全 文 ：收稿日期:2016-05-26 接受日期:2016-06-29
基金项目:兰州大学“国家级大学生创新创业训练计划”项目
(201310730157)
* 通讯作者 Tel:86-931-8289562;E-mail:maxm@ lzu． edu． cn
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2016，28:1545-1548
文章编号:1001-6880(2016)10-1545-04
砂生槐多糖提取物对免疫抑制模型小鼠 Treg和 Th17 的影响
雒艳萍1，贾天玉1，管 彬1，冯燕海1，史彦斌2，马兴铭1，3*
1兰州大学基础医学院;2兰州大学药学院;3 甘肃省新药临床前研究重点实验室，兰州 730000
摘 要:为了开发藏药砂生槐的药用价值，本文拟研究其多糖提取物对免疫抑制小鼠调节性 T 细胞(Treg)和
Th17的影响。水提醇沉法提取砂生槐枝条多糖物质，腹腔注射环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，模型小鼠经砂
生槐多糖灌胃干预后，分离脾细胞，流式细胞术检测 CD4 + T细胞比例和 CD4 + CD25 + Treg细胞比例;收集血清，
ELISA检测 IL-17 水平。结果显示，各剂量组砂生槐多糖均能够引起免疫抑制小鼠的脾脏 CD4 + CD25 + Treg 细
胞比例明显增多(P ＜ 0． 05) ，同时明显抑制 IL-17 的产生(P ＜ 0． 05)。以上结果提示砂生槐多糖可能通过上调
Treg而抑制免疫功能，同时抑制 IL-17 的产生，发挥免疫抑制作用。
关键词:砂生槐;植物多糖;调节性 T细胞;IL-17
中图分类号:R392;R932 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2016． 10． 008
Effects of Polysaccharides Extract of Sophora moorcroftiana
on CD4 +CD25 +Treg and Th17 in Immunosuppressed Mice
LUO Yan-ping1，JIA Tian-yu1，GUAN Bin1，FENG Yan-hai1，SHI Yan-bin2，MA Xing-ming1，3*
1School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University;2School of Pharmacy，Lanzhou University;3 Key
Lab of Preclinical Study for New Drugs of Gansu Province，Lanzhou 730000，China
Abstract:Sophora moorcroftiana is the specific plant in Tibet and gets little development since grows in the remote
place． In order to research its medicinal value，we firstly extract Sophora moorcroftiana polysaccharides (SMP)and in-
vestigate the effects on CD4 + CD25 + regulatory T cells (CD4 + CD25 + Treg)cells and Th17 cells in immunosuppressed
mice． SMP was extracted from branch of Sophora moorcroftiana after water extraction and alcohol precipitation． The im-
munosuppressed mice induced by cyclophosphamide were treated with SMP，then the ratio of CD4 + T cells and CD4 +
CD25 + Treg cells were analyzed by flow cytometry and the serum interleukin-17 (IL-17)were detected by enzyme-
