全 文 :黑龙江农业科学2014(8):35~38
Heilongjiang Agricultural Sciences
砂生槐单粒种子DNA的快速提取及RAPD检测
石梦菲1,拉 多1,张勇群1,2
(1.西藏大学 理学院,西藏 拉萨850000;2.西藏自治区高等学校重点实验室 生物技术实验
室,西藏 拉萨850000)
摘要:为探讨快速提取种子DNA的有效方法,以砂生槐单粒种子为试验材料,在传统CTAB法基础上建立一
种快速提取DNA的方法,并通过紫外分光光度法、凝胶电泳和RAPD-PCR检测所提基因组DNA。结果表
明:快速法提取得到了质量较好、浓度及纯度较高的DNA,可以满足分子生物学实验的要求。此方法操作方
便、快捷,是一种有效的砂生槐种子的DNA提取方法。
关键词:砂生槐;单粒种子;DNA快速提取;RAPD检测
中图分类号: 文献标识码:A 文章编号:1002-2767(2014)08-0035-04
收稿日期:2014-03-26
第一作者简介:石梦菲(1988-),女,山西省运城市人,在读硕
士,从事植物学研究。E-mail:dreamgirlsmf@163.com。
通讯作者:张勇群(1976-),女,博士,副教授,从事生物多样
性与分子生态研究。E-mail:yongqunzhang@yahoo.com。
砂生槐(Sophora moorcroftiana)又名西藏
狼牙刺,豆科槐属,多年生矮灌木。砂生槐产于西
藏波密、林芝和拉萨等地,生于海拔2 800~4
400m的山坡灌丛中,河漫滩砂质地,在雅鲁藏布
江河谷常成大片群落[1]。藏医药记载[2],砂生槐
多以种子入药,味苦性凉,消炎解毒,主治湿热黄
疸、白喉、痢疾和消化不良等,是一种极为宝贵的
植物药用资源。有研究表明,砂生槐种子水提物
可通过提高荷瘤小鼠免疫功能而发挥抗肿瘤作
用,具有明显的抑菌活性[3]。同时,从砂生槐种子
中提取得到的生物碱不仅能够体外杀灭原头
蚴[4],也对人胃癌SGC-7901细胞的增殖有明显
的抑制作用[5]。对其研究多集中在种子的药用价
值上[6],而分子生物学方面的研究较少,该文旨在
探讨出一种快速实用的方法对砂生槐种子DNA
进行提取。
种子DNA的提取通常采用CTAB法与SDS
法,CTAB和SDS都是一类离子去污剂,能够裂
解细胞释放DNA,并与提取液中的EDTA共同
保护 DNA 免受内源核酸酶的降解[7]。Yoshi-
hashi等[8]用磨碎的谷粒提取了水稻基因组
DNA。田苗苗等[9]将SDS与CTAB法相结合提
取了单粒大豆种子基因组DNA。郭景伦等[10]探
索了从玉米单粒种子提取DNA的新方法。该文
采用砂生槐单粒种子为试验材料,并针对砂生槐
种子富含蛋白质成分这一特性,得出一种快速有
效的DNA提取方法,为后续更进一步的研究提
供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
该试验在西藏自治区高等学校重点实验室生
物技术实验室中进行。砂生槐种子采于西藏自治
区拉萨市,置于-80℃保存。所用试剂有琼脂糖、
CTAB、SDS、DTT、PVP、苯酚、Tris、10×Taq酶
配套缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq酶、引物等购自
上海生工生物有限公司,其余试剂为国产分析纯。
仪器有凝胶成像系统(北京六一仪器)、核酸蛋白
测定仪(Eppendorf BioPhotometer plus)、移液
器(Eppendorf)、电泳仪(Bio-Rad)、琼脂糖水平电
泳槽(北京六一仪器)、超速冷冻离心机(Eppen-
dorf)和PCR仪(Bio-Rad)等。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取 (1)传统方法提取砂
生槐种子DNA:取一粒砂生槐种子,用镊子剥去
种皮后置于干净的研钵中,加入500μL 65℃预热
的提 取 缓 冲 液[11] (0.1 mol·L-1 Tris-HCl,
0.025mol·L-1 EDTA,1 mol·L-1 NaCl,2%
CTAB,3% PVP,2% DTT)进行研磨,转移至
