全 文 ：第3期
收稿日期:2007-10-09
基金项目:国家微生物资源基金项目(2005DKA21208-6)
作者简介:罗艳梅(1982-),女,云南玉溪人,2004级硕士研究生;通讯作者,周俊初,(电话)027-87281685(电子信箱)zhoujunchu@mail.hzau.edu.cn。
Brunchorst在 1885年首次提出将类菌体一词
用于描述根瘤中特殊膨大的结构[1]。之后又有学者
提出了自己对于类菌体的定义,因而在 1980年的
第 4次国际固氮会议上,Pankhust建议将存在于成
熟、有固氮活性的植物含菌细胞中的细菌称为类菌
体[2],也就是只有在植物根瘤细胞中共生形态的细
菌才能称为类菌体。
关于根瘤类菌体能否再分化成为有繁殖能力
的细菌的争论已经进行了上百年。1888年 Beijer-
inck首次分离出根瘤菌纯培养时,认为类菌体是失
去了繁殖能力的畸形结构,只具有某种蛋白质功
能。但Prazmowski却在同年首次报道类菌体和培养
体可以相互转换[1]。此后又有很多研究者提出了不
同看法,多数人均认为特化的类菌体己失去再繁殖
广谱根瘤菌NGR234在大翼豆根瘤中的分化
和繁殖能力
罗艳梅,周俊初
(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉 430070)
摘要:利用盆栽法验证了广谱根瘤菌NGR234在大翼豆、白灰毛豆、扁豆、豇豆和大豆上的结瘤与固氮能
力,用光学显微镜和电镜比较了其根瘤类菌体的形状,并采用稀释平板测数和显微微室培养法对大翼豆
根瘤类菌体的繁殖能力进行了深入的比较研究。结果表明,根瘤菌 NGR234不能在大豆上结瘤,在白灰
毛豆上结无效瘤,能在扁豆、豇豆和大翼豆上结有效瘤,其根瘤类菌体以棒状类菌体为主。对大翼豆根瘤
压碎汁的微室培养表明,不同瘤龄根瘤的类菌体的形态和繁殖率略有差异,杆状的根瘤小杆菌和多数棒
状类菌体均能在人工培养条件下繁殖,其中类菌体的繁殖率随瘤龄的增加而增大,并在衰败前的根瘤中
有明显的增加。
关键词:根瘤菌NGR234;类菌体;分化;繁殖能力
中图分类号:Q939.11+3 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2008)03-0287-04
DiferentiationandReproductivityofBroad-host-rangeRhizobiumsp.NGR234in
NodulesofMacroptiliumlathyoides
LUOYan-mei,ZHOUJun-chu
(TheNationalKeyLaboratoryofAgricalturalMicrobiologyinHuazhongAgriculfurclUniversity,Wuhan430070,China)
Abstract:Thenodulation and nitrogen fixation abilityofbroad-host-rangestrain Rhizobium sp.NGR234 on Lablab
purpureus,Vignaunguculata,Macroptiliumlathyoides,TephrosiacandidaandGlycinemaxwereconfirmedbyusingplantpot
experiment.Bacteroiddiferentiationwasstudiedbyusingbothofopticalandelectronmicroscopictechniques.Bacteroid
reproductivitywascomparedbyusingviablecountandmicroscopicincubation.ItwasdemonstratedthatNGR234couldform
efectivenodulesonLablabpurpureus,VignaunguculataandMacroptiliumlathyoide,inefectivenodulesonTephrosiacandida
andfairtonodulateonGlycinemax.BacteroidofNGR234wasmainlyinclubshapeinefectivenodules.Resultsfrom
viablecountandmicroscopicincubationofcrushednodulesinMacroptiliumlathyoidesdemonstratedthatshapeandviability
ofbacteroidsfromnodulesatdiferentageswerediferentslightly.Bothofsmalnodsandmajorityofclubshapedbacteroids
couldreproduceinartificialincubationconditions.Thereproductivityofbacteroidswasincreasedwiththeagesofnodules
andsignificantlyincreasedbeforenodulesenescing.
