全 文 ：中国饲料2008年第17期
基金项目:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基本科研
业务费(ywf-qn-3)
*通讯作者
检 测 分 析
刀豆氨酸(canavanine)是一种碱性非蛋白游
离氨基酸,最早由日本科学家在研究哺乳动物肝
脏中尿酸的形成过程中发现的 (Kitagawa和 Ya-
mada,1932、1929)。Bel等(1978)报道,L-刀豆氨
酸普遍存在于豆科的240属,1200种植物中。L-
刀豆氨酸是有效的抗营养代谢成分,并有毒性
(Robert和 Hayashi,1983;Malinaw 等 ,1982;
Rosenthal,1977)。研究并建立刀豆氨酸的定量检
测方法,可明确其抗营养作用的基础,同时对于全
面揭示豆科植物中的抗营养因子具有重要意义。
目前定量测定刀豆氨酸的方法有光电比色法
和高效液相色谱法,但由于比色法灵敏度较差,改
进利用胍类化合物与菲醌形成荧光环体系,但是,
由于精氨酸干扰,此方法不能用于刀豆氨酸的定
量分析(Natelson和Braton,1984)。柱前衍生高效
液相色谱法所采用的衍生剂有邻苯二甲醛
(OPA),9-芴基甲氧羰酰氯(FMOC),异硫氰酸苯
酯的(PITC),丹酰氯(Dansyl-Cl)(Thomas和 D’
Melo,1990;Carlos等1988;vanBalgooy,1987),但
每种方法均存在着一些问题。本实验采用氨基酸
分析仪,初步建立了刀豆氨酸测定的方法,结果表
明该法操作简单、快速、准确、重现性好。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
1.1.1 仪器 日立 L-8900氨基酸自动分析仪
(日本);实验室用样品粉碎机;感量0.0001g分析
天平;超声振荡器;离心机。
1.1.2 试剂 刀豆氨酸标准 (TLC,98%)购于
Sigma公司;水为超纯水(≥ 18MΩ·cm);茚三酮、
磺基水杨酸等试剂均为分析纯。
1.1.3 材料 苜蓿种子。
1.2 测试条件 分析柱:4.6mm×60mm;离子交
换树脂型号:No.2622PH;除氨柱树脂:No.2650;柱
温:57℃;检测器:紫外检测器;检测波长:570nm;
进样量:20μL。
1.3 主要溶液配制
1.3.1 刀豆氨酸标准储备液 称取0.0044g刀豆氨
酸,用 20mmol/LHCl溶解定容至 10mL,此溶液
浓度为2.5μmol/mL。
1.3.2 5%磺基水杨酸溶液 取 5.0g磺基水杨
苜蓿种子中刀豆氨酸含量的测定
中国农业科学院动物营养国家重点实验室 吴莹莹 佟建明* 张 琪 萨仁娜
[摘要]采用氨基酸自动分析仪测定苜蓿种子中刀豆氨酸的含量,探讨了样品预处理方法和仪器分离条件。结果
表明刀豆氨酸在 1～200nmol/mL浓度范围内与峰面积成良好的线性关系,其相关系数为 0.9999,相对标准偏差为
1.32%,平均回收率为100.3%。该方法快速、简便,可用于刀豆氨酸含量的测定。
[关键词]刀豆氨酸;苜蓿种子;游离氨基酸
[中图分类号]S816.17 [文献标识码]A [文章编号]1004-3314(2008)17-0035-03
[Abstract]Theaminoacidanalyzerwasusedtodeterminecanavanineinalfalfaseeds,andthemethodforsample
pretreatmentandinstrumentseparationconditionswerestudiedinthispaper.Theresultsshowedthatthestandardcurve
waslinearwithin1～200nmol/mL.Thecorelationcoeficientwas0.9999.Therelativestandarddeviationofcanavanine
was1.32%andtheaveragerecoverywas100.3%.Thismethodcouldbeappliedtodeterminecanavaninecontentmore
rapidlyandaccurately.
