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相思子毒素研究进展



全 文 :动物医学进展 ,2006 ,27(9):50-54
Progress in Veterinary Medicine
相思子毒素研究进展
马惠海1 ,罗胜军2 ,王 哲2 ,高英杰2 ,李小兵2 ,刘国文2 ,谢光洪2
(1.吉林省农业科学院 ,吉林公主岭 136100;2.吉林大学畜牧兽医学院 , 吉林长春 130062)
中图分类号:S859.87 文献标识码:A 文章编号:1007-5038(2006)09-0050-05
摘 要:相思子毒素类似于蓖麻毒素 ,是一种
植物蛋白毒素 ,具有极强的细胞毒性作用 ,特
别是对某些恶性肿瘤细胞的毒性更强 ,这使
它成为用于杀伤肿瘤细胞的候选毒素之一。
文章就其毒性 、结构 、毒理 、基因克隆以及应
用方面做了简要的综述。
关键词:相思子毒素;基因克隆;植物毒素
相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思
(Abrus precatorius)种子中的一种毒蛋白 ,与蓖麻
毒素(ricin)同为 Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIP)家族成
员 ,是迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一 ,
毒性是普通化学武器的几百倍 。从第一次世界大战
起 ,经美 、英 、加 、法等国的研究 ,蓖麻毒素已经成为
一个成功的天然毒素战剂 ,并在 1978 年著名的“马
尔科夫毒伞案”中得到了验证[ 1] 。相思子毒素的毒
性作用机制与蓖麻毒素相似 ,但其毒性却是蓖麻毒
素的 75 倍 。相思子种子中所含相思子毒素与蓖麻
毒素相似 ,有强烈的细胞毒性和抗肿瘤作用。对多
种动物实验肿瘤有抑制作用 ,能显著减轻瘤重 ,延长
生存期 ,作用较蓖麻毒素和白喉毒素更强。小剂量
的相思子毒素与环磷酰胺合用 ,有显著协同抗癌作
用 ,但毒性并不增加 。有专利报告将相思子毒素制
成免疫佐剂 ,给小鼠注射可使其 Meth-A 肿瘤生长
率降低 90%[ 2] 。由于相思子毒素天然资源比较丰
富 ,制备比较容易 ,并且借助当今高度发达的生物工
程技术手段 ,还能够实现大批量生产。相思子毒素
中毒后无特异症状 ,出现症状时已经造成机体严重
的器质损害 ,给中毒的治疗及预防带来极大的难度 ,
具备生物毒素武器典型特征 ,因此历来为外军所高
度重视。禁止生物化学武器公约把相思子毒素列为
最为严格的控制对象之一 ,在 2001 年世界生物及毒
素武器大会(BTWC)上 ,相思子毒素再次被列入重
点核查清单 ,本身就反映了人们对相思子毒素军事
价值的关注[ 3] 。因此 ,无论是从核查 、应用治疗 ,还
是从防护目的 ,开展对相思子毒素的研究具有十分
重要的意义。
   收稿日期:2006-05-25   作者简介:马惠海(1976-), 男 ,吉林延边人 , 副研究员 ,硕士研究生 , 主要从事动物遗传育种及中毒病研究。
Application of Copper Amino Acid Chelate in Animal Production
YANG Po1 , 2 ,WANG Xuan-nian1 , 2 , LI Jing-xi1 , 2
(1.Col lege o f Anima l S ciences , H enan Ins ti tu te o f Science and Technolog y , X in xiang , Henan , 453003 , China;
2.Col leg e o f An imal S ciences , H enan A gr icul tural Univer si ty , Zheng zhou , H enan , 450002 , China)
Abstract:Copper amino acid chelate is a new type of o rganic copper addi tive.Compared w ith inorg anic cop-
per salt s like cupric sulfate , the chelate has many advantages.Itcan reduce the contests be tw een copper
and o ther nutrients , and promo te the ingestion and digestion of copper and other mineral elements.I t can
also reduce the po llution of copper to envi ronment and the dest ruct ion of o ther components in feed.Howev-
er , it s bio availabi li ty varies significant ly.Copper amino acid chelate can speed up the g row th in animal pro-
duction , increase feed utilizat ion , improve body quali ty and reproduction.It can also resist bio-oxidat ion ,
adjust incretion and immunity .Moreover , the dig estion , absorption and metabolize mechanism , phy siologi-
cal function , additiv e usage and production techniques of copper amino acid chelate should be studied in the
future , in orde r to improve its ut ilization and get opt imal prof it s.