linked immunosorbent assay (ELISA)． The results showed that each dose SMP increased the frequency of CD4 + CD25 +
Treg in spleen and decreased the serum IL-17 production． In conclusion，SMP plays a role in immunosuppression by up-
regulating Treg and suppressing IL-17 production．
Key words:Sophora moorcroftiana;Plant polysaccharide;Regulatory T cells;Interleukin-17
砂生槐(Sophora moorcroftiana)属豆科(Legu-
minosae)槐属(Sophora) ，生于山谷和溪边的林下或
石砾灌木丛中，海拔 3000 ～ 4500 m，分布于我国西
藏(雅鲁藏布江流域) ，印度、不丹、尼泊尔也有分
布，具有极强的抗旱、抗风沙功能［1］。据《中国民族
药志要》记载，砂生槐子在民间主要用于治疗白喉，
虫病，黄疸性肝炎，化脓性扁桃体炎［2］。现代医学
药理学研究表明，槐属植物中提取的活性成分生物
碱对免疫功能多具有抑制作用，而黄酮类化合物主
要具有抗菌、抗炎、抗肿瘤活性，对多糖的研究则较
少。调节性 T细胞(regulatory T lymphocyte，Treg)能
够抑制免疫而参与疾病的发生发展，已成为目前预
防和治疗许多疾病的靶点之一［3，4］。新近发现的主
要分泌 IL-17 为主的 T 细胞亚群 Th17 细胞(T help
cell 17，Th17)与 Treg之间存在复杂的关系，在发育
及功能上相互拮抗。由于西藏能源短缺，当地老百
姓将砂生槐连根挖下当柴烧，对植被的破坏性极大，
不但造成草地植物的退化，而且使沙漠化面积不断
扩大，导致生态失衡，为了保护我国这一特有植株和
开发砂生槐的药用价值，本实验首次从砂生槐地上
枝条部分提取多糖，研究其对免疫抑制小鼠 Treg 及
Th17 的影响，为开发砂生槐植物资源的药用价值提
供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 主要试剂及材料
砂生槐地上枝条部分采自西藏林芝地区;环磷
酰胺为山西普德药业股份有限公司产品(批号:
04130901) ;FITC-抗 CD4(克隆号 RM4-5)和 APC-抗
CD25(克隆号 PC61． 5)购自 eBioscience(美国) ，EZ-
SepTM MOUSE 1 ×淋巴细胞分离液和小鼠 IL-17 预
包被 ELISA试剂盒为深圳达科为生物技术有限公
司产品。
1． 2 主要仪器
旋转蒸发器 RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂;
分光光度计，上海现科分光仪器有限公司;LFRFort-
essa流式细胞仪，BD公司;ST-360 酶标仪，上海科华
实验系统有限公司。
1． 3 砂生槐多糖提取及浓度测定
从西藏林芝获得砂生槐地上枝条部分药材
234． 00 g，用常规水提醇沉法得到多糖 10． 96 g，产
率 4． 68%。苯酚浓硫酸法测得提取物中多糖的含
量为 26． 19%。
1． 4 动物、分组及给药
昆明种小鼠，雌性，重 18 ～ 22 g，购自兰州大学
医学实验中心(动物合格证号:62000800000103)。
随机分为正常对照组、模型组、砂生槐多糖低剂量
组、砂生槐多糖中剂量组、砂生槐多糖高剂量组，每
组 10 只。给药如下，正常对照组:生理盐水 0． 2
mL /d，腹腔注射，连续 3 d，第 4 d给予生理盐水灌胃
0． 2 mL /(20 g·d) ，连续 10 d;模型组:环磷酰胺 80
mg /(kg·d)腹腔注射，连续 3 d，以后每周腹腔注射
一次环磷酰胺 80 mg /kg，在此基础上第 4 d 灌胃给
予生理盐水，用量、给药天数同正常对照组;砂生槐
多糖干预组:环磷酰胺 80 mg /(kg·d)腹腔注射，连
续 3 d，以后每周腹腔注射一次环磷酰胺 80 mg /kg，
在此基础上第 4 d 灌胃给予砂生槐多糖，药物浓度