Keywords:RhizobiumspNGR234;bacteroid;diferentiation;reproductivity
第47卷第3期
2008年3月
湖北农业科学
HubeiAgriculturalSciences
Vol.47No.3
Mar.,2008
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2008.03.011
湖 北 农 业 科 学 2008年
为杆状根瘤菌的能力。1977年,Suton等在研究羽
扇豆根瘤类菌体时,发现其类菌体的繁殖能力依赖
于培养基的渗透压保护[3]。Gresshof等也报道三叶
草根瘤类菌体可以在渗透压保护下繁殖[4]。但曹燕
珍等人1984年却发现渗透压保护并不是类菌体繁
殖的必要条件,他们采用显微微室培养法证明存在
于三叶草和紫云英根瘤中的特化类菌体已失去了
再繁殖的能力,只有根瘤中的小杆菌可以再繁殖[2]。
1985年,Zhou等通过显微操作分离根瘤含菌细胞
和显微微室培养法也报道只有大豆根瘤中的未特
化的杆状类菌体可以繁殖,而且不需要渗透压保
护,其繁殖率值瘤龄加大而增加,但特化的三叶草
根瘤类菌体已失去繁殖能力[5]。Mergaert等也报道
了不定型根瘤中类菌体的大小和 DNA含量明显高
于定型根瘤,并证明不定型根瘤中的类菌体失去了
繁殖能力,而定型根瘤中的类菌体却可以再繁殖[6]。
1989年,周俊初等进一步深入研究时发现少数三叶
草和豌豆老根瘤中的特化类菌体仍可以通过先转
化为活跃的大杆菌、然后分裂为正常的根瘤小杆菌
的方式恢复繁殖能力[7]。2001年,Muler等将百脉根
置于暗室中得到处于衰败期的根瘤,将根瘤压碎培
养与置于暗室之前的根瘤压碎汁培养比较,发现处
于衰败期的根瘤类菌体的繁殖率明显高于非衰败
期的繁殖率,从而也推断衰败根瘤中的类菌体可以
再分化成为有繁殖力的细菌[8]。
1 材料与方法
1.1 材料
1)供试植物和根瘤菌 根瘤菌 Rhizobiumsp.
NGR234由本实验室保存。供试植物大翼豆
(Macroptiliumlathyoides)从云南省林木工作总站购
买,白灰毛豆(Tephrosiacandida)从浙江发展园林
有限公司购买,大豆 (Glycinemax)、扁豆(Lablab
purpureu)和豇豆(Vignaunguculata)由本校生物固
氮室提供。供试植物种子经1%次氯酸钠表面灭菌
后催芽,种于无菌的双层沙培瓶中,种子出苗后接
种根瘤菌NGR234,置于光照培养室中培养,且定期
补充灭菌的无氮植物营养液。
2)培养基 根瘤菌培养使用YMA培养基,植
物使用Jeansen无氮植物营养液[9]。
1.2 方法
1)根瘤处理 从第 1个月开始,每隔 1周取 1
个根瘤,洗去根瘤上的沙子并经表面灭菌后压碎,
用无菌水稀释待用。
2)电子显微镜观察 取成熟的根瘤作超薄切
片,用 HitachiH-8100电子显微镜观察类菌体形
态。
3)显微微室培养 在灭菌的盖玻片上加上一
小滴熔化的半固体(1%琼脂粉)的 YMA培养基,迅
速倾斜使之形成一均匀薄层,吸去多余的培养基
后,加一微滴根瘤压碎汁,倾斜盖玻片,并吸去多余
的菌液。将盖玻片反转放于灭菌的凹玻片上,四周
用石蜡密封形成一个密闭的微室以保证湿度。将玻
片置于 28℃保温室中,用 OlympusBH-2相差显微
镜定位培养,并每隔4h左右观察照相1次,记录定
