全 文 ：收稿日期:2008-03-12
基金项目:国家自然科学基金(30500668)
作者简介:王永刚(1974-),男,博士生,主要研究中药新药开发
通讯作者:魏凤环(1976-),女,博士,电话:020-61648263,E-mail:
awag7612@yahoo.com.cn
葛根及粉葛化学成分谱HPCE方法学研究
王永刚,孙学刚,魏凤环(南方医科大学中医药学院,广东 广州 510515)
摘要: 目的 建立葛根及粉葛化学成分谱高效毛细管电泳分析方法。方法 采用 HPCE/DAD分析技术,缓冲液为含
16.7%甲醇的40mmol/L硼砂,压力进样:137.9kPa,5s;分离电压:0~5min,25kV;5~25min:22kV;毛细管温度:20℃。
结果 建立了葛根及粉葛化学成分谱的HPCE分析方法,鉴定了葛根素、大豆苷元两种主要成分。结论 本方法是一种简
单、快速,可用于葛根及粉葛指纹图谱研究的方法。
关键词:葛根;粉葛;化学成分谱;高效毛细管电泳
中图分类号:R282 文献标识码:A 文章编号:1673-4254(2008)08-1407-02
High-performancecapilaryelectrophoresisfordeterminingthechemicalcompositionsof
GegenandFengeextracts
WANGYong-gang,SUNXue-gang,WEIFeng-huan
SchoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China
Abstract: ObjectiveTodevelopamethodforanalyzingthechemicalcompositionsofGegenandFengeextractsusing
high-performancecapilaryelectrophoresis(HPCE).MethodsUsingHPCE/DAD,thechemicalcompositionoftheextracts
wasanalyzedwiththebufersolutionof40mmol/Lboraxcontaining16.7%methanol,withinjectionpressureat137.9kPafor
5s,separationvoltageat25kVin0-5mintimerangeandat22kVin5-25mintimerange,andthetemperatureofthe
capilaryof20℃.ResultsandConclusionThemethodforanalysisofGegenandFengeextractswasestablished,which
identifiedpuerarinanddaidzeinasthetwomajorcomponents.ThissimpleandrapidanalysismethodcanbeusedforGegen
andFengeextractfingerprinting.
Keywords:Gegen;Fenge;chemicalcompositionelectropherogram;high-performancecapilaryelectrophoresis
葛根是豆科植物野葛 (Puerarialobata(Wild.)
Ohwi)的干燥根径,始载于我国汉代《神农本草经》,
是常用的传统中药。葛根在我国分布较广泛,资源很
丰富。2005年以前,药典收载的葛根为豆科植物野葛
Puerarialobata(Wild.) Ohwi或 甘 葛 藤 Pueraria
thomsonilBenth.的干燥根。2005年版《药典》一部开
始将野葛和粉葛分开收载。目前已有葛根指纹图谱
HPLC的研究 [1-4],但未见有用高效毛细管电泳
(HPCE)法对葛根及粉葛进行化学成分谱研究的报
道。本文采用HPCE法对葛根超声醇提液进行研究,
为HPCE用于葛根指纹图谱的建立及药材的鉴定奠
定基础。
1实验材料
1.1仪器
BeckmanP/ACETMMDQ毛细管电泳系统,二极
管阵列检测器,eCAPTM未涂层毛细管 (75!m×60
cm,有效长度 50cm),小型超声波清洗仪(无锡市美
洁超声清洗设备有限公司),分析天平(Denver
AB250D,美国),50l、1000#l定量移液器。
1.2试剂与药品
葛根及粉葛原药材购自广州致信药业有限公司;
经鉴定分别是豆科植物野葛 (Puerarialobata(Wild.)
