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高效液相色谱电喷雾质谱快速鉴定粉葛中C-苷及O-苷同分异构体



全 文 :DOI:10.3724/SP.J.1096.2012.10706
高效液相色谱电喷雾质谱快速鉴定
粉葛中C-苷及O-苷同分异构体
周 安1,2 孙晓娟3 吴 虹1,2 李庆林1,2 吴鸿飞*1,2
1(安徽中医学院,合肥230038) 2(安徽省现代中药研究与开发重点实验室,合肥230038)
3(赛默飞世尔科技(中国)有限公司,上海201206)
摘 要 采用高效液相色谱(二极管阵列)/电喷雾质谱联用系统(HPLC-PDA-ESI-MSn)快速鉴定中药粉葛
中C-苷及O-苷异黄酮同分异构体。选用 Hypersil Gold C18(150mm×2.1mm×3 m)色谱柱,以水(含0.
1%甲酸)-乙腈为流动相进行梯度洗脱,研究了粉葛中11种异黄酮类化合物的正离子一级、多级质谱及PDA
光谱;分析鉴别了两对同分异构体;预测了两种未知微量成分结构,建立了区分粉葛中异黄酮类化合物同分
异构体的电喷雾质谱新方法。
关键词 粉葛;高效液相色谱-电喷雾质谱;同分异构体;源内碰撞诱导解离
 2011-06-29收稿;2011-10-11接受
本文系国家自然科学基金(No.81001703)、安徽中医学院自然科学基金(No.2011zr014B)资助项目
*E-mail:wuhongfei2009@126.com
1 引 言
粉葛(Radix puerariae thomsoni)为豆科植物甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth)的干燥根,味
甘,辛、凉,有解肌退热、透疹、生津止渴、通经活络之功效[1]。粉葛自古与野葛同作葛根用。研究发现,
粉葛与葛根(野葛)HPLC指纹图谱[2]及临床应用[3]存在较大差别,2005版中国药典首次将粉葛与葛
根(野葛)分列作为中药材记载。粉葛中主要成分为异黄酮类化合物,大部分以苷的形式存在,主要包
括:葛根素、3′-羟基葛根素、大豆苷等[4,5],其主要结构见表1。该类化合物中存在多对同分异构体,主
要分为碳苷和氧苷两类化合物。同分异构体结构相似,极性相近,分离难度大。分离和鉴别中药中同
分异构体化合物,一直是药物分析的难题。
高效液相色谱-质谱联用(HPLC-ESI-MS)技术结合了色谱与质谱的优点,可有效分析复杂混合物
中的单个和多个组分[6,7]。文献[8,9]采用高效液相色谱(二极管阵列)/电喷雾质谱联用系统(HPLC-
ESI-MS)方法分析葛根中异黄酮类化合物。但对粉葛中化合物质谱分析尚未见报道。本研究采用
HPLC-PDA-ESI-MSn技术鉴别分析了粉葛中C-苷和O-苷两类化合物,建立区分粉葛中异黄酮类化合
物同分异构体的电喷雾质谱方法。
表1 粉葛中主要异黄酮类化合物
Table 1 Main isoflavones in Radix puerariae thomsoni
异黄酮
Isoflavones
编号
No.
化合物
Compound R1 R2 R3 R4 R5
分子量
Mw(U)
1 3′-羟基葛根素3′-Hydroxypuerarin H  H  glc  OH  H  432
2 染料木苷 Genistin  OH  glc  H  H  H  432
3 葛根素Puerarin  H  H  glc  H  H  416
4 大豆苷 Daidzin  H  glc  H  H  H  416
5 4′-葡萄糖大豆苷4′-O-glucosyl daidzin H  H  H  H  glc  416
6 葛根素木糖苷Puerarin-xyloside
H  H -glc6-xyl  H  H  548
7 大豆苷元 Daizein  H  H  H  H  H  254
8 染料木素 Genistein  OH  H  H  H  H  270
9 大豆苷元-4′
,7-二葡萄糖苷
Daidzein-4′,7-diglucoside
H  glc  H  H  glc  578
第40卷
2012年4月
           
分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
           
第4期
612~616
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
FinniganSurveyor-LTQ XL二维线性离子阱液质联用仪(美国Thermo Finnigan公司),质谱配有电喷雾
离子源(ESI);高效液相色谱仪系统(Surveyor HPLC)包括Surveyor PDA Plus检测器、Surveyor AutoSample
Plus自动进样器、Surveyor MS Pump四元泵;Xcalibur 2.0化学工作站软件;Mass Frontier 6.0软件。
粉葛药材购于合肥市当地药店,经安徽中医学院药学院中药教研室王德群教授鉴定为豆科植物甘
葛藤(Pueraria thomsonii Benth)的干燥根;葛根素对照品(中国药品生物制品检定所,批号0752-
200509);乙腈、甲酸(色谱纯,美国 Merck公司),实验用水为亚沸蒸馏水。