Key words:copper am ino acid chelate;bioavai lability ;animal production
DOI :10.16437/j.cnki.1007-5038.2006.09.013
1 相思子毒素的毒性及性质
1.1 相思子毒素的毒性
相思子毒素是从豆科藤本植物相思子(Abrus
precatorius)的种子中提取的一种剧毒性高分子蛋
白毒素 ,其含量约占种子 2.8%~ 3.0%。相思子毒
素存在 4种同族毒素(isoabrins),即 abrin-a 、abrin-
b 、abrin-c、和 abrin-d ,相对分子质量介于 63 ku ~
67 ku之间 ,它们由不同的基因所编码 ,但同属于一
个多基因家族;其中 abrin-b 、abrin-c 由于其 B 链凝
集活性低而只有较弱的细胞毒性作用;而 abrin-a 、
abrin-d 则有极强的细胞毒性 , 小鼠的 LD 50 为
0.04 μg/kg ,成年人摄入的致死剂量为5.0 μg/kg ~
7.0 μg/kg , 其毒性强度是蓖麻毒素(小鼠 LD50
3.0 μg/kg)的 70多倍 ,已被列为潜在的重要毒素战
剂和生物恐怖病原物质之一。
相思子毒素中毒后 ,通常要经数小时至数天的
潜伏期才出现综合征 。可表现为口腔灼烧感 、吞咽
困难 、恶心 、呕吐 、血痢 、腹部痉挛性疼痛 、昏睡 、定向
障碍 、惊厥 、黏膜发绀 、昏迷 、循环衰竭 、视网膜出血 、
血尿和少尿等症状。经静脉注射或皮下给药 ,临床
症状与经消化道给药相似 ,但胃肠道症状较轻 ,而注
射部位通常会发生严重的炎症[ 3] 。
1.2  相思子毒素的物理性质
纯化后的相思子毒素为微黄白色无定形粉末 ,
无味 ,易溶于水 、氯化钠和甘油溶液 ,不耐热。60 ℃
经30 min部分失活 , 80 ℃经30 min则大部分失活 ,
100 ℃经 30 min 毒性及抗肿瘤活性完全消失 。印
度安达曼岛上居民将相思子种子煮熟后作为食物食
用。完整的相思子毒素经反复冰冻和融化对其毒性
影响很小。在 0.1 mol/L 半乳糖溶液中 ,毒素可在
冰箱中储存数月而不会失活。分离开的链要比完整
毒素更不稳定[ 4] 。
2 相思子毒素的结构
2.1 相思子毒素的一级结构
相思子毒素是一种分子质量约为 63 ku ~ 67 ku
的糖蛋白 ,分子由 A 、B两条多肽链通过 1 个二硫
键连接而成。完整毒素在 SDS- PAGE 分析时呈一
条蛋白带 ,经二巯基乙醇处理后 , A 、B两条链分离
开 ,其中 A 链呈酸性 ,分子质量约为 30 ku ,与蓖麻
毒素 A 链存在 102个相同的氨基酸残基;B链呈中
性 ,分子质量约 35 ku 。有关试验表明 ,相思子毒素
两条链经二巯基乙醇还原分离开后 ,其活性并不丧
失 。
与蓖麻毒素相似 ,相思子毒素也是以前体蛋白
形式表达 ,编码前体相思子毒素的基因组不含内含
子 ,从5′端到3′端分别编码由 34个氨基酸残基组成
的前导序列 ,250个或 251 个氨基酸残基组成的 A
链 ,10个氨基酸残基组成的连接肽 ,267个或 268个
氨基酸残基组成的 B链[ 4] 。34个氨基酸残基组成
的前导序列很可能包含一个信号肽 ,诱导前体进入
内质网 ,进行翻译后加工 ,然后再转运到种子蛋白储
存部位 ,推测信号序列的切点位于第 19位的 Se r羧
基端。
相思子毒素所含的糖基主要存在于 B链上 ,糖
的类型为甘露糖和 N-乙酰葡萄糖胺 ,毒素经糖基修
饰后 ,可以增加其自身结构的稳定性 ,防止降解 ,增
强对极端条件的适应性[ 5] 。目前已阐明了 Abrin-a
的 B链的 2个糖基化位点附近的氨基酸序列及糖
链结构 , 糖肽附近的氨基酸顺序为 Asp-Asn
