全 文 ：第４１卷 第１０期
２０１３年１０月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４１ Ｎｏ．１０
Ｏｃｔ．２０１３
网络出版时间：２０１３－０９－２２ １７：０９
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１３０９２２．１７０９．０２６．ｈｔｍｌ
东北山樱桃核总黄酮成分双水相萃取条件的优化
［收稿日期］ ２０１２－１２－０３
［基金项目］ 吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（２０１２０１３８）
［作者简介］ 陈丽华（１９６８－），女，吉林吉林人，副编审，硕士，主要从事天然药物提取研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｈｄｘｃｌｈ＠１２６．ｃｏｍ
陈丽华
（《北华大学学报》编辑部，吉林 吉林１３２０００）
［摘 要］ 【目的】探究聚乙二醇－硫酸铵双水相体系在东北山樱桃核总黄酮成分分离纯化中的应用，并确定最
佳萃取条件。【方法】采取单因素试验，分析聚乙二醇相对分子质量、聚乙二醇－硫酸铵质量比、ｐＨ、温度对东北山樱
桃核总黄酮成分得率的影响，对双水相萃取条件进行优化筛选，并对筛选出的聚乙二醇－硫酸铵双水相萃取最佳体系
分离纯化东北山樱桃核总黄酮成分的效果进行检验。【结果】在聚乙二醇相对分子质量为４００、ｍ（聚乙二醇）∶ｍ（硫
酸铵）＝１∶１．５、ｐＨ为５．６、温度为５０℃的条件下，东北山樱桃核总黄酮成分的得率最高，两相间平均分配系数为
１３０．６６，东北山樱桃核总黄酮的平均得率为９９．９５％。【结论】在最佳双水相萃取条件下，东北山樱桃核总黄酮的得率
较高，两相间分配系数较大，且该方法快速简便，结果稳定可靠。
［关键词］ 东北山樱桃核；总黄酮；分离纯化；双水相萃取；聚乙二醇；硫酸铵
［中图分类号］ Ｒ２８４．２ ［文献标志码］ Ａ ［文章编号］ １６７１－９３８７（２０１３）１０－０１３７－０６
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ
Ｃｅｒａｓｕｓ ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｍ ｕｓｉｎｇ Ｔｗｏ－Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ
ＣＨＥＮ Ｌｉ－ｈｕａ
（Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｅｉｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ，Ｊｉｌｉｎ１３２０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ
ｓｕｌｆａｔｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍＣｅｒａｓｕｓ ｓａｃｈａ－
ｌｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｍ，ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｆｏｕｒ ｆａｃｔｏｒｓ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ｐｏｌｙｅｔｈｙ－
ｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｒａｔｉｏ，ｐＨ ｖａｌｕｅ，ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｃ．ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｍ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｏｕｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｔｏ ｄｏ ｔｈｅ ｖｅｒｉｆｉｃａ－
ｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｗｈｅｎ ＰＥＧ４００ｗａｓ