2.2 样品处理
2.2.1 对照品溶液配制 准确称定葛根素对照品1.2mg,置于10mL容量瓶中,以甲醇定容,摇匀,
作为储备液。准确移取1.00mL储备液,以甲醇定容至10mL,经0.22m滤膜过滤后,即得对照品
溶液(12ng/L)。
2.2.2 供试品溶液配制 取粉碎过40目筛粉葛药材0.5g(粒径<0.45mm),准确称定,置平底烧瓶
中,加入50mL甲醇-水(2∶1,V/V),加热回流30min,用甲醇-水(2∶1,V/V)补足重量,过滤,取续
滤液1.0mL,用甲醇定容至10mL,经0.22m滤膜过滤后,得供试品溶液。
2.3 色谱-质谱条件
Hypersil Gold C18色谱柱(150mm×2.1mm×3m);流动相:0.1%(V/V)甲酸(A)/乙腈(B),线性
梯度洗脱程序:0~5min,90% A;5~17min,90%~50% A;17~22min,50%~10% A;22~30min,
10% A。流速0.2mL/min;检测波长254nm;进样量10L,柱温25℃。电喷雾(ESI)离子源,喷雾电
压:4.0kV;鞘气(N2)流速:35个单位;辅助气(N2)压力流速:5个单位;金属毛细管温度300℃;正离子方
 图1  粉葛样品紫外(250nm)色谱图(A)和质谱总离
子图TIC(B)
Fig.1 High performance liquid chromatograms of Radix
puerariae thomsonii:(A)Liquid chromatography/ultravi-
olet profile chromatogram(250nm),(B)LC/mass spec-
tral profile total ion current chromatogram
1.大豆苷元-4′,7-二葡萄糖苷(Daidzein-4′,7-diglucoside);2.
葛根素(Puerarin);3.葛根素木糖苷(Puerarin-xyloside);4.大
豆苷(Daidzin);5.3′-羟基葛根素(3′-Hydroxypuerarin);7.4′-
葡萄糖大豆苷(4′-O-glucosyl daidzin);9.染料木苷(Genistin);
10.大豆苷元(Daizein);11.染料木素(Genistein)。
式检测模式,扫描范围:m/z100~1000,级质谱离子隔离宽度2(m/z),碰撞能量为35% 。
3 结果与讨论
3.1 粉葛药材提取物的HPLC-PDA-MSn分析
图1为粉葛供试品 HPLC-PDA-UV图及 HPLC-
ESI-TIC总离子流色谱图,共检测出11种化合物,各
化合物分子量信息及多级质谱CID裂解碎片离子见
表3,根据分子量信息、多级质谱碎片及出峰时间,参
考文献[4,5],基本推测出9种化合物(表2)。
3.2 粉葛药材中同分异构体HPLC-PDA-MSn分析
3.2.1 利用多级质谱及PDA光谱区分葛根素、大豆
苷及4′-葡萄糖大豆苷同分异构体 葛根素、大豆苷及
4′-葡萄糖大豆苷三种化合物分子量均为416。2,4和
7号峰一级质谱具有相同分子离子峰[M+H]+ m/z
417,提取离子流图见图2。2号峰二级质谱具有4个
主要碎片离子峰,分别为m/z399,381,363和351,
通过 Mass Frontier软件分析得出m/z399为D环糖
苷(m/z417)脱去一分子水产生;m/z399继续脱去一
分子水产生m/z381离子;m/z381继续脱去一分子
水得到 m/z 363离子;m/z 381发生开环脱去一
CH2OH得到m/z351离子,该裂解规律与文献[10]
葛根 素 质 谱 裂 解 规 律 一 致。通 过 对 2 号 峰 质
谱分析及其与葛根素对照品具有相同出峰时间和质
316第4期 周 安等:高效液相色谱电喷雾质谱快速鉴定粉葛中C-苷及O-苷同分异构体   
表2 粉葛中主要化合物的紫外吸收、离子碎片
Table 2 Main MS fragments and UVλmaxvalues of isoflavones in Radix puerariae thomsonii
峰号
Peak No
保留时间
tR(min)
分子离子峰
[M+H]+
(m/z)
最大紫外吸收
Maximum absorption
wavelength
(nm)
化合物推测
Compound presumed
主要碎片
Main fragments(m/z)
1  3.7  579  224,277
大豆苷元-4′,7-二葡萄糖苷
Daidzein-4′,7-diglucoside
MS2:417,255;MS3:237,227,
199,137
2  9.3  417  252,307 葛根素Puerarin MS
2:399,381,363,MS3:351,
321,297
3  12.7  549  220,251
葛根素木糖苷
Puerarin-xyloside
MS2:417;MS3:399,381,363;
MS3:351,321,297
4  17.1  417  225,264 大豆苷 Daidzin MS
2:255;MS3:237,227,199,
137
5  20.3  433  213,317 3′-
羟基葛根素
3′-Hydroxypuerarin