[Keywords]canavanine;alfalfaseeds;freeaminoacid
35
DOI:10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.2008.17.003
中国饲料 2008年第17期
图4 刀豆氨酸标准曲线
图3 样品提取液色谱图
表1 提取刀豆氨酸不同方法的比较
方法 含量/(mg/g) 提取率/%
80%乙醇 4.91 0.49
5%磺基水杨酸 9.82 0.96
0.1mol/LHCl 8.33 0.83
110
90
70
50
30
10
0
100
80
60
40
20
0 2 4 6 81012141618202224262830
图1 空白溶液色谱图
图2 标准溶液色谱图
70
50
30
10
0
80
60
40
20
0 2 4 6 81012141618202224262830
110
90
70
50
30
10
0
100
80
60
40
20
0 2 4 6 8101214161820222426283032
7.00E+06
6.00E+06
5.00E+06
4.00E+06
3.00E+06
2.00E+06
1.00E+06
0.00E+00
0 50 100 150 200 250
峰
面
积
响
应
值
浓度/(nmol/mL)
y=29988x+3903.8
R2=0.9999
酸,定容至100mL。
1.3.3 20mmol/LHCl溶液 取1.67mL浓盐酸,
定容至1L。
1.4 样品的制备 准确称取苜蓿种子150mg(精
确至 0.1mg),置于 50mL离心管中,加入 20mL
5%磺基水杨酸溶液,超声振荡 30min,15000r/
min离心 20min,过滤,重复以上提取步骤,最后
用5%磺基水杨酸定容至50mL,静置30min。取
1mL上述滤液经旋转蒸发仪蒸干,加入 1.0mL
20mmol/LHCl后用 0.45μm滤膜过滤,上机测
定。
2 结果与讨论
2.1 刀豆氨酸提取方法的比较 刀豆氨酸是一
种非蛋白游离氨基酸,故可采用测游离氨基酸的
样品预处理方法-蛋白沉淀法。本实验比较了
80%乙醇、5%磺基水杨酸、0.1mol/LHCl的提取
率,结果见表1。可以看出:5%磺基水杨酸提取的
提取率最高,用5%磺基水杨酸提取刀豆氨酸可
以得到较好结果。
2.2 色谱峰的鉴定 刀豆氨酸空白样品、刀豆氨
酸标准品、刀豆氨酸样品的色谱分析结果见图1
～3,根据对照品洗脱峰的保留时间确定饲料样品
中刀豆氨酸峰,其保留时间为26.20min。
2.3 标准曲线及线性范围 分别吸取刀豆氨酸
标准储备液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.8mL于10mL
容量瓶中,用 20mmol/LHCl定容至 10mL,混
匀 , 配 制 成 0.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、
200.0nmol/mL的刀豆氨酸标准工作液。分别取
20μL进行测定,以浓度为横坐标,以峰面积为纵
坐标,进行线性回归,标准曲线如图4。结果表明:
刀豆氨酸在 1～200nmol/mL时呈良好的线性相
关关系,回归方程为:y=29988x+3903.8,R=0.9999
(n=6)。
2.4 结果计算 样品提取液和刀豆氨酸标准工
作液分别按1.2设定的条件进行分析,根据两种
溶液峰面积响应值计算样品中刀豆氨酸的含量
(mg/g),计算公式如下:
Ci=Cs×Ai×V
As×m
;
式中 Ci指样品中刀豆氨酸的含量,mg/g;Cs
指标准工作液中刀豆氨酸的浓度,mg/mL;Ai指样
品中刀豆氨酸所对应的峰面积响应值;As指标准
工作液中刀豆氨酸所对应的峰面积响应值;V指
响
应
值
/m
V
时间/min
时间/min
时间/min
响
应
值
/m
V
响
应
值
/m
V
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中国饲料2008年第17期
β-葡萄糖苷酶酶活为 47.66U/mL,滤纸酶活为
5.28U/mL。HML0233对天然的纤维素物质滤纸
有分解能力,表明该菌株可以产生纤维素酶。
经形态特征、显微特征观察及5.8SrDNA基
因两侧的内转录间隙 ITS序列分析,建立菌株
HML0233系统进化树,推测该菌株为灰白青霉
(P.canescens)。形态特征、显微特征观察和应用内
转录间隔ITS序列测序分析,可以快速、准确的检
测和鉴定未知真菌菌种的分类地位。
参考文献
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[通讯地址:广西宜州市,邮编:546300]
表2 刀豆氨酸重现性实验 (n=6)
表3 刀豆氨酸回收率试验(n=5)
组分名称
相对标准偏差/%
含量/(mg/g) 含量 保留时间
9.82 26.17 1.32 0.03刀豆氨酸
平均值
保留时间/min
样品编号 加入量/nmol 检测值/nmol 回收率/% 相对标准偏差/%
1 100 98.78 98.8
1.60
2 100 98.55 98.6
3 100 101.85 101.9
4 100 100.25 100.3
5 100 101.90 101.9
样品提取液总体积,mL;m指样品质量,g。
2.5 重现性实验 一个样品平行取6份,分别按
1.4方法进行样品前处理和按 1.2设定条件进行
氨基酸自动分析仪分析,对刀豆氨酸的保留时间
及含量的重现性进行分析,结果见表2。
2.6 稳定性实验 吸取同一供试品溶液,于0、4、
8、12、28h进样测定,以供试品峰面积积分值计
算,RSD=1.79%(n=5),符合测定要求。
2.7 回收率实验 采用加标法测定回收率。分别
取已知含量的苜蓿种子 0.1490g,分别加入 1mL
100nmol/ml刀豆氨酸标准,按 1.4方法进行样品
前处理和按1.2设定条件进行氨基酸自动分析仪
分析。依添加前后分析值的差值与实际添加量的
百分比分别计算刀豆氨酸的回收率,平行测定5
次,结果见表3。结果表明,刀豆氨酸的加样回收
率为98.6%～101.9%,平均回收率为100.3%,
RSD=1.60%(n=5)。
3 结论
本实验定量检测刀豆氨酸,样品提取液的刀
豆氨酸色谱峰峰形优异,且与其他杂质色谱峰之
间达到了良好的分离,保留时间与标准溶液中的
基本一致。样品中刀豆氨酸保留时间和含量的相
对标准偏差分别为 0.03%、1.32%;回收率为
98.6%～101.9%,表明该方法具有较好的精密
度和较高的准确性。
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[通讯地址:北京市海淀区,邮编:100093]
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