ｕｓｅｄ，ＰＥＧ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｗａｓ １∶１．５，ｐＨ ｗａｓ ５．６，ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ５０℃，ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃ－
ｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｐｈａｓｅｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ １３０．６６ａｎｄ
ｔｈｅ ｇｅｔｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ９９．９５％．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｒａｔｅ
ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｃ．ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ
ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｅｒａｓｕｓ ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｍ ｓｔｏｎｅ；ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）；ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ
DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2013.10.010
东北山樱桃又称东北黑山樱、毛樱桃等，是长白
山脉道地植物野生山樱桃的果实。东北山樱桃核总
黄酮是果实的次级代谢产物，主要含有花色苷、褪黑
素、异槲皮素等活性成分，具有良好的药用价值［１－２］；
同时由于东北山樱桃的药食同源性，开发其总黄酮
类化合物产品易于被接受，故具有良好的经济意义。
笔者经多年的研究已经证实，东北山樱桃核总黄酮
具有显著的抗冻伤［３］和治疗风湿的作用［４］，相关成
果已经申报专利或已进行转产性研究。笔者采用常
规有机溶剂萃取总黄酮时发现，东北山樱桃总黄酮
的提取率在８０％左右且萃取时间长［５］，加之萃取溶
剂具有毒性［６］，因而不便于工业化生产。聚乙二醇
（ＰＥＧ）为药用辅料［７］，是毒性极低的一种良好溶剂，
符合工业化生产的要求［８］。资料检索发现，以ＰＥＧ－
硫酸铵组成的双水相萃取体系在国外已逐渐应用于
生物蛋白类、黄酮类等物质的分离纯化，得率较高，
能较大程度地保留所得物质的生物学活性［９］，但至
今尚未见将该方法应用于东北山樱桃核总黄酮类化
合物分离纯化的报道。鉴于此，笔者将ＰＥＧ－硫酸铵
双水相萃取体系应用于东北山樱桃核总黄酮类化合
物的分离与纯化，并对该萃取体系进行了优化筛选，
旨在为ＰＥＧ－硫酸铵双水相萃取体系的推广应用和
东北山樱桃核总黄酮的药用资源开发提供支持。
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
东北山樱桃核醇提原液：将东北山樱桃核粉碎
过孔径０．１８０ｍｍ（８０目）筛，在体积分数９５％乙醇
中超声提取４５ｍｉｎ，回收溶剂后所剩余液即是。
试剂：芦丁标准品（ＵＶ≥９８％），购自北京世纪
奥科生物技术有限公司；硫酸铵、不同相对分子质量
的ＰＥＧ等试剂，均为国产分析纯；蒸馏水，为北华大
学生命科学中心实验室自制重蒸馏水。
仪器：紫外分光光度计（ＵＶ－２５５０型），日本岛
津；电子分析天平（ＡＬ２０４－ＩＣ型），瑞士梅特勒；ｐＨ
计（ＰＨＢＪ－２６０型），上海三本环保科技有限公司；旋
转蒸发仪（ＲＥ－５２型），上海亚荣；恒温磁力搅拌器
（８５－２型），江苏省金坛市环宇科学仪器厂。
１．２ 方 法
１．２．１ 双水相体系的制备 双水相萃取体系制备
的空间环境为室温，空气相对湿度３０％～７０％。具
体制备方法为：在５０ｍＬ烧杯中加入２０ｍＬ东北山
樱桃核醇提原液，再加入适量的ＰＥＧ、硫酸铵，将烧
杯置于恒温磁力搅拌器上水浴加热，温度设定为５０
℃，缓慢搅拌至ＰＥＧ全部溶解后继续搅拌２０ｍｉｎ。
搅拌结束后迅速将溶液转移至分液漏斗中，静置；待
溶液分为上下２层，其中上层为ＰＥＧ相，下层为盐
水相，总黄酮类化合物富集于上相中，记录上下相的
体积，分别留取上下相样品计算总黄酮质量浓度和
纯度。
