全 文 ：L9(34)正交表进行实验 ,以地骨皮总黄酮含量为考察指标 , 结果
见表 4。对表 4结果进行统计学处理 ,得方差分析见表 5。
表 3　正交实验因素水平
水平 A乙醇浓度(%) B乙醇量V/ml C提取次数 D提取时间t/h
1 60 8 1 1
2 75 10 2 2
3 90 12 3 3
表 4　地骨皮正交实验及结果
试验号 A B C D 总黄酮(%)
1 1 1 1 1 8.329
2 1 2 2 2 8.653
3 1 3 3 3 8.874
4 2 1 2 3 9.13
5 2 2 3 1 9.224
6 2 3 1 2 9.03
7 3 1 3 2 8.003
8 3 2 1 3 8.29
9 3 3 2 1 7.567
K1 25.856 25.462 25.649 25.12K
2 27.384 26.167 25.35 25.686K3 23.86 25.471 26.294 26.294R1 1.175 0.232 0.215 0.3913
表 5　方差分析
方差来源 方差平方和 自由度 均值 F值 P
A 2.082 2 1.041 0 19.101
B 0.109 2 0.054 5 1.000 <0.05
C 0.095 2 0.047 5 0.872D 0.230 2 0.115 0 2.110
表 4 ～ 5结果表明 ,影响总黄酮提取效果的因素依次为 A>D
>B>C,即因素中乙醇浓度有显著性差异(P<0.05), 乙醇量 、提
取时间和提取次数无显著性差异 , 综合考虑确定最佳工艺
为 A2B2C3D3。
3　讨论
单因素和正交实验结果表明 ,乙醇浓度对总黄酮的提取有显
著影响 , 最后确定最佳提取工艺为 A2B2C3D3 , 即 75%乙醇 , 料液
比为 1∶10, 提取 3次 , 3 h/次。鉴于成本和时间 , 并且提取次数
和时间对总黄酮提取无显著性影响 ,可改为提取 2次 , 2 h/次。
参考文献:
[ 1 ] 　国家中医药管理局 《中华本草 》编辑委员会.中华本草 ,第七册
[ M] .北京:科学与技术出版社 , 1999:274.
[ 2 ] 　国家药典委员会.中国药典 , Ⅰ 部 [ S] .北京:化学工业出版
社 , 2005.
资源开发
收稿日期:2007-05-15;　修订日期:2007-08-17
作者简介:张　帆(1979-),女(汉族),湖北武汉人 ,现为新疆农业大学在
读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事药用植物细胞工程的研究工作.
＊通讯作者简介:李先恩(1964-), 男(汉族),上海人 ,现任中国医学科学
院·中国协和医科大学药用植物研究所研究员 ,学士学位 ,主要从事药用
植物栽培研究工作.
粉葛试管块根诱导技术的研究
张　帆1, 2 , 祁建军 2 , 周丽莉2 , 曲延英 1 , 李先恩2＊
(1.新疆农业大学农学院 ,新疆 乌鲁木齐　830052;
2.中国协和医科大学 ·中国医学科学院药用植物研究所 ,北京　100094)
摘要:目的 建立粉葛无菌苗培养及离体条件下诱导试管块根的体系。方法 以粉葛的种子为外植体 , MS培养基为基本
培养基 , 培养条件为 25℃, 2000 ～ 3000 Lx光照 , 12h/d。结果 机械破坏种皮可有效地打破种子的休眠。除去顶芽有利于
粉葛试管丛生芽的发生 。已生根的试管苗转入块根诱导培养基中 , 根部明显增粗 , 形成粉葛的试管块根 , 最佳培养基配
方为:MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖 5%。结论 无菌离体条件下可以诱导出粉葛试管块根。
关键词:粉葛;　试管块根;　诱导技术
中图分类号:S567　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)04-0918-02
ResearchontheInductionTechnologyoftheTuberousRootofPuerariathomsoniBenth.
intheTestTube
ZHANGFan1, 2 , QIJian-jun2 , ZHOULi-li2 , QUYan-ying1 , LIXian-en2＊
(1.ColegeofAgronomy, XinjiangAgriculturalUniversity, Urumqi, 830052, China;2.ChinaUnionMedical
Colege, TheInstituteofMedicinalPlantDevelopment, ChineseAcademyofMedicalScience, Beijing100094,
China)
Abstract:ObjectiveToestablishthesterilizedseedlingcultureandthetesttubeearthnutinductionsystem.MethodsTheseed
ofPuerariathomsoniiBenth.wasculturedinMSculturemediumasexplantunderthelightlengthof2000 ～ 3000Lx12 h/dat
25℃.ResultsMechanicalbreakcouldefficientlysmashthedormancyofseed.Theshearingawayofthetopsproutwouldcontrib-
utetothegerminationoffascicledbud.Whentheplantletwithinducedrootswereshiftedtotuberousrootinducingculturemedi-
um, therootobviouslyaugmentedwhichconsequentlyledtotheformationoftesttubetuberousroot.Theoptimizedmediumwas
MS+6-BA2mg/L+NAA0.1 mg/L+sucrose5%.ConclusionTesttubetuberousrootofPuerariathomsoniiBenth.couldbe
inducedinsterileconditionsinvitro.