1.5mL离心管中65℃水浴40min,期间不时颠
倒混匀;稍冷却后,加 入 500μL 氯 仿/异 戊
醇(24∶1),震荡混匀,于4℃环境12 000r·min-1
离心10min;取上清,加等体积-20℃预冷的异
丙醇,于-20℃静置30min;4℃,14 000r·min-1
离心20min,倒掉上清,用70%乙醇洗涤2次,风
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干后溶于50μL TE(0.01mol·L-
1 Tris-HCl,
pH8.0,0.01mol·L-1 EDTA,pH8.0)。平行提取
3次。
(2)快速提取砂生槐单粒种子DNA:取一粒
砂生槐种子,用镊子剥去种皮后置于干净的研钵
中,加入250μL氯仿快速研磨,转移至1.5mL
离心管中,加 750μL 65℃ 预热的提取缓冲
液(0.1mol·L-1 Tris-HCl,0.1mol·L-1 EDTA,
0.5mol·L-1 NaCl,1.5%SDS,3% PVP,2%
DTT),颠倒混匀后65℃水浴5min,稍冷却后,
12 000r·min-1,4℃离心2min;取上清,加等体积
的无水乙醇 (-20℃ 预冷),轻轻颠倒混匀,
12 000r·min-1,4℃离心5min后,弃上清,沉淀
用70%乙醇洗涤,风干后溶于50μL TE。平行
提取3次。
1.2.2 基因组DNA提取结果检测 (1)紫外分
光光度法检测:取2μL DNA提取液稀释100倍,
以TE作为空白对照,利用核酸蛋白测定仪测得
DNA样品的浓度,以及在波长260和280nm处
的吸光值,通过其比率可以判断DNA的纯度及
提取效果,同时可根据浓度计算出DNA提取的
得率。(2)琼脂糖凝胶电泳检测:配制0.8%的琼
脂糖凝胶,在TBE缓冲液中以80V的电压电泳
1.5h,并用凝胶成像系统进行拍照。(3)RAPD-
PCR 扩增检 测:10×Taq Buffer、2mmol·L-1
Mg2+、0.2mmol·L-1 dNTPs、1.0U Taq 酶、
30ng快速方法提取的砂生槐种子 DNA 模板、
0.2μmol·L-
1 RAPD随机引物(引物序列见表1)
的25μL反应体系,进行3次平行PCR扩增。扩
增程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,
36.9℃/41℃退火45s,72℃延伸1min,35个循
环;72℃延伸10min。扩增结果用1.6%的琼脂
糖凝胶在 TBE缓冲液中以110V 的电压电泳
45min,并用凝胶成像系统进行拍照。
表1 用于RAPD-PCR扩增的引物信息
Table 1 Primer information used for
RAPD-PCR amplification
引物名称
Primers
引物序列
Primer sequence
退火温度/℃
Annealing temperature
RAPD1 AAT CGG GCT C 36.9
RAPD2 CAA TCG CCG T 36.9
RAPD3 GGT GAC GCA G 41.0
2 结果与分析
2.1 DNA浓度和纯度
从表2及图1均可以看出,用传统方法提取
得到的种子DNA浓度及得率普遍大于快速提取
法,但是纯度相对较低,OD260/OD280为1.04~
1.17。而用改进方法提取得到的DNA质量得到
提高,OD260/OD280为1.34~1.56。同时,从图1
也能得知,传统方法由于耗时长、提取液中成分单
一,使得一些糖类等物质仍有大量残留,部分
DNA因粘连而滞留在点样孔,同时提取所得
DNA有部分降解,呈现弥散条带;而快速提取法
由于提取液的配方有所改进,并且各个步骤操作
快捷,即使 DNA 浓度略低于传统方法,但降解
少,能够完整地保存DNA样品。
表2 不同方法提取砂生槐种子
DNA的浓度和纯度
Table 2 DNA concentration and purity
extracted by different methods from single seed
of Sophora moorcroftiana
样品编号
No.
