全 文 ：早熟·晚熟猫尾草过氧化物酶同工酶及抗寒性分析
周卫生　(江西环境工程职业学院,江西赣州 341000)
摘要　[目的 ]猫尾草早熟 、晚熟类型在成熟期上存在明显的差异 ,该研究可为猫尾草种质资源在高寒牧区的利用提供依据。 [方法] 过
氧化物酶同工酶和电导率法配合Logistic方程确定早熟 、晚熟猫尾草冰冻半致死温度。 [结果 ] 4份材料的过氧化物酶同工酶谱带数为
3 ～ 11条 ,相对迁移率分布在 0.169 0～ 0.704 2,早熟、晚熟类猫尾草之间的酶谱相似系数较小。早熟类 2份材料的酶带有差异 ,酶谱相
似系数为 0.750,晚熟类 2份材料的酶带也有差异 ,酶谱相似系数为 0.706。早熟、晚熟猫尾草LT50分别为-34.29 、-33.97℃,绝对数值仅相差 0.32℃。 [结论 ]早熟类与晚熟类猫尾草的遗传相似性较小 ,确证了早熟、晚熟类的差异性大 ,早熟、晚熟猫尾草的抗寒性没有显
著差异 ,它们都能在引种地安全越冬。
关键词　猫尾草;过氧化物酶;同工酶;抗寒性
中图分类号　S543+.1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)32-18011-03
AnalysisofthePeroxidase, IsozymeandColdResistanceofEarlyandLateMaturityPhleumpretenseL.
ZHOUWei-sheng　(JiangxiEnvironmentalEngineeringVocationalColege, Ganzhou, Jiangxi341000)
Abstract　[ Objective] ThebasisoftheutilizationofthePhleumpretenseLgermplasmresourceinalpinepastureregionwasprovidedthrough
theresearchonthediferenceofitsearlyandlatematurityvarieties.[ Method] Thehalflethaltemperatureofprematurityandlate-maturity
PhleumpretenseL.undertheconditionoficewasdeterminedthroughPODisozymes, conductivitymethod, Logisticequation.[ Results] The
resultsshowedthattheactivebandofperoxidaseisozymewasupto3-11bandsin4materials, therateofrelativemigrationwaslocatedinthe
rangefrom 0.169 0to0.704 2 andthesimilarcoeficientoftheperoxidaseisozymebetweenearlyandlatematurityPhleumpretenseLwas
small.Therewasdiferenceinthebandofperoxidaseisozymebetween2earlymaturityspeciesandsodid2latematuritymaterials, thesimilar
coeficientwas0.750 and0.706, respectively.TheLT50 ofearlyandlatematurityPhleumpretenseL.was-34.29and-33.97℃, respec-tively, whichdiferenceofabsolutevaluewas0.32 ℃.[ Conclusion] Therewaslitlegeneticsimilarityandlargerdiferencebetweenearly
andlatematurityspeciesofPhleumpretenseL.Therewasnotobviousdiferenceincoldresistancebetweenearlyandlatematurityvarietiesand
bothofthemcouldsafelybeover-winteredinitsintroducedplace.
Keywords　PhleumpretenseL.;Peroxidase;Isozyme;Coldresistance
作者简介　周卫生(1974-),男 ,重庆人 ,博士 ,讲师 ,从事植物学研究。
收稿日期　 2010-08-09
