全 文 ：中国农学通报 2012,28(24):311-316
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
刀豆氨酸是一种天然的碱性非蛋白质游离氨基
酸，等电点为8.2[1]，极易溶于水。刀豆氨酸是一种存在
于某些豆类中合成的非蛋白质碱性L-α-氨基酸[2]，具有
一定的毒性[3]、抗肿瘤性[4]和抗代谢性[5]，占刀豆干重的
8%，是主要的贮氮化合物。刀豆氨酸和精氨酸的分子
结构非常相似，刀豆氨酸是碱性氨基酸，其制备有化学
合成法和生物提取法，后者简单易得，操作也较简单。
L-刀豆氨酸被认为是一种潜在的生物杀虫剂 [5]，
同时由于其为贮氮化合物，也可作为一种肥料，因此具
有研究价值。刀豆氨酸的提取方法有 PCAF
(pentacyanoamm-onioferrate)与 L-刀豆氨酸的特异反
应[6]、HPLC法[7]、氨基酸自动分析仪法[8]对刀豆氨酸进
行定量测定以及L-刀豆氨酸与2,4-二硝基氟苯在硼砂
缓冲液中的反应[9]这4种测定方法。试剂PCAF Sigma
公司早己停止生产，HPLC法对仪器和操作要求较高，
因此L-刀豆氨酸与2,4-二硝基氟苯在硼砂缓冲液中的
反应是目前方法操作最简单、最快速的一种试验方
法。在弱碱性的环境下，氨基酸的α-氨基很容易与 2,
4-二硝基氟苯作用，生成稳定的黄色 2,4-二硝基苯氨
基酸[10-12]，而L-刀豆氨酸与2,4-二硝基氟苯在硼砂缓冲
液中的反应会产生一种绿色络合物[9]，与其他氨基酸
第一作者简介：王春艳，女，1984年出生，硕士研究生，研究方向：次级代谢产物。通信地址：230036皖合肥市长江西路130号农业大学生化教研室
203室，E-mail：ruoke98@163.com。
通讯作者：文汉，1963年出生，副教授，硕士生导师。通信地址：230036皖合肥市长江西路 130号农业大学生化教研室 203室，E-mail：lifwenl000@
163.com。
收稿日期：2011-11-08，修回日期：2012-02-29。
刀豆氨酸的提取及测定方法的优化
王春艳，王海林，谢长林，文 汉
（安徽农业大学，合肥 230036）
摘 要：研究刀豆氨酸的提取及2,4-二硝基氟苯与刀豆氨酸在pH 9.5硼砂缓冲溶液中反应的最佳条件，
进而优化测定刀豆氨酸的方法。运用分光光度法测定2,4-二硝基氟苯与刀豆氨酸的络合物在571 nm处
的吸光值。结果表明，刀豆氨酸水提取法效果最好，DNFB-乙腈的用量为 30 μL时，刀豆氨酸与DNFB
反应的络合物在571 nm处有最大吸收值。在 30 min内稳定以后该络合物的OD值随着时间的增长而
增加，对应线性回归方程为y=0.0083x-0.052，相关系数R2=0.9986。
关键词：刀豆氨酸；提取；分光光度法
中图分类号：Q946.889 文献标志码：B 论文编号：2011-3253
Optimization of Extraction and Determination of L-canavanine
Wang Chunyan, Wang Hailin, Xie Changlin, Wen Han
(Anhui Agricultural University, Hefei 230036)
Abstract: The extraction of L-canavanine and the best reaction conditions of L-canavanine and 2,
4-dinitrofluorobenzene in pH 9.5 borax buffer were studied in this paper, which could optimize the method of
determination. The OD value of L-canavanine and 2,4-dinitrofluorobenzene’s complex in 571 nm was
determined by spectrophotometry. The results showed that the best extraction method of L-canavanine was
water extraction. When the volume of DNFB-acetonitrile was 30 μL, the complex reaction absorption value of
L-canavanine and DNFB in 571 nm was maximum. The OD value of the complex increased with the extension
of time after stability within 30 minutes. Corresponding linear regression equation was y=0.0083x-0.052;
Correlation coefficient was R2=0.9986.