分别为 250 mg /(kg·d) (低剂量组)、500 mg /(kg·
d) (中剂量组)、1000 mg /(kg·d) (高剂量组) ，连
续 10 d。
1． 5 小鼠脾细胞悬液制备
颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏，剪碎后置于 200 目
尼龙网，用玻璃注射器内芯研压脾脏，使其成为单个
细胞，分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离
液中，把含有脾细胞的淋巴细胞分离液立即转移到
离心管，小心加入 200 μL 不完全 1640 培养液，800
g离心 40 min，用巴氏吸管吸出单个核细胞层的细
胞，转移至新的离心管，用流式洗液洗涤细胞后，250
g离心 10 min，弃去上清，加入 2 mL 流式洗液重悬
细胞，细胞计数，调整细胞浓度为 1 × 107 个 /mL，用
于荧光抗体染色。
1． 6 流式细胞术检测脾脏 CD4 + T 细胞和 CD4 +
CD25 + Treg细胞比例
取 100 μL细胞悬液，加荧光素标记抗体 FITC-
抗 CD4 和 APC-抗 CD25，混匀后在 4 ℃条件下避光
孵育 30 min，直接加入预冷流式缓冲液 1 mL，重悬
细胞，400 g离心 5 min，吸弃上清，将沉淀细胞重悬
在 500 μL流式缓冲液中，上机检测 CD4 +和 CD25 +
细胞，FlowJo软件分析 CD4 + T 细胞和 CD4 + CD25 +
Treg细胞占淋巴细胞的比例及 CD4 + CD25 + Treg 细
胞占 CD4 + T细胞的比例。
1． 7 ELISA测定血清 IL-17 水平
眼球采血，37 ℃放置 1 h后，500 g离心 15 min，
收集上清，采用商品化试剂盒通过酶联免疫吸附试
验双抗体夹心法检测 IL-17 水平，试验过程严格按
照试剂盒说明书进行。
1． 8 统计处理
所有数据以均数 ±标准差表示，采用 SPSS 19． 0
软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA) ，以 P
＜ 0． 05 作为统计学意义的标准。
2 实验结果
2． 1 砂生槐多糖对小鼠脾脏 CD4 + T 细胞和 CD4 +
CD25 + Treg细胞比例的影响
通过流式细胞术检测脾脏 CD4 + T 细胞和
CD4 + CD25 + Treg 细胞，分析其占脾脏淋巴细胞或
CD4 + T细胞的比例。结果发现，与正常对照组小鼠
比较，模型组和各剂量砂生槐多糖处理组 CD4 + T细
胞占脾淋巴细胞比例均明显下降(P ＜ 0． 01) ;与模
型组比较，经砂生槐多糖处理后，CD4 + T 细胞占脾
淋巴细胞比例都有不同程度下降，但仅低剂量组经
统计具有显著性差异(P ＜ 0． 05) (图 1)。说明砂生
槐多糖协同环磷酰胺，降低 CD4 + T细胞产生。分析
CD4 + CD25 + Treg细胞占脾淋巴细胞比例表明，仅砂
生槐低剂量组与正常对照组比较明显降低，差异具
有统计学意义(P ＜ 0． 05) ;而与模型组比较，各剂量
砂生槐多糖处理组对 CD4 + CD25 + Treg 细胞占脾淋
巴细胞比例无明显影响(图 2)。进一步分析 CD4 +
6451 天然产物研究与开发 Vol. 28
CD25 + Treg细胞占 CD4 + T细胞比例，与正常对照组
相比，尽管模型组脾脏 CD4 + CD25 + Treg 细胞占
CD4 + T细胞比例有升高趋势，但无统计学差异，而
图 1 砂生槐多糖对小鼠脾脏 CD4 + T 细胞 /淋巴细胞比
值的影响
Fig. 1 Effect of SMP on the ratio of CD4 + T cells to spleen
lymphocytes in mice
注:* P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01
砂生槐多糖各剂量组均明显增高(P ＜ 0． 05) ，尤其
砂生槐多糖高剂量组升高最明显(P ＜ 0． 01) (图
3)。以上数据表明，砂生槐多糖对环磷酰胺引起的
免疫抑制具有协同作用。
图 2 砂生槐多糖对小鼠脾脏 CD4 + CD25 + Treg /淋巴细
胞比值的影响