　　对猫尾草(PhleumpretenseL.)早熟 、晚熟的选育 ,国外作
了大量的工作 ,发现生长早期 ,早熟猫尾草叶在外观上与晚
熟猫尾草没有明显的不同 ,但叶的扩展速度比晚熟的快 ,分
蘖能力低于晚熟品种。早熟猫尾草干物质和细胞壁的消化
率低于晚熟品种 ,中性洗涤纤维达 32 g/kg,比晚熟品种高 。
在给定的茎叶比中 ,早熟猫尾草茎和叶干物质的细胞壁在体
外的消化率高于晚熟品种 ,中性洗涤纤维含量低。因而在特
定的成熟阶段 ,早熟猫尾草茎和叶的营养价值与晚熟猫尾草
相近 [ 1-3] 。
国外对猫尾草耐寒性的研究从多个方面进行过 ,主要在
耐寒品种选育和抗寒机理方面 ,得出了一批产草量高 、品质
好的新品种 [ 4-9] 。在 20世纪 70年代末 80年代初由四川省
草原研究所从美国引进的猫尾草 ,因其越冬性差而放弃了选
育工作 ,经过 20来年的自然选择 ,残存植株的逸生后代适应
了当地的环境 ,研究人员对猫尾草进行了大量的研究工
作 [ 10-13] ,发现早熟 、晚熟类型在成熟期上差别很大 。笔者拟
通过过氧化物酶同工酶酶谱差异探讨其遗传差异 ,电导率法
配合 Logistic方程确定其冰冻半致死温度来探讨引种地猫尾
草的抗寒性 ,为猫尾草种质资源在高寒牧区的利用提供
依据。
1　材料与方法
1.1　材料　早熟(当地 2002年 6月 18日开花)、晚熟(当地
2002年 9月 7日开花)猫尾草植株 。
1.2　方法
1.2.1　过氧化物酶同工酶分析方法。取早熟 、晚熟猫尾草
植株同一时期生长的幼嫩叶 1g,按 1/4的比例加入 Tris-HCl
缓冲液(pH值 6.7),冰浴中研成匀浆 ,经 1 300 r/min离心 ,
取上清液保存在 4 ℃冰箱中备用。同工酶的测定采用垂直
板聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ,分离胶浓度为 7.2%,浓缩胶浓度
为 3.1%,凝胶厚度为 1.5 mm,加样品提取液 20 μl/槽 ,电极
缓冲液采用 pH值 8.3的 Tris-HCl缓冲液 ,电泳开始时的电
流由 1mA/槽增大到 2mA/槽 ,放于冰箱内电泳 3.5 h,每样
电泳 3次 ,过氧化物酶同工酶染色采用醋酸 -联苯胺法 ,显
色 5 ～ 10 min。取显色清晰的胶板 ,绘制酶谱图计算 Rf
值 [ 14-15] 。
1.2.2　抗寒性的电导率测定方法。在测试的前 1d,给试验
材料浇足水 ,使材料含有相近的水分含量。采集早熟 、晚熟
猫尾草植株的根茎迅速进行如下处理:冲洗掉根茎上附着的
土壤 ,用去离子水漂洗 3次 ,每次 5 min,滤纸吸干 ,准确称取
0.1g装入试管 ,重复 3次 ,除 1份材料在 4℃处理外 ,其余都
在 0 ℃下预冷 10 min接种冰晶 ,作 -15、 -20、 -25、 -30、
-35 ℃低温处理各 1h后取出 ,加水到试管刻度的 10 ml处
后振荡数次 ,加塞静置 10 h,再振荡 ,静置后测第 1次电导
率 ,沸水浴 5 min,冷却后测第 2次电导率 ,测前要加水到原
试管刻度 10 ml处 。
1.3　数据处理　同工酶区带的相对泳动率 Rf值计算参照
Kuubus介绍的方法 , Rf值 =酶带迁移距离 /溴酚蓝迁移距
离。对不同类型的猫尾草材料进行同工酶的酶谱结构及特
征分析 ,并采用相似系数聚类法进行聚类分析 。
用电导率法测定组织渗出液电导率的变化 ,分别计算相
对电导率及危害程度 ,并配合 Logistic方程确定早熟 、晚熟猫
尾草的冰冻半致死温度 LT50[ 16-17] 。
相对电导率 =样品煮前电导率 /样品煮后电导率 ×
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(32):18011-18013 责任编辑　李菲菲　责任校对　卢瑶
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.32.175
100%
危害程度 =冻害处理的相对电导率 /对照的相对电导率
2　结果与分析
2.1　过氧化物酶同工酶分析　电泳检测结果表明 , 4份猫尾
草材料(2份早熟类型和 2份晚熟类型)的过氧化物同工酶
在 14个位置上显现酶带(图 1),可分为 2个区 ,即 A区(阴
极区 , Rf=0 ～ 46.48)、B区(阳极区 , Rf=46.48 ～ 70.42),具
体情况见表 1。
图 1　早熟、晚熟猫尾草过氧化物同工酶酶谱
Fig.1　Theperoxidaseisoenzymeprofilesinearly-maturityand
late-maturityPhleumpretenseL.
