全 文 ：第 31 卷 第 7 期 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Vo l.31 No.7
2011 年 7 月 Journal of Central South University of Forestry & Technology Jul.2011
收稿日期:2011 —03 —10
基金项目:林业公益性行业科研专项(201104023)
作者简介:宋　荣(1985 —),男 ,湖南益阳人 ,硕士研究生 ,主要从事植物资源利用研究;E-mai l:song rong0205@163.com
通讯作者:马英姿(1967 —),女 ,河南巩义人 ,副教授 ,博士 ,硕导 ,主要从事植物学及植物资源利用研究;E-mail:ma yin gzi@163.com
凹叶厚朴离体培养初探
宋　荣 , 马英姿 , 张　慧 , 王志毅
(中南林业科技大学 生命科学与技术学院 , 湖南 长沙　410004)
摘　要:为了建立优质凹叶厚朴的离体快繁再生体系 , 分别对凹叶厚朴茎段外植体的消毒条件 、腋芽诱导培养两个
方面进行了初步研究 ,结果表明:最佳消毒条件为 70%C2H5OH 处理 60 s ,H gCl2 处理 12 min;最佳腋芽诱导配方为
B5 +NAA 0.05 mg· L-1 +6-BA 1.0 mg · L -1 ,腋芽诱导率可达 55%。
关键词:凹叶厚朴;正交设计;腋芽诱导;消毒条件
中图分类号:S 723.1+32 文献标志码:A 文章编号:1673 —923X(2011)05 —0179 —04
An exploratory study of stem in vitro culture of Magnolia off icinalis
SONG Rong , MA Ying-zi , ZHANG Hui , WANG Zhi-yi
(School of Life Science and Technolog y , Centr al South Unive rsity o f Fo restry and Techno lo gy ,
Chang sha 410004 , Hunan , China)
Abstract:In o rder to establish rapid propagation regener ation sy stem of Magnolia o f f icina lis subsp in vitr o , steriliza-
tion conditions of Magnolia o f f icinalis stem explants and induction culture of stem segment we re inve stigated.The
results indicate tha t the be st sterilization conditions w as 70% ethano l t reated 60 seconds , mercuric chlo ride treated 12
minutes.the best bud induction fo rmula w as B5+NAA 0.05 mg· L-1 +6-BA 1.0 mg· L-1 , the bud inducement
ratio can reach to 55%.
Key words:Magnolia biloba;o rthogonal design;axillary bud induction;ste rilization condition
　　凹叶厚朴 Magnol ia o f f icinalis 为木兰科
Magnoliaceae木兰属 Magnolia植物厚朴的一个亚
种 ,是我国特产树种 ,主产于四川 、湖北 、湖南 、江西 、
福建 、浙江等省 。因其特殊的分类地位和资源的日
益枯竭而被列为国家珍稀濒危植物[ 1-2] 。其干燥的
树皮和根皮可入药 ,味苦辛 ,性温 ,具有温中理气 、散
满消胀 、燥湿消积 、抗菌 、抗痉挛 、抗过敏 、肌肉松驰
等作用 ,自古以来就用于消化道疾病的治疗 ,发挥镇
静和缓解骨骼紧张等功效 ,在我国中药材中占有重
要地位[ 3-4] 。其有效成份主要是厚朴酚(Magnolo l)
及其异构体和厚朴酚(Honokio l),这两种酚类含量
的差异是药材品质优劣的评定标准[ 5] 。随着野生植