(CHO)-Gly-Thr ,Gly-Asn(CHO)-Asn ,其序列分
别类似于 Ricin-D 的 B 链 A sp94-Asn(CHO)-Gly-
Thr97 , Thr134 – Asn(CHO)-A sn136。
2.2 相思子毒素的高级结构
晶体结构研究表明 ,相思子毒素 A 链分为 3个
折叠区域。 abrin-a的 A 链 C 末端比蓖麻毒素少 4
个氨基酸残基。关于 abrin-a及蓖麻毒素的 A 链折
叠上的差异都有可能影响对核糖体的识别和结合。
相思子毒素 a的 B链的整个折叠方式与蓖麻毒素相
似 ,但它们的 N 末端氨基酸残基第 1位 ~ 12位及几
个突环(第 39 ~ 45 , 100 ~ 106 , 109 ~ 118 , 133 ~ 139 ,
166 ~ 170 , 193 ~ 204 位氨基酸残基)有较大差异。
Abrin-a的 B链由 2个区域组成 ,每个区域又包含 4
个亚区λ,α, β , γ,每一区域的主体结构是由 α, β , γ
组成 ,亚区 2λ连接 B链的 2 个区域 ,亚区 1λ参与
A ,B链之间二硫键的形成 ,2个λ亚区间有同源性 ,
但与其他亚区有区别 , 2个亚区的α,β ,γ间均有同
源性[ 4] 。除了 1λ亚区 , abrin-a 的 B 链的其他亚区
的氨基酸链长度与蓖麻毒素的相应亚区相同。
abrin-a的 1λ亚区 N末端比蓖麻毒素的1λ亚区多4
个氨基酸残基。Abrin-a 的 B 链的每一个区域均包
含一个疏水核 ,形状类似于蓖麻毒素的疏水核。早
先有人提出了蓖麻毒素的 B链的进化理论 ,认为 B
链的祖先是 1α亚区 ,因为仅是 1α肽链保留了所有
的关键结构和功能特征 ,基因复制和融合产生了α,
β ,γ分子 ,然后加上λ肽链进一步稳定了分子结构 ,
51马惠海等:相思子毒素研究进展
再复制产生(α、β 、γ、λ)2 结构[ 5-6] 。在 abrin-a 的 B
链晶体结构研究中也表明其极符合于蓖麻毒素的 B
链的进化方式。
3 相思子毒素的作用机理
在相思子毒素的 A 、B链中 , B链是一种对半乳
糖具有特殊亲和力的凝集素 ,可以与细胞表面含半
乳糖残基的受体结合 。进入细胞后 , A 链具有 N 糖
苷酶活性 ,可以专一水解核糖体 28S 第 4 324 位腺
苷酸的 N-C 糖苷键而使核糖体失活 ,进而影响蛋白
质的合成[ 6] 。相思子毒素的吸收途径类似蓖麻毒
素 ,即通过 B连接在细胞表面含有半乳糖末端的糖
蛋白和脂蛋白上进入细胞 ,每个细胞可以结合近
100个相思子毒素分子 。
相思子毒素对真核细胞的作用包括:①B 链结
合于细胞膜上的受体;②完整相思子毒素或片段跨
膜转运进入胞质;③通过 A 链催化失活核糖体 ,抑
制蛋白质的合成。无论通过何种途径入胞 ,相思子
毒素进入细胞内可能定位于由单位膜形成的小泡和
管状结构内。毒素内化后具有逆行转运的特点 ,即
通过膜泡将毒素运输到高尔基堆 ,形成分泌囊泡进
一步转运到内质网 ,其中有极少量的毒素到达胞质 。
A链被运至核糖体后 ,发挥其 N 糖苷酶的作用 ,可
催化真核细胞核糖体 60 S 大亚基的 28 S rRNA 的
第 4 324位脱腺嘌呤 ,使之不与延长因子-2结合 ,从
而抑制蛋白质合成过程中多肽链的移位 ,最终因蛋
白质合成障碍导致细胞死亡[ 7-8] 。相思子毒素对细
菌核糖体无效 ,植物细胞的核糖体比动物细胞的核
糖体对相思子毒素的敏感性弱 。
4 相思子毒素的基因克隆
20世纪 90 年代以来 ,国外先后报道有关相思
子毒素基因克隆方面的研究。Narayanan S 等[ 9] 根
据 abrin-a 的 A 链氨基酸序列设计引物 ,以基因组