位类菌体的生长过程。
4)根瘤类菌体繁殖率的测定 每周取 1个新
鲜根瘤首先称重,再经表面灭菌后压碎,按照每 1g
根瘤加100mL无菌水的比例将压碎的根瘤汁用无
菌水稀释,并经进一步适当稀释后将悬液分成 2
份,一份用细菌计数器在显微镜下计数以测定整个
根瘤中的小杆菌和类菌体总数。另一部分则用于涂
布YMA平板,于28℃培养1周后计数以测定根瘤
中可以再繁殖的小杆菌和类菌体数目和繁殖率。为
了测定处于衰败期的根瘤中类菌体的繁殖率。因
此,本研究参照Muler等人的方法[8],将处于生长时
期的植株置于暗室生长1周,以达到人为使根瘤衰
败的目的。
2 结果与分析
2.1 NGR234共生固氮的有效性
沙培盆栽结瘤结果表明,供试根瘤菌NGR234
能与扁豆、豇豆和大翼豆共生固氮,接种植株在株
高、叶色和生长势等方面都明显优于对照不接种植
株。但只在白灰毛豆上结小的白色瘤,接种植株和
对照植株在株高、叶色和生长势等方面相似,表明
NGR234在白灰毛豆上结无效根瘤。该菌在大豆上
不结瘤。
2.2 NGR234在供试植物根瘤中的形态分化
供试菌在扁豆、豇豆、大翼豆和白灰毛豆上所
结根瘤的电镜观察结果见图1。由图1可见,所有根
瘤菌都存在于植物含菌细胞内部。图1a、b和c显
示扁豆、豇豆和大翼豆根瘤含菌细胞中类菌体基本
充满了整个细胞,而图1d中白灰毛豆的根瘤含菌
细胞很空,只有少量根瘤菌存在。此外,在扁豆和大
翼豆根瘤中的多数类菌体都含有多聚 β-羟基丁酸
(PHB)的不着色颗粒,单个细胞内PHB颗粒的数目
也较多,并在体积上占据了大半个类菌体。但豇豆
根瘤中一般只有少数类菌体含有PHB颗粒,每一类
菌体细胞中的颗粒数目也较少。从形状上来说,供
试扁豆、豇豆和大翼豆根瘤中的类菌体均以棒状类
菌体为主,图中大小不等的球状形态均系棒状类菌
288
第3期
体在不同位置的横切面图像。
2.3 根瘤类菌体繁殖能力的直接测定
本研究以大翼豆根瘤类菌体为代表,通过对不
同生长期根瘤压碎汁的微室培养,发现其类菌体形
态仅略有差异,但不同瘤龄根瘤中棒状类菌体的繁
殖能力却明显不同。
早期根瘤中类菌体以细长棒状和弧状为主,幼
龄根瘤中的弧状类菌体一般都从弯曲地方一分为
二,但大都停止在这种一分为二的情况,不能再繁
殖。早期的根瘤中也含有少量的短杆菌,它们可以
再繁殖成为菌落(图2中箭头所示)。
中期根瘤的类菌体以棒状为主,也有少量的弧
状类菌体,但明显比早期根瘤中的弧状类菌体短
小。从培养12h开始就有棒状类菌体开始生长,弧
状类菌体则比0h要长一些。当培养36h后,视野
中的半数棒状类菌体均开始生长(图3)。从整体看,
中期根瘤中的多数类菌体都可以再繁殖,其繁殖率
明显高于早期根瘤类菌体。
晚期根瘤中的类菌体仍以棒状为主,但比中期
略大一些,而且基本上没有弧状类菌体。晚期根瘤
类菌体的延迟期较长,培养22h后还没有类菌体开
始生长。当培养 38h后,多数棒状类菌体均开始繁
殖(图4)。
图5是图 4的局部放大图。由图 5a可以明显
看出类菌体的形态以棒状为主,供试多数棒状类菌
体和小杆菌一样,在培养了36h之后均可以繁殖成
为菌落。
a.扁豆根瘤,×4300倍;b.豇豆根瘤,×3300倍;c.大翼豆根瘤,×2700
倍;d.白灰毛豆根瘤,×4300倍
图1 NGR234侵染供试植物的根瘤电镜照片
c d
a b
a b
c d
a.0h;b.12h;c.24h;d.36h
图2 大翼豆早期(4周瘤龄)根瘤中类菌体在显微微室培养