物资源日益减少 ,少量的人工林资源也远远不能满
足药材市场的需求。且早期建立的人工林品种混
杂 ,经济效益不高 ,一些优良的种质资源正在消失 ,
市场供需矛盾加剧 ,进一步加剧了优质厚朴资源的
毁灭性破坏。离体快繁是一种解决资源短缺和保存
优良种质的有效途径 ,可在短期内培养出大量的优
质苗木 ,但凹叶厚朴为木兰科植物 ,由于其在植物分
类学上的地位处于最原始的被子植物 ,相对来说 ,建
DOI :10.14067/j.cnki .1673-923x.2011.07.031
　 　中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 第 31卷
立再生体系的难度较其它木本植物大。本研究通过
对湖南永州产优质凹叶厚朴进行离体组织培养的研
究 ,旨在建立优质高效的人工快繁体系 ,并为其进一
步的分子育种打下良好的基础 。
1　材料与方法
1.1　材料的采集
活体材料采自湖南省林科院种植基地的 1年生
凹叶厚朴植株 ,选择健康 、无病虫害的顶芽和带腋芽
茎段为外植体。种源来自于湖南永州道县。
1.2　外植体消毒条件选择
将外植体先用洗涤剂清洗 、漂净 ,接着用流动的
自来水冲洗 4 h 左右 ,然后在无菌操作台上用 70 %
乙醇消毒 0.5 ～ 1 min ,再用 0.1 %升汞溶液浸泡 6
～ 12 min ,无菌水冲洗 4 ～ 6次[ 6-10] 。
1.3　腋芽诱导培养
1.3.1　基本培养基的选择及激素种类和质量浓
度的选择
用 MS 和 B5两种基本培养基添加不同质量浓
度 6 —BA 、NAA 、IBA 激素 ,以凹叶厚朴顶芽和带腋
芽茎段作为外植体设计双因素试验 ,观察基本培养
基 、激素种类及质量浓度对外植体启动的影
响[ 11-13] 。
1.3.2　最佳腋芽诱导培养基选择
经双因素试验确定对腋芽诱导影响明显的两种
激素 ,选择 6 —BA 、NAA 、消毒时间(Time)3因素 ,每
个因素 3 水平 ,选用 L 9(33)正交表做正交试验设
计 ,并对实验数据用 SPSS 统计软件进行数据分
析[ 14] 。
在基本培养基中加入 7.0 g · L-1 琼脂 , 30
g ·L-1蔗糖 , pH 值调至 5 .6 ～ 5.8 ,培养温度为 25
±2 ℃,每天光照 12 h , 光照强度为 1 500 ～ 2 000
lx[ 15-17] 。每个试验号接种20瓶 ,3次重复。
2　结果与分析
2.1　外植体消毒处理条件的选择
用茎段作为外植体 ,消毒的条件很重要 。从表
1可知 ,外植体随着消毒处理时间的延长 ,其感染率
降低 ,在预设的消毒处理方式中 , 70% C2H 5OH 处
理 60 s后 ,再用 HgCl2消毒效果较好 ,但 HgCl2 的
消毒时间在 8 、10 、12 min 时 ,感染率的差异并不显
著。且实验中发现 ,带顶芽的茎段随着消毒时间进
一步的延长 ,感染率仍在下降 ,存活率也在上升 ,其
原因应该是顶芽外面的托叶起到了保护作用 ,使顶
芽因消毒时间过长而受到伤害减小。但不带顶芽的
茎段 ,消毒时间过长时会导致外植体死亡。
表 1　外植体消毒效果
Table 1　Ef fects of antisepsis for the explants
序号 消毒时间 接种数 感染率/%70%C2H 5OH/ s 0.1%H gCl2/min
1 30 　6 20 69.2
2 30 8 20 62.3
3 30 10 20 51.2
4 30 12 20 53.3
5 45 6 20 63.6
6 45 8 20 65.3
7 45 10 20 54.6
8 45 12 20 51.7
9 60 6 20 62.1
10 60 8 20 59.6
11 60 10 20 50.5
12 60 12 20 44.8
2.2 　基本培养基的选择及激素种类 、质量浓度的
选择
　　从表 2 、表 3的对比中可以看出 ,对应 MS和 B5
两种不同的基本培养基培养 ,当激素 6 —BA和 NAA
质量浓度对应一致时 , MS 为基本培养基的腋诱导
率平均达 54.4 %,最高诱导率可达 58.9%,而用 B5
为基本培养基的腋芽诱导率平均达 57 .7%,最高诱
导率可达 62.8 %;当激素 6 —BA和 IBA质量浓度对
应一致时 , MS 为基本培养基的平均诱导率为
47.9%,最高诱导率达51.6%,而用B5为基本培养基
的腋芽诱导率平均达50.7%,最高诱导率达 53.8%,
表 2　6-BA与 NAA 的组合