DNA 为模板进行 PCR扩增 ,得到 2个不同的 A 链
基因的克隆pGA7.3和 Pga7.2 ,两个克隆的 A链基
因都含有 753 个碱基 ,碱基有 68 处不同 ,编码的氨
基酸有 38处不同 ,但在体外无细胞系统测定重组 A
链活性的试验中 ,两种 A 链表达产物都能抑制麦胚
提取物中蛋白质的合成。虽然当时还不清楚
pGA7.3和 Pga7.2 是什么关系 ,但通过这一试验证
明 ,相思子毒素基因同蓖麻毒素基因一样 ,不含有内
含子 。几乎同时 ,Go to L S 等[ 10] 根据对 abrin-c 型
N端和内部氨基酸序列的分析结果设计引物 ,也以
基因组 DNA 为模板进行 PCR扩增得到 570 bp 片
段 ,以(α- 32p)dCTP 标记该片段作为探针从基因组
DNA 文库中钓取到相思子毒素前体(preproabrin)
基因 ,通过对相思子毒素前体基因及基因表达产物
相思子毒素前体蛋白的分析表明 ,相思子毒素前体
蛋白和已报道的 abrin-c型蛋白的氨基酸同源性为
83%;并且 ,同蓖麻毒素前体蛋白一样 ,前体相思子
毒素蛋白也由 4部分组成 ,即 34个氨基酸的前导信
号序列 、251个氨基酸的 A 链 、263个氨基酸的 B链
以及连接 A 、B链的 14个氨基酸的连接肽。在信号
肽的上游存在两个启动子以及一个血凝素共有序列
5′-CA TCAG-3′,在基因的下游还有两个 polyA 的
转录终止信号。他们还在 E.coli 中表达了 A 链基
因 ,而且当把纯化的 A链蛋白加到兔网织红细胞裂
解液中 , 在电泳图片上可以明显地观察到 28S
rRNA被脱去腺嘌呤而释放一段大小为 400 pb 左
右的片段。 Hung V 等[ 11] 从相思子幼苗中提取
mRNA ,利用 RT-PCR技术 ,克隆了 3 种不同的相
思子毒素基因 Pcndaac-1 、Pcdnaac-5 、Pcdnabc-8。
通过核苷酸序列分析 ,他们得出结论 ,Pcndaac-1属
于 abrin-a , Pcdnabc-8属于 abrin-d ,Pcdnaac-5属于
abrin-b。Hung V等克隆了 abrin-a的 A 链基因 ,并
在 E.col i 得到表达;体外活性试验结果表明 , A 链
表达产物可抑制蛋白质的合成。Silva A L 等[ 3] 将
A 链基因片段插入 Pgex-5X 中 , 在 E.col i 得到表
达 ,得到一种异源二聚体蛋白 ,分子质量约为60 ku ,
经动物实验表明 ,该蛋白的活性与天然的毒素蛋白
相近。
5 相思子毒素的应用
5.1 相思子毒素在医学临床上的应用
早在20世纪70年代就发现了核糖体失活蛋白
(RIP)有抗肿瘤活性 , Lin J等[ 12] 接种 Ehrlich腹水
癌细胞后 ,注射相思子毒素 ,由小鼠体重变化及观察
癌细胞总数 ,证实单一剂量的(0.02 mg/kg)的相思
子毒素可以完全抑制腹水癌的生长 。Lin J等[ 12] 用
相思子毒素处理肿瘤细胞 ,可有效抑制其在裸鼠体
内的转移。目前 , Ⅱ型核糖体失活蛋白如相思子毒
素 、蓖麻毒素和槲寄生毒素(viscotoxin)等一直被用
来制备抗肿瘤的弹头毒素。研究表明 ,相思子毒素
对人的白血病 、黑色素瘤细胞 、Lew is肺癌淋巴瘤细
胞以及小鼠的艾氏腹水瘤细胞等的杀伤作用明显高
于蓖麻毒素 。特别是与蓖麻毒素构成的免疫毒素相
比 ,用相思子毒素构建的免疫毒素具有更长的血清
半衰期和更强的抗肿瘤活性[ 13] 。因此 ,以相思子毒
52 动物医学进展 2006 年 第 27 卷 第 9 期(总第 155期)
素构成的免疫毒素备受重视。尽管由全毒素分子构
成的免疫毒素对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用 ,但由