浓度/μg·mL-1
Concentration
OD260/OD280
得率/μg·mg-1
Yield
传统方法 1 490 1.04 0.88
2 720 1.06 1.29
3 416 1.17 0.74
快速提取 1 350 1.34 0.63
2 150 1.49 0.27
3 310 1.56 0.55
图1 两种方法提取砂生槐种子DNA的凝胶电泳图谱
M:λMarker;泳道1,2,3:传统方法提取所得砂生
槐种子 DNA;泳道4,5,6:快速提取法所得砂生槐种
子DNA
Fig.1 Gel electrophoretogram of DNA by two methods
from single seed of Sophora moorcroftiana
M:λMarker;1,2,3:DNA extracted by traditional
method from single seed of Sophora moorcroftiana;4,
5,6:DNA extracted by rapid method from single seed of
Sophora moorcroftiana
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8期 石梦菲等:砂生槐单粒种子DNA的快速提取及RAPD检测
2.2 快速法提取DNA的RAPD检测结果
从图2看出,快速法提取的砂生槐种子DNA
使用3种RAPD引物均可进行PCR扩增,且每
图2 快速提取砂生槐种子DNA的RAPD-PCR电泳图谱
M:λMarker;泳道1,2,3:使用引物RAPD1得到的
3次平行扩增结果;泳道4,5,6:使用引物RAPD2得到
的3次平行扩增结果;泳道7,8,9:使用引物RAPD3得
到的3次平行扩增结果
Fig.2 Gel electrophoretogram of RAPD-PCR
amplification by rapid method
M:λMarker;1,2,3:RAPD-PCR amplification of
DNA with primer RAPD1;4,5,6:RAPD-PCR amplifi-
cation of DNA with primer RAPD2;7,8,9:RAPD-PCR
amplification of DNA with primer RAPD3.
个引物进行3次平行扩增的电泳图谱基本一致,
条带清晰明亮。此外,每粒砂生槐种子的质量只
有25~30mg,就可以得到明显的检测结果,说明
改进方法具有高效的优点,并且所得DNA浓度
适中,质量可靠,具有较高的重复性,适于后续
操作。
2.3 提取时间
表3列出了两种不同的提取方法在各阶段所
用的时间,能够很明显地看出,改进的快速提取方
法不仅在耗时最多的水浴保温过程中省去了大量
的时间,并且操作便捷,在各个操作过程中都较传
统方法省时,节约大量时间。虽然各个反应步骤
的简化使得DNA的浓度及得率略低,但仍能满
足需要,并且在短时间内提取到更加纯净的
DNA。就实际操作而言,传统方法提取DNA需
要近2h,而用快速提取方法得到DNA在20min
内即可完成,大大提高了DNA的提取效率。该
方法便于操作,适用于大量材料的提取。
表3 两种方法提取时间的比较
Table 3 The comparison of the time with two methods
提取步骤
Extraction steps
所用时间/min Time
传统提取方法 Traditional method 快速提取方法 Rapid method
氯仿处理Chloroform treatment — 3
65℃水浴加热Bath heating with 65℃ water 40 5
氯仿/异戊醇处理Chloroform/isoamyl alcohol treatment 2 —
沉淀核酸Precipitation nucleic acid 30 1
所有的离心 Al centrifugal 30 7
总计 Total 102 16
3 结论与讨论
试验证明,改进方法较传统提取方法更加快
捷,且能得到更加纯净的DNA,便于进行大量砂
生槐种子DNA的同时提取。
改进的提取方法法中,在研磨种子时提前加
入了氯仿,使得蛋白质和DNA酶在加入提取液
之前就变性失活,尽可能地减少DNA降解,同时
增加提取缓冲液的用量及EDTA的浓度,可以大
量地螯合Ca2+和 Mg2+,使残余的DNA酶失活。
此时,即使减少与缓冲液混合的保温时间和后续
的离心时间,也可以尽快地使DNA解离出来而
不被降解,这也是改进后的提取方法与传统方法
相比最大的优势。该提取方法操作简便,节约时
间,并且可以得到高质量的DNA,可做为大量提
取砂生槐种子DNA非常实用的方法。
有研究表明,砂生槐种子蛋白质含量高达
30.06%[12],针对这种蛋白质含量较高的实验材
料,改进方法中提前加入了氯仿,所以在提取缓冲
液保温后没有再次使用氯仿/异戊醇进行抽提,若
要更加彻底地除去蛋白质类杂质,可在提取缓冲
液保温后进行一个等体积氯仿/异戊醇(24∶1)的
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黑 龙 江 农 业 科 学 8期
抽提处理,这样,残留的蛋白质也会更彻底地除
去,可为后续试验提供更优质的DNA模板。
高质量的基因组DNA提取是进行药用植物
分子生物学研究的重要环节[13]。严奉坤等[14]采
用改良的CTAB法对枸杞的冷藏幼叶进行基因
组DNA提取,并成功利用RAPD进行了指纹图
谱分析。侯静等[15]将不同方法提取得到的甜菜
基因组DNA应用于Southern杂交分析,发现不
同的DNA质量对杂交信号有非常大的影响,并
且SDS法提取得到的甜菜基因组 DNA 适于
Southern杂交分析。所以,对于后续的分子生物
学实验,如利用分子标记进行基因克隆、分子鉴
定、基因库的构建、物种亲缘关系的鉴别等方面,
优质的DNA模板能够保证其顺利进行,并可以
尽快得到最可靠的结果。
参考文献:
[1] 中国科学院青藏高原综合科学考察队.西藏植物志[M].北
京:科学出版社,1985:717.