Key words: L-canavanine; extraction; spectrophotometry
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的颜色反应不同。在国内对从植物组织中提取刀豆氨
酸的报道目前只有陈东芳的《一种新的测定刀豆氨酸
含量的方法》，她发现了L-刀豆氨酸与2,4-二硝基氟苯
在硼砂缓冲液中的这一特殊颜色反应，但是笔者对刀
豆氨酸进行试验的过程中发现在多种氨基酸存在的情
况下灵敏度不高，并且她的文章未对反应中的所有试
剂进行光谱扫描以及该络合物的稳定情况进行测定。
此外对如何从刀豆组织中提取刀豆氨酸国内很少报
道，主要有用50%的乙醇提取[13]，因此笔者试验将对此
方法进行进一步的优化。
1 试剂与方法
1.1 试验时间、地点
研究试验于 2010—2012年在安徽农业大学生化
实验室进行。
1.2 试验仪器、试剂
722S分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；
TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器责
任有限公司）；TGL-16M台式高速冷冻离心机，长沙湘
仪离心仪器有限公司；循环水真空泵，上海亚荣生化仪
器厂；HH-2数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；电子
天平，上海电子天平仪器厂；艾科浦纯化水机，重庆颐
洋企业发展有限公司。
刀豆氨酸（Sigma公司生产），精氨酸、丙氨酸、苯
丙 氨 酸 等 氨 基 酸 为 国 产 试 剂 ，四 硼 酸 钠
(Na2B4O7·10H2O)、硼酸H3BO3、无水乙醇等均为国产分
析纯，乙腈为色谱纯，2,4-二硝基氟苯为上海金山县兴
塔化工厂生产的化工试剂。
1.3 试验方法
1.3.1 氨基酸的生产方法 有水解提取法、化学合成法、
微生物发酵法以及酶合成法等[14]。以下是不同提取溶
剂对刀豆氨酸组织进行提取效果的比较。
（1）水提取。精确称取刀豆愈伤组织研磨，加入1
倍体积的水，使其静置 2 h，10000 r/min离心 2 min，得
上清液，上清液过滤得滤液，离心后的沉淀继续研磨提
取2次，合并3次提取的滤液，将所得滤液进行旋转蒸
发浓缩得提取液。
（2）乙醇提取。称取刀豆愈伤组织，研磨，加入 1
倍体积 50%的乙醇进行提取，静置 1 h，10000 r/min离
心2 min，得上清液，过滤得滤液，将滤液旋转蒸发得浓
缩液，按浓缩液的量加 5体积的无水乙醇，使静置过
夜，弃去上清液，所得沉淀液中加入5倍体积的水使溶
解，将提取液旋转蒸发至有沉淀时即停，得浓缩液[10]。
（3）缓冲液提取。称取刀豆愈伤组织，先加 10倍
体积pH 9.5硼砂缓冲液研磨使其呈均浆状后倒入离心
管中，于4℃条件下10000 r/min离心10 min，上清液经
旋转蒸发浓缩后得刀豆氨酸提取液。
（4）直接提取。取刀豆愈伤组织于研钵中直接研
磨[15]，静置，10000 r/min离心2 min，得上清液。上清液
经旋转蒸发浓缩即得刀豆氨酸提取液。
1.3.2 刀豆氨酸测定方法的优化
（1）吸收曲线。刀豆氨酸在新测定方法下制得的
反应液用紫外可见分光光度计于 200~800 nm之间进
行光谱扫描并绘制出吸光曲线图。在 200~800 nm下
对DNFB-乙腈溶液、刀豆氨酸标准品及刀豆氨酸与
DNFB反应络合物进行光谱扫描。
（2）刀豆氨酸的反应体系。向 10 mL试管中加
pH 9.5硼砂缓冲液 l mL、乙腈 l mL、刀豆氨酸样品液
1 mL、2,4-二硝基氟苯溶液30 μL，摇匀，放在50℃水浴
锅中避光水浴 30 min，流水冷却至室温，用 1 cm玻璃