Fig. 2 Effect of SMP on the ratio of CD4 + CD25 + Treg cells
to spleen lymphocytes in mice
注:* P ＜ 0． 05
图 3 砂生槐多糖对小鼠脾脏 CD4 + CD25 + Treg /CD4 + T细胞比值的影响
Fig. 3 Effect of SMP on the ratio of CD4 + CD25 + Treg cells to spleen CD4 + T cells in mice
注:与正常对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
Note:* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01 vs blank
2． 2 砂生槐多糖对小鼠血清 IL-17 水平的影响
由图 4 可以看出，注射环磷酰胺后建立的模型
组小鼠血清 IL-17 水平较正常组明显升高(P ＜
0. 01) ，然而经过不同浓度砂生槐多糖处理后，IL-17
水平降低(P ＜ 0． 05) ，恢复至正常水平，说明砂生槐
多糖对免疫抑制模型小鼠的 Th17 细胞有抑制作用。
3 讨论与结论
关于藏药砂生槐药用价值的研究较少，近年来
我们实验室从砂生槐子中提取不同成分研究药物活
性，发现亲脂性总生物碱具有抑菌、抗肿瘤和驱杀虫
活性［5］，水提物能够提高环磷酰胺诱导的免疫抑制
小鼠的 B细胞和 T细胞功能［6］，也能促进荷瘤小鼠
的免疫功能，95%乙醇提取物对肿瘤细胞具有细胞
毒活性［7］。有学者从砂生槐地上部分提取黄酮类
化合物，发现其对抗生素的抗耐甲氧西林金黄色葡
萄球菌效应有协同效应［8］。本研究首次从砂生槐
地上枝条部分提取多糖成分，发现其对 Treg 细胞具
有上调作用，同时抑制 IL-17 产生，是潜在的免疫抑
制调节剂。
7451Vol. 28 雒艳萍等:砂生槐多糖提取物对免疫抑制模型小鼠 Treg和 Th17 的影响
图 4 砂生槐多糖对小鼠血清 IL-17 水平的影响
Fig. 4 Effect of SMP on the level of serum IL-17 in mice
注:与模型组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
Note:* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01 vs model control
进入外周免疫器官的初始 CD4 + T 细胞除了分
化为传统的 Th1 和 Th2 细胞外，还可以分化为 Th17
和 Treg细胞。TGF-β和 IL-6 共同作用于初始 CD4 +
T 细胞，通过激活 STAT3，促使其表达转录因子
RORγt而分化为 Th17 细胞，产生 IL-17、IL-22 而参
与炎症与损伤，同时抑制了以 Foxp3 表达为特征的
Treg细胞的分化。而初始 CD4 + T 细胞在 TGF-β 单
独作用下，促使初始 CD4 + T 细胞表达转录因子
Foxp3 而分化为 Treg 细胞，产生 TGF-β、IL-10、IL-35
而发挥免疫抑制功能，维持机体的稳定状态，在避免
自身免疫病的发生方面起了积极的作用［9］。因此，
Th17 和 Treg 在分化的过程中相互抑制。此外，
Th17 细胞不稳定，具有可塑性［10］，可能分化为 Treg
细胞［11］。在正常机体，Treg 细胞和 Th17 细胞相互
拮抗，保持平衡，维持稳定状态。近年来多项研究发
现，Treg细胞降低和 Th17 细胞升高为特征的功能失
衡与人类多种重大疾病，如自身免疫性疾病、过敏性
疾病、移植排斥反应等疾病关系非常密切［12］，逆转
Treg /Th17 失衡是治疗免疫性疾病的有效措施之
一［13，14］。本实验中，在环磷酰胺诱导的免疫抑制小
鼠模型，砂生槐多糖提取物能够促进 Treg 比例升
高，降低 IL-17 水平，从而抑制炎症，有望作为免疫
调节剂用于治疗出现 Treg /Th17 失衡的疾病。
综上，砂生槐多糖可通过上调 Treg 细胞，下调
Th17 细胞而调节免疫功能，推测是一种潜在的免疫
调节剂，但其促进 Treg 细胞产生和下调 Th17 细胞
的机制有待于进一步研究。
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