[2] 中国医学百科全书编辑委员会.中国医学百科全书·藏医
学[M].上海科技出版社,1999:204.
[3] 郭军,马兴铭,安方玉,等.砂生槐种子水提物对荷瘤小鼠免
疫功能的影响[J].时珍国医国药,2008(4):3-4.
[4] 马兴铭,李红玉,尹少甫,等.砂生槐种子生物碱杀灭原头蚴
及抗炎作用[J].中国寄生虫病防治杂志,2004,17(4):
217-219.
[5] 马兴铭,李红玉,尹少甫,等.砂生槐种子生物碱诱导SGC-
7901细胞凋亡的实验研究[J].中成药,2004,8(26):
654-656.
[6] 张胜,赵垦田,向瑞.西藏砂生槐研究综述[J].内蒙古林业
科技,2009,35(1):57-59.
[7] 孔红,闫训友,孟凡萍.蒿种子基因组DNA提取方法的比较
研究[J].北方园艺,2007(12):197-198.
[8] Yoshihashi T,Nakamura S,Fuji T.Identification of domes-
tic rice cultivars by RAPD analysis using one grain of miled
rice as a sample[J].Nippon-Shokuhin-Kogaku-Kaishi,
1999,46(4):250-254.
[9] 田苗苗,周延清,牛敬媛,等.单粒干燥大豆种子基因组
DNA提取的有效方法[J].生物学通报,2005,40(10):
38-40.
[10] 郭景伦,赵久然,尉德铭,等.玉米单粒种子DNA提取新方
法[J].北京农业科学,1997,15(2):1-2.
[11] 汤洁,刘连生,许娜娜,等.绞股蓝叶片DNA提取方法的比
较研究[J].安徽农业大学学报,2008,35(3):445-448.
[12] 李玉祥.西藏砂生槐的生物学特性及综合利用[J].自然资
源学报,1993,8(5):75-79.
[13] 徐鹏,吴耀生,黄瑞松,等.3种广西钩藤属药用植物的
RAPD多态性分析[J].时珍国医国药,2012,23(3):
703-705.
[14] 严奉坤,许兴,魏玉清,等.枸杞基因组DNA提取及指纹图
谱分析[J].时珍国医国药,2007,18(1):46-48.
[15] 侯静,马凤鸣,陈胜勇,等.甜菜基因组 DNA 的提取及
Southern杂交分析[J].东北农业大学学报,2008,39(12):
14-18.
Rapid DNA Isolation and RAPD Detection of
Single Seed fromSophora moorcroftiana
SHI Meng-fei 1,LA-Duo1,ZHANG Yong-qun1,2
(1.School of Science,Tibet University,Lhasa,Tibet 850000;2.Key Laboratory of High
School in Tibet Autonomous Region,Biotechnology Laboratory,Lhasa,Tibet 850000)
Abstract:In order to explore the effective extraction of seeds DNA rapidly,taking single seed of Sophora
moorcroftiana as materials,a method for rapid isolation of genomic DNA from single seed of Sophora
moorcroftiana was established based on the traditional CTAB method.The extracted DNA was assessed by ul-
traviolet photometer,agarose gel electrophoresis and RAPD-PCR,respectively.The results showed that the
DNA extracted by rapid method was high output and purity,the quality of genomic DNA could extensively
meet the requirements for many molecular biology experiments.It is a rapid,simple and effective method for ex-
tracting genomic DNA from single seed of Sophora moorcroftiana.
Key words:Sophora moorcroftiana;single seed;rapid DNA isolation;RAPD detection
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