比色皿在571 nm处测定其吸光度
（3）不同氨基酸与DNFB-乙腈的反应。制备浓度
为 50 μg/mL的刀豆氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、
鸟氨酸、精氨酸、丙氨酸、缬氨酸溶液各 10 mL。从以
上溶液中各取 1 mL 混合均匀得含刀豆氨酸
6.25 μg/mL的混合氨基酸溶液。将以上得到的9种溶
液分别与 10 μL DNFB-乙腈反应，在 571 nm下测刀豆
氨酸与DNFB反应后的络合物的吸光度值。
（4）DNFB试剂用量的影响。取 10mL试管 7只，
向其中 6只分别加入DNFB溶液，分别为 10.0、30.0 、
50.0、70.0、90.0、110.0 μL，再加 pH 9.5硼砂缓冲液
l mL、乙腈 l mL、1.3.2（3）中制备的混合液液 1 mL，在
571 nm下测定刀豆氨酸与DNFB反应后的络合物的
吸光度值。
（5）刀豆氨酸与DNFB-乙腈的反应生成的络合物
的稳定情况。制备 100 μg/mL的刀豆氨酸标准品，在
10 mL试管中加pH 9.5硼砂缓冲液 l mL、乙腈 l mL、刀
豆氨酸样品液1 mL，2,4-二硝基氟苯溶液10 μL，摇匀，
放在 50℃水浴锅中避光水浴 30 min，流水冷却至室
温。在571 nm下每5 min测OD值。
2 结果与分析
2.1 刀豆氨酸的提取分离
图1所示为水提取、直接提取、缓冲液提取和乙醇
提取等不同提取溶剂对20 g固体刀豆组织提取刀豆氨
酸效果的比较。从扫描图的结果表明，水的吸光度值
最大，其次是乙醇提取，再者是直接提取和缓冲液提
取。
2.2 刀豆氨酸的测定及优化
2.2.1 吸收曲线 用紫外可见分光光度计于 200~
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王春艳等：刀豆氨酸的提取及测定方法的优化
800 nm之间分别对刀豆氨酸标准品、DNFB-乙腈、刀
豆氨酸与DNFB在pH 9.5硼砂缓冲液中反应后的络合
物进行光谱扫描，并绘制光谱吸收曲线。DNFB-乙腈
试剂的扫描如图 2所示，其吸收峰在 200~390 nm之
间，刀豆氨酸扫描结果如图3所示，其吸收峰在210 nm
处，吸收范围在 200~300 nm。刀豆氨酸与 DNFB在
pH 9.5硼砂缓冲液中作用后扫描结果如图 4所示，其
在 470 nm及 571 nm处形成 2个吸收峰，其中 470 nm
处的吸收峰不稳定，571 nm处的吸收峰较稳定。故可
确定刀豆氨酸在新的反应条件下的吸收峰在 571 nm
处。
2.2.2 不同氨基酸与DNFB-乙腈的反应 试验扫描结
果如图5所示，在571 nm处吸光度值最大的是刀豆氨
酸，次之是含有刀豆氨酸的混合氨基酸，其余的氨基酸
在 571 nm处相对于刀豆氨酸来说几乎是没有吸光度
值。试验结果表明，只有刀豆氨酸与DNFB-乙腈反应
的络合物在 571 nm处有吸收值。在有其他氨基酸存
在的情况下，2,4-二硝基氟苯会先于其他氨基酸结合
反应，因此在2,4-二硝基氟苯量少的情况下，在571 nm
处没有吸收峰。2,4-二硝基氟苯量只有大于一定的数
值才有吸收值。
2.2.3 试剂用量的影响 图6结果表明在571 nm处，刀
A水提取，B乙醇提取，C缓冲液提取，D直接提取
图1 不同提取溶剂提取效果的比较
图2 DNFB-乙腈的吸收曲线
波长/nm
A
BD
C
波长/nm
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豆氨酸与 10.0、30.0、50.0、70.0、90.0 μL的DNFB-乙腈
反应，其吸光值不同，吸光度值最大为30 μL时。这说
明在其他最适反应条件一定时，DNFB-乙腈的最大用