MS2:15;MS3:97,379,367,
337
6  21.7  565  227,260
未知化合物
Unknown compound
MS2:33;MS3:97,379,367,
337
7  22.8  417  233,314 4′-
葡萄糖大豆苷
4′-O-glucosyl daidzin
MS2:55;MS3:37,227,199,
137(RDA)
8  23.0  565
吸收太低
Low absorption
未知化合物
Unknown compound
MS2:433;MS3:271,253,243,
215,153
9  24.6  433  213,308 染料木苷 Genistin MS
2:271;MS3:253,243,215,
53
10  25.9  255  215,265 大豆苷元 Daizein  MS2:237,227,199,137
11  26.1  271  220,303 染料木素 Genistein  MS2:253,243,215,153
 RDA:逆狄尔斯-阿德尔裂解(Retro Diels Alder fragmentation)。
 图2 m/z417,433和565的提取离子流图
Fig.2 Extracted ion chromatogram of m/z 417,433
and 565
谱特征,判定2号峰为葛根素。4号峰与7号峰的
一至三级质谱完全相同。PDA光谱图中4号峰最大
吸收光谱为225和264nm,7号峰最大吸收光谱为
233和314nm,7号峰紫外光谱明显红移,大豆苷7
位葡萄糖取代,4′位为羟基;4′-葡萄糖大豆苷葡萄糖
取代在A环的4′位,7位为羟基,B环和C环共轭
体系对紫外吸收贡献较 A 环大,根据 Woodward-
Fieser经验规则, OH 对紫外吸收作为助色团
比 OC OR 贡献大, OH 连接在7位上化合
物紫外吸收波长相对4′位可产生红移,因此可判定
4号峰为大豆苷,7号峰为4′-葡萄糖大豆苷,两者
PDA光谱图见图3。
图3 大豆苷(A)与4′-葡萄糖大豆苷(B)的光谱图
Fig.3 UV spectra of daidzin(A)and daidzein 4′-glucoside(B)
3.2.2 利用多级质谱区分3′-羟基葛根素和染料木甙同分异构体 5号峰和9号峰分子离子峰均为
[M+H]+m/z433。二级质谱中,5号峰 [M+H]+离子脱去一分子 H2O得到m/z415离子;9号峰
二级质谱碎片为m/z271,是分子离子脱去了一个葡萄糖基而成。染料木甙为氧苷化合物,葡萄糖基键合
在7位氧上, C O 键容易断裂,容易脱去葡萄糖基;而3′-羟基葛根素是葛根素在3′位上取代羟基,属
416   分 析 化 学 第40卷
于C-苷类化合物,二级质谱易开环脱去水分子。通过二级质谱可判定,5号峰为3′-羟基葛根素,9号峰
为染料木甙。
3.2.3 多级质谱推测未知化合物结构 6号峰和8号峰分子离子峰均为[M+H]+ m/z 565,两者二
级质谱碎片均为m/z433,分子量相差132,相当于脱去一个木糖(xyl)。6号峰二级、三级、四级裂解
碎片与3′-羟基葛根素对应一级、二级、三级裂解碎片完全一致,6号峰对应于3′-羟基葛根素结构差异
表现在多1个xyl基团,因此6号峰结构式应该以3-羟基葛根素为母核,xyl应连接在7位、3′或4′位
氧上,由于7位、3′连接xyl后分子位阻较大,所以初步推测6号峰结构为3′-羟基葛根素4′位xyl基取
代化合物。8号峰多级质谱图谱与染料木甙存在同样对应关系,结构中多1个xyl基团,由于7位被
glc取代,该基团应连接在5位或4′位氧上,考虑连接5位后空间位阻较大,初步推测8号峰结构为染
料木甙4′位xyl取代化合物。
3.3 粉葛中异黄酮化合物ESI-MS特征质谱规律及光谱性质
由表2中粉葛化合物裂解碎片可看出,C-苷类化合物如葛根素、3′-羟基葛根素等,葡萄糖基与苷
元通过 C C 连接,较牢固,ESI-MS下一般不易断裂。葡萄糖基首先发生开环产生一系列脱水峰,
容易脱去 C O 中性丢失及CH2O等碎片。O-苷类化合物质谱裂解比较简单,由于糖基连接在O原
子上成 C O , C O 键能较小,一般首先断裂,大豆苷元4′,7-二葡萄糖苷、大豆苷、染料木苷等O-
苷类化合物首先脱去糖基,苷元离子相对稳定,一般容易中性丢失 C O 键,同时也容易发生RDA
裂解,失去C8H6O(m/z118)。
粉葛中主要为异黄酮类化合物,普遍具有紫外吸收,从母核结构中可看出,B环和C环共轭体系
对紫外吸收贡献比A环大。当该类化合物A环连接羟基时,如3′-羟基葛根素、染料木苷、葛根素-4′-
葡萄糖大豆苷、大豆苷元、染料木素等化合物,最大紫外吸收波长一般超过300nm;而大豆苷、葛根素
木糖苷、大豆苷元、4′,7-二葡萄糖苷3种化合物A环羟基被取代,最大紫外吸收波长不超过280nm,
通过PDA紫外光谱图性质也可以协助鉴定分析该类化合物。
References
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516第4期 周 安等:高效液相色谱电喷雾质谱快速鉴定粉葛中C-苷及O-苷同分异构体   
Rapid Identified C-Glycosides and Their Isomer O-Glycosides in