Ohwi)和甘葛藤 PuerariathomsonilBenth.的干燥根。
葛根素 (752-200108中国药品生物制品检定所),大
豆苷元(1502-200101中国药品生物制品检定所),硼
砂盐、NaOH、乙腈、甲醇等均为分析纯,水为
Milipore超纯水。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
精密称取葛根素适量,溶于甲醇,即得葛根素标
准储备液 (95$g/ml);精密称取大豆苷元对照品适
量,溶于甲醇即得大豆苷元标准储备液(34%g/ml)。
2.2供试品溶液的制备
称取药材粉末 (过3号筛)0.8g,置带塞锥形瓶
中,精密加入30%乙醇50ml,称定重量,50℃超声
(50W,50Hz)30min,放冷,再称重,用 30%乙醇补
足减失的重量,摇匀,过滤,取续滤液用0.45&m微孔
滤膜过滤,即得葛根及粉葛供试品溶液。
2008;28(8) 南方医科大学学报(JSouthMedUniv) 1407· ·
2.3电泳条件
含16.7%甲醇的40mmol/L硼砂盐缓冲系统,检
测波长为240nm,压力进样:137.9kPa,5s;电泳电
压:0~5min,25kV,5~20min,22kV。电泳时间 25
min,毛细管温度20℃。
2.4电泳条件的选择和优化
2.4.1缓冲液种类、浓度和对分离效果的影响 考察
了磷酸缓冲盐和硼砂缓冲盐体系对葛根样品的分离,
发现后者较前者基线平稳;20~60mmol/L范围内硼
砂缓冲盐浓度增高,迁移时间延长,分离度增大,但超
过40mmol/L时分离度增大的趋势变化并不明显,且
各峰迁移时间重现性较差(RSD>5%)。这与缓冲盐浓
度增加,电流增大导致区带增宽及焦耳热增多有关。
故实验以40mmol/L硼砂缓冲盐进行分析。
2.4.2分离电压对分离的影响 考察样品在 16、20、
22、25kV不同运行电压下的分离效果,降低分离电
压,峰迁移时间延长,峰展宽,且峰响应降低,但分离
效果并没有得到明显的改善,结合出峰数目及分析速
度,表明电泳电压:0~5min,25kV,5~20min,22kV
较好。
2.4.3柱温对分离的影响 考察样品在 15、20、25℃
柱温条件下,分离效果的改变,降低柱温,峰迁移时间
延长,峰展宽,分离效果并未得到明显的改善,而升高
柱温,出峰提前,导致峰之间的分离效果降低,结果表
明20℃较好。
2.4.4改性剂对分离的影响 为了进一步改善分离效
果,分别在缓冲体系中加入 10%的阴离子表面活性
剂 SDS,有机试剂乙腈、甲醇、乙醇,结果表明加入
16.7%甲醇对分离效果有改善。
2.4.5检测波长的选择 为了获得最大量的成分信
息,用DAD检测器对葛根提取液从 200~420nm进
行全波长扫描,根据色谱峰的响应程度、色谱峰数目、
基线情况,认为240nm较好。
2.5方法学考察
2.5.1精密度试验 取同一份葛根素和大豆苷元混合
对照品溶液,按照“2.3电泳条件”连续进样6次,结果
表明葛根素对照品(迁移时间 tR=14.80min)峰面积
的相对标准偏差RSD=2.17%,大豆苷元对照品(迁移
时间 tR=17.72min)峰面积的相对标准偏差 RSD=
2.68%,结果表明精密度良好。
2.5.2重现性试验 取同一批葛根6份,按“2.2方法”
制备供试品溶液,并按“2.3电泳条件”进行电泳分析,
结果表明葛根素对照品峰面积的相对标准偏差
RSD=3.25%,大豆苷元对照品峰面积的相对标准偏
差RSD=3.74%,结果表明方法重现性良好。
2.5.3稳定性试验 取同一供试品溶液,4℃放置,分
别在0、5、10、15、25、30h进样分析,结果表明葛根素
对照品峰面积的相对标准偏差RSD=3.73%,大豆苷
元对照品峰面积的相对标准偏差RSD=4.02%,结果
表明方法重现性良好。
2.6样品分析
称取葛根及粉葛适量,按照“2.2供试品溶液的制
备”制备样品,并按“2.3电泳条件”进行电泳分析。结
果表明葛根供试品溶液具有16个成分峰,迁移时间
分 别 为 9.69、9.97、10.11、10.28、12.89、13.10、13.58、
14.07、14.24、14.79、14.92、15.60、17.78、18.69、18.89、
21.54min且各峰之间基本达到基线分离;粉葛供试
品溶液具有 8个成分峰,迁移时间分别为 9.90、
10.06、12.94、13.89、14.59、14.76、15.70、17.64min。
3讨论
本方法只需要25min即可获得葛根及粉葛化学
成分谱,与报道的HPLC法建立的葛根指纹图谱研究
相比大大缩短了分析时间,并且减少了有机溶剂的使
用量,经济环保。
葛根及粉葛成分峰分离良好,尤其主峰葛根素及
大豆苷元基本达到基线分离,有利于每个指标成分的
定量分析。葛根及粉葛醇提液电泳图表明,两者所含
成分有比较大的差异,至于两者的共有峰及各自特征
峰的确定,有待收集不同产地葛根及粉葛药材进一步
研究。本文为葛根及粉葛指纹图谱的研究奠定了良好
的工作基础。
参考文献:
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南方医科大学学报(JSouthMedUniv) 第28卷1408· ·