全 文 ：中国药物与临床2007年9月第7卷第9期ChineseRemedies&Clinics,September2007,Vol7,No.9
蒙古黄芪 [Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge.
var.mongholicus(Bge.)Hsiao]为山西省道地药材,主
产地在浑源县。黄芪具有补气固表、利尿脱毒、排脓、
敛疮生肌等功效[1],其主要有效成分为黄酮类、皂苷
类、多糖类。黄酮类成分具有清除氧自由基,抑制脂
质过氧化和维持血中一氧化氮浓度,保护缺血再灌
注损伤的作用[2]。马晓丰等[3]从黄芪中分离得到芒柄
花素、毛蕊异黄酮等9个黄酮类化合物。目前,黄芪
中黄酮类成分的含量测定方法主要有分光光度法[4]、
薄层扫描法[5]和高效液相色谱法[6]等。黄酮类成分能
产生较好的紫外吸收,使用高效液相色谱法进行含
量测定,具有灵敏度好、杂质干扰少等优点。本文建
立了采用高效液相-紫外检测法测定芒柄花素含量
的方法,并以芒柄花素的含量为指标,采用正交设计
实验对影响超声提取的因素如乙醇浓度、乙醇用量、
提取次数和提取时间进行考察,优化黄芪黄酮类成
分的提取工艺。
1 仪器和试剂
1.1 仪器:LC—10A高效液相色谱仪 (日本岛津);
SPD—10A紫外检测器 (日本岛津);N—2000色谱
数据工作站 (浙江大学智能信息工程有限公司);
RE—52AA旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂);超
蒙古黄芪中芒柄花素含量的测定
及黄酮类成分提取工艺的优化
张海红 张丽锋 曹 龙 申薇薇 张淑秋
【摘 要】 目的 建立芒柄花素的含量测定方法,优选黄芪中黄酮类成分的提取工艺。方法 采用高效液
相色谱-紫外检测法,建立芒柄花素的含量测定方法,以芒柄花素含量为指标,用正交设计法对影响超声提取的
因素如乙醇浓度、乙醇用量、提取次数和超声时间进行考察,优化提取工艺。结果 芒柄花素在 1～40μg/ml范围
内线性关系良好,以峰面积(A)对浓度(C)进行线性回归,方程为A=212096C+3958.7,r2=0.9999。日内、日间相对标
准差(RSD)均<5%;平均回收率均在 98.0%~102.0%;优化提取条件为加 15倍量 75%乙醇,连续提取 3次,每次
20min。结论 所建立的含量测定方法可用于蒙古黄芪中芒柄花素的含量测定,优化的提取工艺具有效率高和操
作简便等优点。
【关键词】 黄芪;色谱法,高压液相;含量测定;黄酮;芒柄花素;提取
Determinationofformononetinandoptimizationoftheextractionconditionsforflavonoidconstituentsofas-
tragalusmembranaceusvar.mongholicus ZHANGHai-hong,ZHANGLi-feng,CAOLong,SHENWei-wei,
ZHANGShu-qiu.DepartmentofClinicalPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China
【Abstract】Objective Toestablishthedeterminationmethodofformononetinbyhighperformanceliquidchro-
matographyandultraviolet(HPLC-UV)detection,andtooptimizetheextractionconditionsforflavonoidsofAstragalus
membranaceusvar.mongholicus.Methods FormononetininAstragalusmembranaceusvar.mongholicuwasdetermined
byHPLC-UVdetection.Factorsassociatedwithultrasonicextractionofflavonoids,includingconcentrationandamount
ofethanolused,timesofextractionandultrasonicduration,wereinvestigatedusingorthogonaldesigntablewithfor-
mononetinasatargetindex.Theoptimizedextractionmethodwasdeterminedbasedontheexperimentresults.Results
Formononetinconcentrationshowedgoodlinearitywithinarangeof1~40μg/ml.Alinearregressionequationwasfor-
mulatedasA=212096C+3958.7(r2=0.9999),whereAdenotesthepeakareaandCtheconcentration.Theintra-and
inter-dayRSDsofprecisionwerelessthan5%.Themeanrecoverywas98.0%~102.0%.Optimizedextractioncondi-
tionswerefoundtobeadding15partsof75%ethanolto1partofmaterialforthreeconsecutiveextractions,20min-
uteseachtime.Conclusion TheHPLCmethodestablishedinthepresentstudycanbeusedtodeterminethecon-
tentsofformononetininAstragalusmembranaceusvar.mongholicus.Theoptimizedextractionmethodshowedpromise
withhigherextractioneficiencyandsimpleprocessing.