Table 2　The combination of 6-BA and NAA
序号 培养基 6 —BA/(m g· L -1)
NAA/
(mg· L-1) 接种数
萌芽率/
%
1 MS 1.0 0.05 20 58.9
2 MS 2.0 0.1 20 52.2
3 MS 3.0 0.5 20 52.1
4 B 5 1.0 0.05 20 62.8
5 B 5 2.0 0.1 20 57.5
6 B 5 3.0 0.5 20 52.8
·180·
第 7 期 　宋　荣 ,等:凹叶厚朴离体培养初探　
表 3　6-BA与 IBA组合
Table 3　The combination of 6-BA and IBA
实验
序号 培养基
6 —BA/
(mg· L-1)
IBA/
(mg· L -1) 接种数
萌芽率/
%
7 M S 1.0 0.05 20 44.2
8 M S 2.0 0.10 20 47.8
9 M S 3.0 0.50 20 51.6
10 B5 1.0 0.05 20 53.8
11 B5 2.0 0.10 20 51.9
12 B5 3.0 0.50 20 46.5
说明 B5培养基比 MS 培养基更适于凹叶厚朴腋芽
诱导。当 6 —BA 的质量浓度保持对应一致时 ,比较
相同质量浓度的NAA 和 IBA 对腋芽诱导的影响效
果 ,可以看出 6 —BA 与NAA 的组合比6 —BA 与 IBA
的组合效果好 ,差异显著 。
2.3　最佳腋芽诱导配方的选择
根据表 2 、表 3 的试验结果 ,以 B5为基本培养
基 ,选择 6 — BA 、NAA 、消毒时间为因素 ,设计 L9
(34)正交表做正交试验。从表 4 结果中可以看出 ,
从极差 R 的大小可知不同因素对腋芽诱导影响的
大小依次为:6 —BA(0.28)﹥ NAA(0 .14)﹥消毒时
间(0.06)。从表 4 还可看出有效芽诱导率最高的
各因素的最优水平分别为 6 —BA 1 mg ·L-1 ,NAA
0.05 mg ·L-1 ,消毒时间 12 min。不同激素配比对
腋芽的诱导率虽总体较高 ,各组试验之间的差异不
显著(p ≥0 .05),但其中有些激素组合诱导出的腋
芽发育畸形 ,不能正常生长。方差分析的结果(表
5)说明 , 6 — BA 对有效芽的诱导率影响显著(p ≤
0.05),而其它两个因素对实验结果的影响差异不显
著。当 6 —BA 质量浓度达到 2.0 mg ·L-1时 ,虽然
能诱导出较多的腋芽 ,但诱导出来的芽愈伤化现象
严重(见图 1),不能正常生长;当 NAA质量浓度超
过 1 .0 mg ·L-1时 ,腋芽诱导生长缓慢 ,且苗生长
不正常 ,叶片畸形 ,偏黄 ,不能正常生长(见图 2),
无法进行增殖生长和生根生长的研究 。因此 , 最
佳腋芽诱导配方为:B5 +NAA0 .05 mg · L-1 +6 —
BA 1.0 mg ·L-1 ,腋芽诱导率可达 55%(见图 3 、
图 4)。
表 4　正交实验结果和直观分析
Table 4　The result of orthogonal test and intiutive analysis
实验序号 激素质量浓度/(mg· L -1) HgC l2 消毒时间/min 接种数 萌芽数 萌芽率/ %
有效芽百分率/
%6 —BA NAA
1 0.5 0.05 8.00 20 10 50 50
2 0.5 0.1 10.00 20 11 55 40
3 0.5 0.5 12.00 20 9 45 30
4 1.0 0.05 10.00 20 12 60 55
5 1.0 0.1 12.00 20 11 55 40
6 1.0 0.5 8.00 20 9 45 30
7 2.0 0.05 12.00 20 12 60 10
8 2.0 0.1 8.00 20 10 50 15
9 2.0 0.5 10.00 20 8 40 10
K 1 1.2 1.10 0.95
K 2 1.2 0.95 1.00 T=2.75
K 3 0.35 0.7 0.80
K 1 0.4 0.37 0.32
K 2 0.4 0.32 0.33
K 3 0.12 0.23 0.27
R 0.28 0.14 0.06
表 5　L9(33)实验结果方差分析
Table 5　Variance analysis of the L9(33)results
变异来源 离差平方和(SS) 自由度(df) 均方差(MS) 均方比(F) 概值 Sig.