于 B链糖结合部位的存在 ,导致了免疫毒素非特异
杀伤正常细胞 ,限制了临床应用。目前 ,普遍采用相
思子毒素的 A 链和导向分子如特异性抗体相连来
构建免疫毒素 ,虽然由于没有 B 链的帮助而导致免
疫毒素的毒性降低 ,但替代 B 链的导向分子提高了
免疫毒素的特异性杀伤作用 ,改善了在体内应用的
安全性。国外已有文献报道用相思子毒素 A 链作
为免疫毒素的应用研究 ,Waw rzynezak I B等[ 14] 用
交联剂 SPDB将针对人类小细胞肺癌(SCLC)表面
抗原的 mAb(SWA11)和相思子毒素的 A 链偶联而
成的免疫毒素对裸鼠体内的 SW2实体肿瘤有明显
的杀伤作用 ,而对正常细胞基本未产生杀伤 ,并且作
用时间比单独注射相思子毒素 A 链的作用时间延
长了 7 d ~ 10 d 。Tsai J M 等[ 15] 用相思子毒素的 A
链和针对人结肠癌抗原(CEA)的 mAb (C 27)组成
免疫毒素 MAAC ,不论在体外还是在体内 MAAC
都能特异性地杀伤人的结肠癌细胞(LS174T),而且
MAAC 毒性还表现出明显的选择性 ,对分泌癌胚抗
原的人胚肾细胞的细胞毒性是不分泌该抗原的人胚
肾细胞的毒性的 16 倍。这对于术后恶性肿瘤转移
的控制及微小转移灶的治疗很有意义。近来有文献
报道 ,口服相思子毒素对术后恶性肿瘤的转移也有
抑制作用 ,相思子毒素抑制小鼠癌转移的最小有效
剂量为 1 ng/d ,最佳剂量为 2 ng/d ~ 5 ng/d。随着
对相思子研究的进一步深入 ,相思子资源将在医疗
等领域得到更广范的应用[ 16-17] 。
5.2 相思子毒素与生态农药
随着人类对环境保护的重视及化学农药开发难
度的加大 ,植物源农药的开发已成了当今农药开发
的新热点 。Dharkar P D等利用蓖麻籽和根叶的蓖
麻毒素成分作为杀虫剂 ,应用于农作物的杀虫 ,取得
了一定的效果。印度利用淘米水和蓖麻籽的熬出物
防治椰子害虫二瘤犀甲 , 效果显著。Ohba H 等用
不同溶剂提取的蓖麻粗提物对天幕毛虫 、桃蚜及小
菜蛾进行杀虫剂试验 ,结果表明 ,毒蛋白对害虫具有
触杀作用 。由于昆虫核糖体 RNA 有对 N-糖苷酶敏
感的共有序列 ,蓖麻毒素能抑制昆虫的蛋白质合成 ,
而植物自身能免受毒害 ,因此 ,利用相思子毒素 、蓖
麻毒素开发出生物农药是有前途的 。
6 展望
随着对相思子毒素研究的深入 ,人们对它的认
识在不断加深 ,相思子毒素在许多方面得以开发和
利用 ,但有关相思子毒素在生物农药方面的研究开
展报道仍然少见 ,而开发免疫毒素用于肿瘤治疗方
面报道虽然较多 ,在血液恶性肿瘤的治疗方面业已
显示出良好的效果和明显优势 ,但对于如何提高免
疫毒素在体内的稳定性 ,如何降低异源大分子蛋白
制备的免疫毒素的免疫原性 、如何促进其更快更特
异地进入靶器官还有不少急待解决的难题 。利用基
因工程技术制备重组免疫毒素 、通过人源化抗体的
制备和利用 ,可能改善免疫毒素的治疗效果 。在有
关相思子毒素中毒的预防性药物和相思子毒素中毒
后的特效解毒药仍是空白;相关检测方法研究报道
也较少 ,检测手段相对滞后 。
此外 ,由于相思子毒素抗肿瘤作用明显 ,利用相
思子毒素与抗肿瘤的特异 McAb 结合所制备的免
疫毒素(IT)在恶性肿瘤的治疗上也有很好的应用
前景。相思子毒素 、蓖麻毒素由于是从植物中直接
提取 ,可以自然分解 ,对环境污染小 ,故用相思子毒
素 、蓖麻毒素作为农药或作为先导化合物开发生物
农药正受到广泛重视。可见 ,开展相思子毒素的研
究不仅有重要生态意义 ,也有很大的临床医疗价值。
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