Keywords:PuerariathomsoniiBenth.;　Testtubetuberousroot;　Inductiontechnology
　　粉葛 PuerariathomsoniiBenth.是豆科葛属多年生藤本植物 ,
主产长江以南 ,在《神农本草经》《本草纲目》中均对其药用功效
有记载 。葛叶主金疮止血;葛花能解酒醒脾;葛谷(种子)治痢
疾 、解酒毒;葛根补心清肺 、起阴气 、解酒毒。其块根肥厚 ,富含淀
粉和多种异黄酮类化合物。 现代科学证明 , 葛根中的葛根黄酮 ,
具有明显的抗凝血 、抑制血小板聚集 、降低血粘度 、激活纤维蛋白
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 4期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL.19NO.4　
酶等作用 [ 1] 。
生产中粉葛多用无性繁殖 。多年的无性繁殖 ,易导致种质退
化 , 表现为:块根变细 、产量降低 、质量下降。目前 , 茎尖脱毒是防
止病毒侵害 、解决种质退化的常用方法 [ 2] , 而粉葛茎尖上耳片较
多且密被绒毛 , 进行组织培养时材料消毒相对困难 , 要得到粉葛
茎尖脱毒苗有存在一定难度;且脱毒苗繁殖系数小 、成活率低 、育
苗周期长 , 运输极不方便 ,从而大大限制了在生产上的推广。近
年来 , 马铃薯 、半夏 、地黄等作物均培养出了试管块根(块茎),试
图尝试用试管块根来代替脱毒苗在生产中的应用。其中 ,试管马
铃薯的培养技术日趋完善 , 完全可以代替试管苗作为商品供
应 [ 3] 。目前 , 粉葛试管块根的研究国内外尚无报道 , 本研究开展
了粉葛试管块根的诱导的研究工作。诱导粉葛试管块根的形成 ,
也为粉葛的块根形成的机理研究提供材料。
1　材料与方法
1.1　材料 湖南野生粉葛当年生的种子。
1.2　方法
1.2.1　培养基及培养条件 选用 MS基本培养基 , 蔗糖基本浓度
为 3%,用 0.8%的琼脂固化 , pH值为 5.8 ～ 6.0, 121℃湿热灭菌
15 min, 材料接种后置于光照培养箱中 , 培养条件为:25℃, 2000
～ 3000 Lx光照 , 12 h/d。
1.2.2　无菌苗的获得 将粉葛种子用剪刀剪破种皮 , 用流水冲洗
20 min, 移入超净工作台上 ,用 75%的酒精进行表面消毒 30 s,再
用 0.1%的生汞对种子消毒 10 min, 无菌水冲洗 5 ～ 6次 , 将消毒
处理的种子置于装有湿润的双层滤纸的三角瓶中 ,在光照培养箱
中培养 10h。 10h后将吸涨的种子取出用 0.1%的生汞进行第 2
次消毒 , 消毒时间为 6 min,无菌水冲洗 5 ～ 6次后将再次消毒的
种子分别移入 1/2MS基本培养基 ,在光照培养箱中进行培养。
1.2.3　幼苗的增殖培养 待种子萌发的无菌苗长至 2 cm左右时
自根部切下 , 分别进行去除顶芽和不去顶芽两种处理后 , 移至 MS
+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L培养基中 , 在光照培养箱中进
行幼苗的增殖培养。
1.2.4　幼苗的生根 当增殖培养的粉葛幼苗长至 2 ～ 3 cm时 ,自
幼苗基部切下 , 移至 1/2MS+IBA 1 mg/L培养基中进行生根
培养。
1.2.5　粉葛试管块根的诱导 当粉葛幼苗的根长至 1cm左右
时 , 及时转入试管块根诱导培养基中进行粉葛试管块根的诱导培
养。块根诱导培养基为:MS, MS+6-BA1 mg/L+NAA1.0 mg/
L, MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L, MS+6 -BA 2 mg/L+
NAA1.0 mg/L, MS+6-BA3 mg/L+NAA0.1 mg/L, 其中蔗糖
浓度均为 5%。