Radix Puerariae Thomsoni Using High Performance Liquid
Chromatography-Photo Diode Array-Electrospray
Ionization Tandem Mass Spectrometry
ZHOU An1,2,SUN Xiao-Juan3,WU Hong1
,2,LI Qing-Lin1
,2,WU Hong-Fei*1
,2
1(Anhui University of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230038,China)
2(Anhui Province Key Laboratory of R&D of Chinese Medicine,Hefei 230038,China)
3(Thermo Fisher Scientific,Shanghai 201206,China)
Abstract C-glycosides and their isomer O-glycosides of isoflavones in radix puerariae thomsoni were
rapid identified by high performance liquid chromatography photo diode array detection electrospray
ionization tandem mass spectrometry(HPLC-PDA-ESI/MSn).The separation conditions employed
for HPLC were optimized.A Hypersil Gold C18column(3m,2.1mm×150mm)was used in this
study.The mobile phase consisted of water(0.1%formic acid)(A)and acetonitrile(B)in a gradient
mode.The flow rate was 0.2mL/min.Eleven isoflavones compounds included two pairs of isomers
in radix puerariae thomsoni were identified by online photodiode array detection-MSn and the data
obtained by this method were compared with that from the reported literature.Two unknown trace
isoflavones isomers were predicted.This method could be used to quickly and conveniently distinguish
the isomers isoflavones in Radix puerariae thomsoni.
Keywords Radix Puerariae Thomsoni;High performance liquid chromatography photo diode array
detection electrospray ionization tandem mass spectrometry;Isomers;Colision induced dissociation
(Received 29June 2011;accepted 11October 2011
櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫

中国化学会分析化学委员会关于申请
“分析化学基础研究梁树权奖”的通知
  分析化学基础研究梁树权奖是以我国著名分析化学家梁树权先生命名的分析化学领域的最高奖项。本奖项旨在鼓
励我国中、青年分析化学工作者献身于分析化学学科的基础研究和教育工作,培养优秀人才,促进和推动我国分析化学
学科的发展。
本奖项为国内分析化学基础研究成果个人奖。凡年龄在50周岁以下,具备下列条件之一者均可申报参加评选:
(1)在分析化学基础研究中确有创新,观点明确、数据完整、结论可靠,并已在国内外刊物上发表或在全国性学术会议上
宣读获得好评者;(2)在解决分析化学基础研究中某一技术难题有独创和革新,并经鉴定确认对国民经济建设有较大经
济效益或社会效益者。
中国化学会分析化学委员会将于2012年1月1日至2012年8月10日受理第五届“分析化学基础研究梁树权奖”的
申请。申请材料包括申请表、单位推荐书、成果技术资料(论文目录———包括题目、发表时间及刊物,5~10篇有代表性
的论文及对所取得的成就的综述1000~2000字),国内外的反映和引用期刊(最好附SCI检索),获奖成果及成果推广
和应用情况,社会或经济效益,以及有关证明材料。全部申请材料均需打印,一式五份寄长春市人民大街5625号中国
科学院长春应用化学研究所陈杭亭收(邮编130022)。材料概不退回,请自留底稿。
申请表格式登录网站http://www.analchem.cn本刊公告栏查询。
中国化学会分析化学委员会
2012年1月
616   分 析 化 学 第40卷