6 —BA 0.161 2 0.080 11.560 0.009
NAA 0.027 2 0.014 0.467 0.648
HgCl 2 消毒时间 0.007 2 0.004 0.111 0.897
误差 0.004 2 0.002
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图 1　诱导的愈伤化的苗
Fig.1　The induction injuries seedling
图 2　诱导的黄化苗
Fig.2　The induction etiolated seedling
图 3　继代生长的有效苗
Fig.3　The subculture of effective seedling
图 4　诱导的有效苗
Fig.4　The induction effective seedling
3　小结与讨论
通过实验对凹叶厚朴外植体消毒时间做了研究
比较 ,结果表明:用 70%C2H 5OH 消毒 60 s , HgCl2
消毒 12 min时效果最好;同时也对适合凹叶厚朴生
长的激素进行了筛选 ,并通过正交试验得出最佳培
养条件为:B5 +6 — BA 1 .0 mg ·L-1 +NAA
0.05 mg · L -1 +消毒时间(70%C2H5OH 60 s ,
HgCl2 12 min), 用此组合腋芽诱导率可以达到
55%,且由腋芽诱导出的苗生长状况较好 ,大多数都
为有效苗 ,可用于进一步的增殖和生根培养研究。
由于凹叶厚朴本身含有较高的多酚类化合物厚朴酚
及和厚朴酚 ,两者都为多酚类化合物 ,易被氧化成醌
类化合物而发生褐化情况 ,褐化后的茎在培养一段
时间后死亡率较高。在本试验中发现 ,加入 3%的
PV P可有效降低褐化情况 。
参考文献:
[ 1] 　中国中药材公司.中国常用中药[ M] .北京:科学出版社 , 1995.
[ 2] 　国家林业局 ,农业部.国家重点保护野生植物名录(第一批)
[ R] .1999.
[ 3] 　斯金平 ,童再康.厚朴[ M ] .北京:中国农业出版社 , 2001.
[ 4] 　陈存及 ,陈伙法.阔叶树种栽培[ M ] .北京:中国林业出版社 ,
2000:382-384.
[ 5] 　童再康 ,朱玉球 ,王章荣.厚朴组织培养与高产细胞系建立的研
究[ J] .南京林业大学学报 , 2002 , 26(4):23-26.
[ 6] 　王　蒂.植物组织培养[ M ] .北京:中国农业出版社 , 2004.
[ 7] 　李浚明.植物组织培养教程[ M ] .北京:北京农业大学出版社 ,
1992.
[ 8] 　杨增海.园艺植物组织培养[ M ] .北京:北京农业出版社 , 1987.
[ 9] 　曹孜义 ,刘国民.适用植物组织培养技术教程[ M] .兰州:甘肃
科学技术出版社 ,1996.
[ 10] 　李凌明.植物组织培养教程[ M] .北京:北京农业大学出版社 ,
1991.
[ 11] 　张法勇 ,刘向东 ,高秀丽.木本植物组织培养器官发生植株再
生[ J] .河北林果研究 , 2005 ,20 ,(3):234-238.
[ 12] 　沈晓霞 ,俞旭平 ,盛束军.千层塔茎尖组织培养灭菌方法的研
究[ J] .中国中药杂志 , 2002 ,27(6):458-459.
[ 13] 　张秀峰.日本厚朴组织培养技术的研究[ J] .科技情报开发与
经济 , 2008, 18(33):114-115.
[ 14] 　庄楚强 ,吴亚森.应用数理统计基础[ M] .广州:华南理工大学
出版社 , 2002.
[ 15] 　刘贤旺 ,杜　勤 ,赖学文 ,等.凹叶厚朴组织培养的研究[ J] .江
西林业科技, 1997(2):1-4.
[ 16] 　孙雁霞 ,林桂芸 ,王跃华 ,等.川厚朴愈伤组织培养的初步研究
[ J] .西南农业学报 , 2004 , 17(2):228-230.
[ 17] 　刘贤旺 ,杜　勤.凹叶厚朴愈伤组织的超低温保存[ J] .植物资
源与环境 ,1996 , 5(1):9-13.
[本文编校:谢荣秀]
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