１．２．２ 总黄酮质量浓度的检测 １）芦丁标准溶液
配制。取芦丁标准品干燥至质量恒定，准确称取
０．０７５ ０ｇ，转移至含体积分数３０％乙醇的烧杯中，
并置于６０℃恒温水浴锅中加热，振荡使标准品完全
溶解，转移至２５０ｍＬ容量瓶中，继续补加体积分数
３０％乙醇至刻度，振摇均匀即得芦丁标准溶液（质量
浓度为０．３００ ０ｇ／Ｌ）。２）芦丁标准溶液吸光度测
量。准确移取一定量的芦丁标准溶液于２５ｍＬ容
量瓶中，加入０．５ｍｏｌ／Ｌ的 ＡｌＣｌ３１．０ｍＬ振荡摇
匀，放置１５ｍｉｎ，待溶液稳定后，用ｐＨ＝５．８的
ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲溶液缓慢补充定容至刻度，振荡摇
匀，５ｍｉｎ后用１ｃｍ比色皿，在４１５ｎｍ波长处测定
其吸光度，根据芦丁不同质量浓度（Ｃ）所得的吸光
度值（Ａ）绘制标准曲线（图１），回归分析得Ａ ＝
０．０３０ ９ Ｃ＋０．０２７ ７，Ｒ２＝０．９９９ ７。
图１ 芦丁标准溶液吸光度与芦丁质量浓度的关系
Ｆｉｇ．１ Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｒｕｔｉｎ
ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｑｕａｌｉｔｙ
总黄酮质量浓度的检测采用 ＡｌＣｌ３ 测定法，总
黄酮待测液同样按照上述步骤测量，得到吸光度Ａ
后按下式计算质量浓度Ｃ（ｍｇ／Ｌ）：
Ｃ＝（Ａ－０．０２７ ７）／０．０３０ ９。
１．３ 东北山樱桃核总黄酮双水相萃取体系萃取条
件的选择
１．３．１ ＰＥＧ最佳相对分子质量 向东北山樱桃核
总黄酮双水相萃取体系中加入 ＰＥＧ－硫酸铵溶液
（ｍ （ＰＥＧ）∶ｍ（硫酸铵）＝１∶１．５），其中ＰＥＧ相对
分子质量选择４００，６００，１ ０００，２ ０００和４ ０００，在ｐＨ
８３１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
为６、温度为５０℃的条件下进行萃取试验，分别测
定各试验组的上相总体积（ＶＳ）、下相总体积（ＶＸ）、
相比（γ）、东北山樱桃核总黄酮在双水相体系两相间
的分配系数（Κ）、总黄酮得率（Ｙ），筛选双水相萃取
东北山樱桃核总黄酮的ＰＥＧ最适相对分子质量。
１．３．２ 最适硫酸铵加入量 向东北山樱桃核总黄
酮双 水 相 萃 取 体 系 中 加 入 ＰＥＧ－硫 酸 铵 溶 液
（ｍ （ＰＥＧ）∶ｍ（硫酸铵）＝１∶１，１∶１．２，１∶１．５，
１∶１．７，１∶２），选用相对分子质量为４００的ＰＥＧ，
在ｐＨ为６、温度为５０℃的条件下进行萃取试验，分
别测定各试验组的ＶＳ、ＶＸ、γ、Κ和Ｙ，筛选双水相萃
取东北山樱桃核总黄酮的最适硫酸铵加入量。
１．３．３ 最适ｐＨ 值 分别调节东北山樱桃核总黄
酮双水相萃取体系中的ｐＨ为３．２，４．７，５．６，６．８和
７．５，加入 ＰＥＧ－硫酸铵溶液（ｍ（ＰＥＧ）∶ｍ（硫酸
铵）＝１∶１．５），选用相对分子质量为４００的ＰＥＧ，
在温度为５０℃的条件下进行萃取试验，分别测定各
试验组的ＶＳ、ＶＸ、γ、Κ和Ｙ，筛选双水相萃取东北山
樱桃核总黄酮的最适ｐＨ值。
１．３．４ 最适萃取温度 设定东北山樱桃核总黄酮
双水相萃取体系的工作温度为３５，４０，４５，５０和５５
℃，加入 ＰＥＧ－硫酸铵溶液（ｍ（ＰＥＧ）∶ｍ（硫酸
铵）＝１∶１．５），选用相对分子质量为４００的ＰＥＧ，
在ｐＨ为６的条件下进行萃取试验，分别测定各试
验组的ＶＳ、ＶＸ、γ、Κ和Ｙ，筛选双水相萃取东北山樱
桃核总黄酮的最适温度。
１．４ 双水相萃取体系最优萃取条件的验证
根据各单因素试验确定的最佳提取条件，进行
３次平行试验作为验证性试验，分别测定各试验组
的ＶＳ、ＶＸ、γ、Κ和Ｙ，以验证最佳提取条件的可靠性
和稳定性。
１．５ 相关指标的计算
１）萃取液相比（γ）（两相体积比）。计算公式为：
γ＝ＶＳ／ＶＸ。
式中：ＶＳ 为上相总体积（ｍＬ），ＶＸ 为下相总体积
（ｍＬ）。
２）萃取液两相间的分配系数（Κ）。计算公式
为：
Κ＝ＣＳ／ＣＸ。
式中：ＣＳ 为上相中总黄酮质量浓度（ｍｇ／Ｌ），ＣＸ 为
下相中总黄酮质量浓度（ｍｇ／Ｌ）。
３）萃取液两相间质量比（Ｇ）。计算公式为：
Ｇ＝Κ（ＶＳ／ＶＸ）＝Κ·γ。
４）萃取液萃取得率（Ｙ）。计算公式为：
Ｙ＝１／（１＋１／Ｇ）×１００％。
２ 结果与分析
２．１ ＰＥＧ相对分子质量对东北山樱桃核总黄酮提
取效果的影响
在设定的试验条件下，用相对分子质量不同的
ＰＥＧ进行东北山樱桃核总黄酮的萃取试验，各试验