1.2.6　培养基不同蔗糖浓度对块根诱导的影响 采用的基本培
养基为:MS+6-BA2 mg/L+NAA0.1 mg/L, 在基本培养基中
分别加入不同的蔗糖浓度:3%, 5%, 8%和 12%, 将根长 1 cm左
右的粉葛试管幼苗移入上述培养基 ,观察不同蔗糖浓度对试管块
根生长的影响。
2　结果与分析
2.1　无菌苗培养体系的建立 由于粉葛种子具有休眠性 , 种子灭
菌后直接移入发芽床中并不萌发 ,而采用机械破坏种皮的方法可
有效地打破种子的休眠 ,种子的发芽率达到 98.5%。另外 , 粉葛
种子不易彻底消毒 , 经一次消毒的种子污染率高达 85.4%, 而两
次消毒的方法可大大降低种子萌发时的污染率 ,使种子无菌萌发
率达到 45%以上。
2.2　幼苗的增殖培养 增殖培养 15d后两种处理的幼苗均长出
丛生芽。去除顶芽的粉葛幼苗能长出约 8个 2 cm左右的丛生
芽 , 未去除顶芽的粉葛幼苗萌发约为 4个 2 cm左右的丛生芽 , 实
验证明除去顶芽有利于粉葛丛生芽的发生。
2.3　植物激素对幼苗不定根增粗及块根形成的影响 带有不定
根的幼苗移入块根诱导培养基 , 30 d后观察粉葛植株在各种培养
基中的生长情况。结果表明:在空白 MS培养基中培养的粉葛幼
苗 , 30 d后根部继续伸长(5 cm左右), 未见明显主根 ,根部没有
增粗迹象 , 其直径小于 0.1 cm;在生根培养基中生长的粉葛幼
苗 , 根部继续伸长(8 cm左右), 有明显主根 , 主根直径约为 0.15
cm;在 MS+6-BA2 mg/L+NAA0.1 mg/L培养基中 , 幼苗生出
少量不定芽 , 根伸长不明显(2.5 cm左右),也不再长出新的不定
根 , 但块根增粗明显 , 其直径可达到 0.8 cm左右(图 1)。当培养
基中 NAA浓度较高时 , 其植株基部愈伤化严重 , 幼苗趋于玻璃
化 , 且其块根没有明显增粗现象。增大培养基中 6-BA的浓度 ,
幼苗易形成从生芽。因而诱导块根选择含有较低浓度的 6-BA
和 NAA的培养基较为合适。
2.4　培养基中蔗糖浓度对块根形成的影响 带有不定根的幼苗移
入不同蔗糖浓度的培养基中 10d后观察发现 ,在蔗糖浓度为 3%的
培养基中 ,不定根增粗不明显 ,蔗糖浓度为 5%和 8%的培养基中
可见块根明显增粗 ,在蔗糖浓度为 8%的高糖含量培养基中 , 幼苗
较矮小 ,叶片深绿 ,植株处于生长抑制状态。结果说明 ,较高的糖
含量有利于粉葛块根的形成 , 但是含糖量过高对幼苗生长有抑制
作用 ,而含糖 5%的培养基较适合粉葛试管块根的形成。
1.种子菌发无菌苗　2.生根培养基诱导的无菌苗
3.块根培养基诱导的试管块根
图 1　不同培养基诱导的粉葛无菌苗
3　讨论
粉葛种子具有休眠性 , 实验证明 ,采用机械破坏种皮是打破
种子休眠的有效方法 ,说明粉葛种皮的不透气性和不透水性是影
响粉葛种子萌发的主要原因。在生产上 ,人工除去顶芽用于消除
顶端优势 ,可以促进侧芽生长 、增加分枝数 ,本研究也证明除去顶
芽有利于粉葛试管苗丛生芽的发生。
目前 , 国内外对影响粉葛块根形成的因素及生理机制研究未
见报道 ,对马铃薯块茎形成生理机制的研究表明 , GA和 ABA与
马铃薯块茎形成有关 , GA抑制块茎的形成 , 而 ABA对块茎形成
具有促进作用。块茎的形成也受到许多其它因素的影响 ,其中光
照 、温度及离体培养条件下的培养基中蔗糖浓度是块茎形成的主
要影响因素 [ 4] 。本研究也证明了培养基高蔗糖浓度有利于粉葛
试管块根的形成 , GA、ABA对粉葛试管块根的作用和光照 、温度
对粉葛试管块根的影响还有待于进一步的研究。
参考文献:
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(5):273.
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