【Keywords】 Astragalusmembranaceus; Chromatography,highressureliquid; Determination; Flavonoid;
Formononetin;Extraction
基金项目:山西省自然科学基金资助项目(2007011088)
作者单位:030001太原,山西医科大学药学院临床药学教研室(第
一作者现在河北北方学院药理教研室)
通讯作者:张淑秋,Email:shuqiu.zhang@sxmu.edu.cn
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中国药物与临床2007年9月第7卷第9期ChineseRemedies&Clinics,September2007,Vol7,No.9
表 3 方差分析
方差来源 离差平方和(SS) 自由度(f) 均方(MS) F值
A 28.51 2 14.26 12.84
B 2.74 2 1.37 1.23
C 2.22 2 1.11 1.00
D 55.33 2 27.67 24.92a
注:F0.05(2,2)=19.00,aP<0.05
表2 正交实验L9(34)
实验号 A B C D
芒柄花素含量
(mg/g)%
1 1 1 1 1 8.25
2 1 2 2 2 17.02
3 1 3 3 3 18.90
4 2 1 2 3 23.12
5 2 2 3 1 12.90
6 2 3 1 2 20.92
7 3 1 3 2 9.73
8 3 2 1 3 17.49
9 3 3 2 1 7.14
K1 14.72 13.70 15.55 9.43
K2 18.98 15.80 15.76 15.89
K3 11.45 15.65 13.84 19.85
R 7.53 2.10 1.92 10.42
声波清洗器(北京医疗设备二厂)。
1.2 试剂:芒柄花素对照品(中国药品生物制品检
定所,批号 200501);蒙古黄芪(山西省药材公司);
甲醇(山东禹王实业有限公司,色谱纯)。
2 方法和结果
2.1 色谱条件和系统适用性实验:色谱柱:Diamon-
silC18液相色谱柱(250mm×4.6mm,5μm,北京迪
科马科技有限公司);流动相:甲醇∶水(75∶25,V/V);
流速 0.6ml/min;检测波:254nm;柱温:25℃;进样
量:20μl。
系统适用性实验:色谱柱理论塔板数按芒柄花
素计算不少于 4000,拖尾因子为 1.05,表明对称性
良好,保留时间为11.8min。(见图1)。
重复性实验:配制浓度为23.2μg/ml的芒柄花
素溶液,在上述色谱条件下重复进样5次,记录峰面
积,结果相对标准差(RSD)<2%,表明重复性良好。
2.2 线性相关性实验:精密称定芒柄花素对照品 5
mg,至 50ml容量瓶中,用 60%乙醇定容。精密量
取 0.1、0.5、1.0、2.0、4.0ml置 10ml容量瓶中,用
60%乙醇定容,取20μl进样测定。以峰面积(A)为
纵坐标,浓度(C)为横坐标,得出回归方程为 A=212
096C+3958.7,r2=0.9999,芒柄花素在1～40μg/ml范
围内线性关系良好。见图2。
2.3 精密度实验:精密称取芒柄花素对照品适量,
配成高(34.8μg/ml),中(11.6μg/ml),低(5.8μg/ml)
浓度的溶液,分别在1d内测定5次,得日内精密
度,3种浓度的溶液每天测定 1次,连续测定 3d得
日间精密度。结果:日内、日间RSD均<5%,表明方
法精密度良好。
2.4 回收率实验:取已知芒柄花素含量的样品 5
份,分别加入一定量的芒柄花素对照品,按上述色谱
条件测定,记录A,经计算得平均回收率。结果:回收
率98.0%~102.0%,表明方法准确。
2.5 提取工艺的确定:黄芪药材粉碎成粗粉,过 16
目筛,取9份黄芪粗粉,每份约3g,精密称定,置
100ml具塞三角瓶中,按正交实验设计要求加入一
定量的乙醇,超声波提取一定时间和次数,减压抽
滤,提取液经浓缩转移至 100ml容量瓶中,用 60%
的乙醇定容,经0.45μm微孔滤膜过滤,取20μl进
样测定,记录A,计算得每g原药材中含有芒柄花素
(mg)的百分数。见表1~3。
表1 考察因素及水平
水平
因素
乙醇浓度(A)
%
乙醇用量(B)
倍
提取时间(C)
min
提取次数(D)
次
1 55 10 10 3
2 75 15 20 2
3 95 20 30 1
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中国药物与临床2007年9月第7卷第9期ChineseRemedies&Clinics,September2007,Vol7,No.9
从表2,3看出,对黄芪中芒柄花素提取的影响
程度依次为D>A>B>C,即影响最显著的因素为提取
次数,其次为乙醇浓度,而提取时间和用量影响不显
著。最佳提取工艺为A2B2C2D3,即用15倍量75%乙
醇,提取 3次,每次 20min为黄酮类成分的最佳提
取工艺。
2.6 最佳提取工艺的验证:取同一批药材按优化的
工艺提取,每批100g,提取3批,与最佳工艺相比得
平均相对提取率为98.70%,RSD为2.5%。说明该工
艺稳定可行,重现性好,适宜大量提取。
3 讨 论
从 K值可知,超声提取次数越多,黄酮的累计
提取率就越高,因此做了提取次数的确定实验,结果
发现,第 4次的提取率只有 0.2%,无限增加提取次
数已没有意义,因此确定3次为最佳提取次数。本实
验也对回流提取法和超声提取法作了比较,结果表
明超声提取效率高于回流提取。
实验结果表明,本实验方法工艺简单,利用本文
所提供的超声波提取而得到的芒柄花素含量较高,
是一种较理想的提取黄酮类物质的方法。
参 考 文 献
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2005版.二部.北京:化
学工业出版社,2005.
2 刘晋华,陈静然,尤光甫.黄芪对心肌保护作用的药理学研究进
展.中成药,2002,24(8):623-625.
3 马晓丰,田晓明,陈英杰,等.蒙古黄芪中黄酮类成分的研究.中
成药,2005,36(9):1293-1296.
4 王智华,胡培莉,王海涛,等.几种黄芪属植物中生物活性成分
的比较研究:Ⅱ.黄芪总黄酮的含量测定.药物分析杂志,1995,
15增刊:311-312.
5 田振坤,马英丽,孟锐,等.双波长薄层扫描法测定黄芪茎叶中
黄酮甙的含量.沈阳药学院学报,1993,10(1):24-26.
6 胡芳弟,封士兰,赵健雄,等.HPLC法测定黄芪中黄酮类成分和
黄芪甲苷的含量.分析测试技术与仪器,2003,9(3):173-177.
(收稿日期:2007-06-28)
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