组的测定结果如表１所示。由表１中各试验组的相
比（γ）、分配系数（Κ）和总黄酮得率（Ｙ）可以得出，用
于东北山樱桃核总黄酮提取的最佳ＰＥＧ相对分子
质量为４００。
表１ 不同相对分子质量ＰＥＧ对东北山樱桃核总黄酮双水相提取效果的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＰＥＧ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍＣ．ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｍ
ＰＥＧ相对分子质量
ＰＥＧ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ
ＶＳ／ｍＬ ＶＸ／ｍＬ γ Κ Ｙ／％
４００ １０．１０ １０．１０ １．００ １２８．４７ ９９．９３
６００ １０．１０ １０．３０ ０．９８ １７３．２５ ９９．９２
１ ０００ １０．１０ １０．８０ ０．９４ ２１８．３９ ９９．９５
２ ０００ １０．００ １１．２０ ０．８９ ２９１．３１ ９９．９３
４ ０００ ９．３０ １１．８０ ０．７９ ３８６．４１ ９９．８７
２．２ 硫酸铵加入量对东北山樱桃核总黄酮提取效
果的影响
在设定的试验条件下，固定相对分子质量为
４００的ＰＥＧ的质量，改变硫酸铵的质量，获得不同
质量比的ＰＥＧ－硫酸铵双水相萃取体系，进行萃取试
验，各试验组的测定结果如表２所示。由表２中各
组的相比（γ）、分配系数（Κ）和总黄酮得率（Ｙ），可以
得出用于东北山樱桃核总黄酮提取的最佳ＰＥＧ－硫
酸铵溶液中ｍ（ＰＥＧ）∶ｍ（硫酸铵）＝１∶１．５。
２．３ ｐＨ 值对东北山樱桃核总黄酮提取效果的
影响
根据设定的试验条件，采用相对分子质量为
４００的ＰＥＧ和ｍ（ＰＥＧ）∶ｍ（硫酸铵）＝１∶１．５，调
节体系ｐＨ值进行萃取试验，各试验组的测定结果
见表３。由表３中各组的相比（γ）、分配系数（Κ）和
总黄酮得率（Ｙ），可以得出ｐＨ 在５．６～６．８时提取
９３１第１０期 陈丽华：东北山樱桃核总黄酮成分双水相萃取条件的优化
效果差异较小。试验发现，萃取液在初始状态下的
ｐＨ值均处于上述区间，故认为在东北山樱桃核总
黄酮提取中不必调节萃取液ｐＨ值。
表２ 硫酸铵不同加入量对东北山樱桃核总黄酮双水相提取效果的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍＣ．ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｍ
ｍ（ＰＥＧ）∶ｍ（硫酸铵）
ｍ（ＰＥＧ）∶ｍ（（ＮＨ４）２ＳＯ４）
ＶＳ／ｍＬ ＶＸ／ｍＬ γ Κ Ｙ／％
１∶１ １０．５０ ９．８０ １．０７ １０９．７０ ９９．８６
１∶１．２ １０．１０ １０．１０ １．００ １１６．５３ ９９．８９
１∶１．５ １０．１０ １０．１０ １．００ １２８．４７ ９９．９３
１∶１．７ １０．１０ １０．１０ １．００ １２４．７３ ９９．９０
１∶２ １０．００ １０．５０ ０．９５ １２８．５１ ９９．８２
表３ 体系ｐＨ值对东北山樱桃核总黄酮双水相提取效果的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍＣ．ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｍ
ｐＨ ＶＳ／ｍＬ ＶＸ／ｍＬ γ Κ Ｙ／％
３．２ ９．６０ １０．５０ ０．９１ １２９．３０ ９９．８９
４．７ ９．９０ １０．３０ ０．９６ １２８．１８ ９９．９１
５．６ １０．１０ １０．１０ １．００ １２８．４７ ９９．９３
６．８ １０．００ １０．１０ ０．９９ １２８．５１ ９９．８９
７．５ ９．１０ １１．２０ ０．８１ １３６．３２ ９９．６１
２．４ 萃取温度对东北山樱桃核总黄酮提取效果的
影响
根据设定的试验条件，采用相对分子质量为
４００的ＰＥＧ和ｍ（ＰＥＧ）∶ｍ（硫酸铵）＝１∶１．５，萃
取液ｐＨ值为６，设定不同系统温度进行萃取试验，
各试验组的测定结果见表４。由表４中各组的相比
（γ）、分配系数（Κ）和总黄酮得率（Ｙ），可以得出最佳
提取温度为５５℃，但由于５０与５５℃时提取效果相
差不大，出于保护总黄酮活性的考虑，最终确定最佳
萃取温度为５０℃。
表４ 不同萃取温度对东北山樱桃核总黄酮双水相提取效果的影响
Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍＣ．ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｍ
温度／℃
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ＶＳ／ｍＬ ＶＸ／ｍＬ γ Κ Ｙ／％
３５ １０．１０ １０．１０ １．００ １２８．３２ ９９．９２
４０ １０．１０ １０．１０ １．００ １２８．７４ ９９．９１
４５ １０．１０ １０．１０ １．００ １２９．８５ ９９．９４
５０ １０．００ １０．２０ ０．９８ １３１．５１ ９９．９６
５５ ９．８０ １０．５０ ０．９３ １３１．６８ ９９．９５
２．５ 东北山樱桃核总黄酮最佳双水相萃取体系的
验证
根据前述试验结果，选择相对分子质量为４００
的ＰＥＧ，按ｍ（ＰＥＧ）∶ｍ（硫酸铵）＝１∶１．５称取适
量硫酸铵加入到萃取液中，在原始ｐＨ 值下，于５０
℃提取２ｈ，按上述条件重复３次进行平行试验，结
果见表５。结合表５中各试验组的相比（γ）、分配系
数（Κ）和总黄酮得率（Ｙ）可以得出：本试验选择出的
最佳条件是稳定且适宜的，该体系平均相比为１．００，
平均分配系数为１３０．６６，平均得率９９．９５％。
表５ 东北山樱桃核总黄酮双水相萃取体系的重复验证试验结果
Ｔａｂｌｅ ５ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍＣ．ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｍ
序号
Ｎｏ． ＶＳ
／ｍＬ ＶＸ／ｍＬ γ Κ Ｙ／％
１ １０．１０ １０．１０ １．００ １２９．９８ ９９．９３
２ １０．１０ １０．２０ ０．９９ １３０．８６ ９９．９６
３ １０．１０ １０．１０ １．００ １３１．１３ ９９．９５
平均 Ａｖｅｒａｇｅ １０．１０ １０．１３ １．００ １３０．６６ ９９．９５
３ 讨论与结论
从本试验结果可以看出，东北山樱桃核总黄酮
ＰＥＧ－硫酸铵双水相萃取体系的最佳提取条件为：
ＰＥＧ的相对分子质量为４００，ＰＥＧ与硫酸铵的质量
比为１∶１．５，萃取环境ｐＨ 为５．６～６．７，萃取温度
０４１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
为５０℃。ＰＥＧ在其相对分子质量增大的同时黏度
也逐步升高，随着黏度的增大溶液分相变得困
难［１０－１１］。在相同情况下，ＰＥＧ相对分子质量越小，
则萃取液相比（γ）越大，两相间的分配系数（Κ）越
小，故在总黄酮得率（Ｙ）相当时应优先选择相对分
子质量小的ＰＥＧ。另外，本研究也发现，相对分子
质量为４ ０００的ＰＥＧ不适宜用于ＰＥＧ－硫酸铵双水
相体系，可能是相对分子质量为４ ０００的ＰＥＧ为粉
末状固体，溶解后黏度过大［１２］，不能针对东北山樱
桃核总黄酮与硫酸铵间形成有效的竞争性溶解关
系，造成得率明显下降，且当黏度过大时萃取液分相
模糊，给后续操作增加了难度。
国内有报道认为，用ＰＥＧ－硫酸铵双水相分离纯
化时，ＰＥＧ的加入质量应大于硫酸铵［１３］。本试验发
现，选用相对分子质量为４００的ＰＥＧ，当加入硫酸
铵的质量较ＰＥＧ质量少时溶液不成相，当两者质量
相等时溶液勉强分层成相，但两相界面比较模糊，分
离效果较差。经反复试验发现，在ＰＥＧ与硫酸铵质
量比为１∶１．５时，分离效果最好，两相间界面清晰
明朗，总黄酮得率也得到了有效保证。
在ＰＥＧ－硫酸铵双水相的分离纯化中，ｐＨ值是
一个至关重要的参数。本研究发现，一方面，当溶液
呈弱碱性时，分配系数Ｋ 值增大，分离效果急速下
降，得率降低；另一方面，从总黄酮活性考虑，碱性环
境易破坏黄酮的母核结构，使总黄酮化合物活性丧
失［１４］。由此可知，在整个分离纯化体系中应保持弱
酸性环境。
ＰＥＧ－硫酸铵双水相分离体系属于高聚物－盐－水
双水相体系［８］，在试验过程中体系内的含水量均一
直维持在较高水平（８０％以上），因此在快速竞争分
相时不会产生热量［１５］，在最佳萃取条件下，整个萃
取体系性质温和，可使东北山樱桃核总黄酮化合物
的生物活性得到最大限度的保留。此外，ＰＥＧ的生
物相容性较传统有机溶剂高［１６］，界面张力也较传统
有机溶剂－水相更低［１７－１８］，因此该体系可在保持东北
山樱桃核总黄酮化合物生物活性稳定的同时，缩短
分相时间，更有利于工业化生产中的连续性分离纯
化操作。
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