中的繁殖
图3 大翼豆中期(8周瘤龄)根瘤类菌体在显微微室培养中
的繁殖
a.0h;b.12h;c.24h;d.36h
a b
c d
图4 大翼豆晚期(15周瘤龄)根瘤类菌体在显微微室培养中
的繁殖
a.0h;b.12h;c.24h;d.36h
c d
a b
罗艳梅等:广谱根瘤菌NGR234在大翼豆根瘤中的分化和繁殖能力 289
湖 北 农 业 科 学 2008年
(责任编辑 郑 威)
2.4 大翼豆根瘤破碎汁中类菌体与小杆菌繁殖率
的测定
以结有效瘤的大翼豆为代表,比较测定了不同
生长期根瘤破碎汁中类菌体和小杆菌的繁殖率。本
研究从接种第3周开始,每隔1周取1次根瘤,并
在接种10周后,再将植株置于暗室中培养1周,以
观察根瘤衰败对类菌体繁殖率的影响,测定结果见
表1。由表1可见,大翼豆根瘤破碎汁中的类菌体和
小杆菌的繁殖率随根瘤瘤龄的增长而增大,并在接
种后10周内的正常固氮时期,每周繁殖率的增长
速度较为稳定。当接种10周后将植物置于暗室中1
周后,植物开始转黄,其根瘤破碎汁中的类菌体从
暗室培养之前的12%提高到28%。
3 小结与讨论
根瘤菌NGR234是一种广宿主根瘤菌,可以在
170多种植物上结瘤。本研究选用该菌和已报道[9]
可以结有效瘤的大翼豆、豇豆、扁豆、白灰毛豆和大
豆进行结瘤试验,结果与前人的报道有一定差异。
NGR234在本研究中只能与大翼豆、豇豆和扁豆有
效结瘤固氮,在白灰毛豆上仅结无效根瘤,并且在
大豆上根本不结瘤。
通过对根瘤切片的电镜观察,证实 NGR234侵
染白灰毛豆植株所结的根瘤确为无效瘤。在结有效
瘤的 3种植物的根瘤中,NGR234类菌体形态虽较
为相似,但在PHB的形态与含量上各异。从而证实
了周俊初等人和 Mergaert等人提出的宿主植物影
响根瘤菌在根瘤中的分化和特性的结论[6,11]。
本研究采用了曹燕珍等的显微微室培养法定
位检测类菌体的繁殖能力,考虑到电镜检测结果表
明根瘤含菌细胞之间未观察到小杆菌存在,在中、
后期根瘤破碎汁的微室培养定位观察中也鲜有小
杆菌存在,所以根瘤压碎汁中的优势细菌为根瘤类
菌体,在微室培养时也可以采用根瘤压碎汁,而不
需通过显微操作分离单个含菌植物细胞。本研究采
用微室培养法定点观察了 NGR234与大翼豆共生
瘤龄达3个月的根瘤类菌体的繁殖能力,发现大部
分呈棒状的特化类菌体都可以再繁殖。由于微室培
养用的老根瘤已经处于衰败期,所以本结果也表明
处于衰败期的根瘤类菌体可以恢复其繁殖能力,以
完成其在土壤中的生活史。本结果既证明了周俊初
等人的推论,由于大翼豆属于定型瘤,也验证了
Mergaert等人的结果。
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a b
图5 大翼豆晚期(15周瘤龄)根瘤类菌体在显微微室培养中
的繁殖的局部放大图
表 1 NGR234菌株在大翼豆根瘤破碎液中的繁殖能力
瘤龄/周
3
4
5
6
7
8
9
10
11
总菌数/×109·g-1根瘤
22.50
24.05
23.66
25.35
24.20
23.70
22.10
23.90
30.50
活菌数/×109·g-1根瘤
0.80
1.10
1.00
1.60
1.80
2.00
2.30
3.00
8.50
繁殖率/%
3.56
4.57
4.23
6.31
7.44
8.44
10.40
12.55
27.87
290