　　由表 1可知 , A区酶带有 7条 ,早熟类和晚熟类酶带共
有 1条酶带(Rf值 16.90),并且晚熟类为强带 ,早熟类为痕
迹带。早熟材料在 A区还有 2条酶带 ,分别为 Rf值 22.54的
弱带和 30.99的强宽带。晚熟类材料在 A区还有 3条酶带 ,
其 Rf值 25.35为强带 、28.17为弱带和 39.44为强带 ,晚熟材
料 2有 1条独特的酶带 ,是 Rf值为 33.80的强带。B区有 7
条酶带。早熟类材料 2有 2条酶带 , Rf值 46.48和 49.30 2
条强带。晚熟类材料有 6条酶带 , Rf值 49.30弱带 , 52.11弱
带 , 56.34强带 , 59.15材料 1为弱带 、材料 2为强带 , 61.97弱
带 , 70.42材料 1为强带 、材料 2为弱带。
表 1　早熟、晚熟猫尾草过氧化物同工酶带 Rf值
Table1　Rfvalueofperoxidaseisozymeofprematurityandlate-matu-
rityPhleumpretense %
酶带编号
Enzymatic
strapnumber
早熟 1
Prematurity1
晚熟 1
Late-
maturity1
早熟 2
Prematurity2
晚熟 2
Late-
maturity2A区 1 16.90 16.90 16.90 16.90
(PartA) 2 22.54 - 22.54 -
3 - 25.35 - 25.35
4 - 28.17 - 28.17
5 30.99 - 30.99 -
6 - - - 33.80
7 - 39.44 - 39.44
B区 8 - - 46.48
(PartB) 9 - - 49.30 49.30
10 - - - 52.11
11 - - - 56.34
12 - 59.15 - 59.15
13 - - - 61.97
14 - 70.42 - 70.42
　　采用酶谱的相似系数进行聚类分析 ,即用数学方法将一
批样品(变量)按其性质的亲疏程度进行分类的科学方法 ,用
某种相似系数来描述样品之间的关系。亲缘关系越近的种
类 ,相似系数越接近 1,彼此无关的种类 ,相似系数越接近于
0。酶谱相似系数 =2个分类群中的酶带数 /2个分类群中的
酶带总数 ,各材料间的酶谱相似系数见表 2,由表 2数据所得
的聚类图见图 2。
表 2　早熟、晚熟猫尾草过氧化物酶酶谱相似系数
Table2　Thesimilaritycoefficientofpoeroxidaseisoenzymeprofilesof
prematurityandlate-maturityPhleumpretense
材料类型
Materialtypes
晚熟 1
Late-maturity1
早熟 2
Prematurity2
晚熟 2
Late-maturity2
早熟 2Prematurity2 0.182
晚熟 2Late-maturity2 0.706 0.250
早熟 1Prematurity1 0.222 0.750 0.143
图 2　早熟、晚熟猫尾草过氧化物酶同工酶聚类图
Fig.2　Theclusteringmapsofperoxidaseisoenzymeofprematu-
rityandlate-maturityPhleumpretense
　　聚类分析结果表明 ,早熟材料 1和早熟材料 2的遗传相
似性较大 ,亲缘关系较近 ,晚熟材料 1和晚熟材料 2的遗传
相似性较大 ,亲缘关系较近 ,早熟类与晚熟类的遗传相似性
较小 ,亲缘关系较远。
2.2　抗寒性分析　当植物遭受冻害伤害时 ,细胞膜常会受
到伤害 ,从而引起细胞内物质(离子 、糖 、氨基酸)的外渗 ,一
些物质的外渗透率与膜伤害程度高度相关。以电导率法测
定上述物质外渗率 ,即可了解不同材料抗寒性之差异。 2种
类型的猫尾草随着温度的降低其电解质透出率和危害程度
见表 3。
表 3　不同处理温度下早熟、晚熟猫尾草电解质透出率、危害程度
Table3　Theelectrolytepenetratingratioandharmdegreeofprema-
turityandlate-maturityPhleumpretenseatdiferenttreat-
menttemperatures
处理温度∥℃Treatmenttemperature
早熟 Prematurity
电解质透出率∥%Electrolyteleakage
危害程度Harmdegree
晚熟 Late-maturity
电解质透出率∥%Electrolyteleakage
危害程度Harmdegree
4 10.5 - 10.8 -
-15 16.6 1.58 15.6 1.44
-20 28.6 2.72 24.2 2.24