量是30 μL。试验结果也表明，刀豆氨酸与DNFB反应
的络合物在 571 nm处有吸收峰。因此可确定刀豆氨
酸与DNFB反应的络合物应在571 nm处测其吸收值。
2.2.4 刀豆氨酸与DNFB-乙腈的反应生成的络合物的
稳定情况 由图 4刀豆氨酸络合物的吸收曲线可知在
200~800 nm处有 2个吸收峰试验结果表明，在 30 min
内571 nm下的络合物稳定的随着时间的增长OD值增
加（图7），480 nm下的络合物一直随着时间的增长OD
值不断增加（图8）。
3 结论
3.1 刀豆氨酸的提取方法
试验结果表明，刀豆氨酸在水提取情况下效果较
好。
3.2 刀豆氨酸的测定方法
通过试验研究发现，刀豆氨酸与DNFB反应的络
合物在 571 nm处有稳定的吸收峰；多种氨基酸与
DNFB-乙腈的反应液在200~800 nm间扫描结果表明，
只有刀豆氨酸在571 nm下有吸收峰，其他氨基酸都没
有吸收值。由混合氨基酸的扫描曲线得出，在其他氨
基酸存在的情况下，DNFB-乙腈先于其他的氨基酸进
行反应，并在480 nm处有一吸收峰，而在571 nm处没
图3 刀豆氨酸标准品的吸收曲线
1代表571 nm吸收峰，2代表480 nm处的吸收峰
图4 刀豆氨酸络合物的吸收曲线
波长/nm
波长/nm
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王春艳等：刀豆氨酸的提取及测定方法的优化
有吸收峰。不同DNFB-乙腈的含量对 571 nm处得吸
收值有影响，得出DNFB-乙腈的最适用量为 30 μL。
刀豆氨酸与DNFB-乙腈反应生成的络合物在 30 min
内是稳定的，随着时间的增长在 571 nm处OD值也在
不断增加。
4 讨论
在国内对从植物组织中提取刀豆氨酸的报道目前
只有陈东芳的《一种新的测定刀豆氨酸含量的方法》，
她发现了L-刀豆氨酸与2,4-二硝基氟苯在硼砂缓冲液
中的这一特殊颜色反应，但是笔者对刀豆氨酸进行实
图5 不同氨基酸与DNFB-乙腈的反应
DNFB的量由上往下分别为30、50、10、70、90 μL
图6 不同量的DNFB吸收值的比较
波长/nm
波长/nm
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验的过程中发现，在多种氨基酸存在的情况下灵敏度
不高，因此经过试验分析将 DNFB-乙腈的含量由
10 mL变为 30 mL，提升了约 0.2个OD值。通过对反
应中所有试剂进行光谱扫描，可以很清楚的知道各物
质在 200~800 nm处的光谱曲线。对该络合物的稳定
情况进行测定，很好地优化了刀豆氨酸的测定情况。
此外对如何从刀豆组织中提取刀豆氨酸国内很少报
道，主要有用50%的乙醇提取[10]，利用刀豆氨酸极易溶
于水的这一原理，通过用水、缓冲液、乙醇、直接榨汁等
试验得出，用水提取刀豆氨酸时数之最大。目前还没
有发现只能与刀豆氨酸进行特异性反应的化学试剂，
如果发现了就可以排除其他氨基酸对试验的干扰性。
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0.740.76
0.780.80
0.820.84
0.860.88
0.900.92
5 10 15 20 25 30 35 40
时间/min
刀
豆
氨
酸
的
OD值
图7 571 nm下络合物的稳定情况 图8 480 nm下络合物的稳定情况
0.63
0.64
0.65
0.66
0.67
0.68
0.69
0.70
5 10 15 20 25 30 35 40
时间/min
刀
豆
氨
酸
的
OD值
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