观察肝长春对大鼠肝功能 、透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层粘蛋白(LN)及肝组织病理学影响。结果:肝长春能显
著降低肝纤维化大鼠血清转氨酶 、HA、LN 及Ⅳ-C(P <0.05), 并减轻肝脏的纤维增生程度(P<0.01)。结论:肝长春对
大鼠实验性肝纤维化具有预防和治疗作用。
中图分类号:R285.6　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2004)08-0657-02
Effect of Ganchangchun Oral Liquid on liver-protection and anti-fibrosis
PIAO Yun-feng , 　GAO Pu-jun , 　WANG Ying-kai , 　GUO Xiao-lin , 　WU Yang , 　SHI Yang
(Depar tment of Gastroenterology , First Hospi ta l , Ji lin University , Changchun 130021 , China)
KEYWORDS:Ganchangchun o ral liquid;hepatic fibrosis;carbon tet rachloride
ABSTRACT:AIM:To observe the ef fect of the liver-protection and anti-fibrosis of Ganchangchun Oral Liquid
(Carapax T .rionycis , Radix Ganseng Hirudo , Radix Astrag ali , etc.)METHODS:Hepatic fibrotic rat model
w as induced w ith carbon tetrachloride.The effect of Ganchangchun Oral Liquid on hepatic function , hyaluronic
acid(HA), ty pe Ⅳ collagen (Ⅳ-C), laminin(LN)and hepatic histopathology of the rats were detected.RE-
SULTS:Ganchangchun Oral L iquid could decrease the level of t ransaminase , HA , LN and Ⅳ-C in the serum of
rats wi th hepatic fibrosis signif icantly.Meanwhile , it could relieve the fibrotic deg ree of liver.CONCLUSION:
To experimental rat with hepatic f ibrosis , Ganchangchun Oral Liquid has prevent ion and treatment effect.
　　目前抗肝纤维化的药物很多 ,如秋水仙碱 、γ-干
扰素 、前列腺素 E 等 ,疗效皆不理想 ,且副作用较
大 ,难以应用于临床。我们在总结临床治疗经验的
基础上 ,制定以“软坚消症为主 ,攻补兼施”的中药复
方制剂肝长春口服液 ,以秋水仙碱为对照 ,通过大鼠
实验性肝纤维化模型 ,观察肝长春的保肝及抗肝纤
维化作用 。
1　材料和方法
1.1　材料及动物
肝长春为含有鳖甲 、人参 、水蛭 、黄芪 、三棱 、莪
术 、柴胡等中药的复方制剂 ,由吉林大学第一医院制
剂室加工成口服液 。动物:Wistar大鼠 150只 ,体重
180 ～ 200g , ♀♂各半 ,由吉林大学白求恩医学部动
物部提供。透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型
胶原(Ⅳ-C)放射免疫分析测定试剂盒为上海海军医
学研究所产品。
1.2　造模及用药
将 150 只大鼠随机分为 6 组:正常对照组(25
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