-25 34.6 3.30 35.9 3.32
-30 84.0 8.00 70.1 6.49
-35 84.7 8.07 75.2 6.69
　　从表 3可见 ,随处理温度的逐渐降低 ,在开始的时间里
组织的电解质透出率随温度的变化较小 ,说明膜遭受低温的
伤害不大;之后的一段温度范围内 ,电解质透出率随温度的
降低较大 ,说明低温对膜的伤害较大;最后的一段温度范围
内 ,电解质透出率随温度的降低变化较小 ,说明膜透性基本
18012 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
上已破坏 ,因而即使继续降低温度 ,电解质的透出率也不会
上升多少。早熟 、晚熟猫尾草电解质透出率曲线理论上普遍
呈 S形 ,因而可以推论 ,当曲线出现拐点的温度 LT50有可能
是引起膜不可逆伤害的临界点 ,可用来确定植物组织的低温
半致死温度。
早熟 、晚熟猫尾草在不同低温下电解质透出率拟合 Lo-
gistic方程 Y=K/1+ae-bx具有较好的拟合度 ,求该方程的二
阶导数并令其等于 0,则可获得曲线的拐点 ,即为 LT50 ,在此
点低温对电解质透出率的递增效应最大 。早熟 、晚熟猫尾草
LT50分别为 -34.29、-33.97℃,绝对数值仅相差 0.32 ℃,说
明早熟 、晚熟猫尾草的抗寒性差异不大。拟合 Logistic方程
Y=K/1+ae-bx如下:早熟猫尾草的拟合方程 y=0.260 7/1
+7.508e-0.098 8x;晚熟猫尾草的拟合方程 y=0.006 1/1 +
6.482e-0.068 4x。
3　结论与讨论
酶的差异在一定程度上反映了基因的差异 ,对同工酶的
分析 ,可将宏观的遗传现象与微观的分子水平联系起来 ,过
氧化物酶是单基因控制的 ,其同工酶在一定程度上反映了
种 、品种间的遗传差异 ,用它作为种 、品种的鉴定具有一定的
参考价值;另外 ,在种质资源的系统研究和比较方面 ,它更能
全面地反映其遗传上的差异。 4份材料的猫尾草在同一生长
阶段其过氧化物酶酶谱差异极大 ,最多的有 11条酶带 ,最少
的仅有 3条 。早熟类本身也存在差异 ,但相同的酶带是多
数 ,酶谱相似系数为 0.750,说明遗传基础相近 ,从同工酶的
水平上也表明它们是一个类型。晚熟类本身也存在差异 ,但
相同的酶带是多数 ,酶谱相似系数为 0.706,说明遗传基础相
近 ,从同工酶的水平上也表明它们是一个类型。早熟 、晚熟
类猫尾草之间的酶谱相似系数较小 ,确证了早熟 、晚熟类的
差异性。
该试验通过电导率的测定 ,求得早熟 、晚熟猫尾草 LT50
分别为 -34.29、 -33.97 ℃。四川省红原县的绝对最低气温
为 -33.30℃,可见早熟 、晚熟猫尾草都能安全越冬 ,表明该
研究中早熟 、晚熟猫尾草的选育可以不考虑抗寒越冬的
问题。
参考文献
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(上接第 17993页)
3　结语
2010年 3月 ,第 2届全国现代物理农业工程技术发展研
讨会在天津召开 ,来自全国 16个省市的农业和物理业的专
家学者 、农技人员们就目前我国的物理农业发展现状和将来
的发展方向 、发展方式等问题作了全面的分析和研讨 ,并对
下一步我国物理农业技术发展的实施作了详细的布署 ,声
波 、等离子 、电场和磁场等技术的应用一定会为我国农业现
代化的发展作出更多的贡献。但是 ,也要看到 ,物理农业技
术的推广往往会应用到各种各样的新设备 、新机械 ,这些新
设备的一次性投入成本都比较高 ,而农民对投入过高的设备
一般怀有抵触情绪 ,许多农民明知道是很好的物理农业技术
设备 ,却因为价格等因素无力承受。因此 ,政府应该出台相
关政策 ,对一次性投入过高的农业设备进行相应的资金补
贴 ,尽量减少农民的投入成本。有些设备也可以分批付款的
形式 ,让农民边使用边付款 ,在使用的过程中农民可以体会
到物理农业设备的好处 ,并且带动更多的农民使用和受益。
物理农业设备一般寿命都比较长 ,大多在 10 ～ 15年 ,这
样平均到每年下来的投入就不算高了 ,而且物理农业技术具
有提高产量 、促进早熟 、改善品质和减少化肥农药使用量的
优点。这其中的每个环节都能够增加收入和节约支出 ,尤其
是当前市场对绿色的 、无公害的 、有机农产品更是需求巨大 ,
产品供不应求 ,其价格也是普通农产品的 1倍甚至是几倍。
所以 ,利用物理农业技术发展现代化无公害优质农产品 ,有
着惊人的经济效益。这将刺激越来越多的农民加入到农业
种植的技术改造中来。因此 ,大力发展物理农业技术 ,将是
农业发展的大势所趋。
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