全 文 ：川产青牛胆的 RAPD分析
杨　兵 ,王晓静 ,王天志＊ ,罗　禹
四川大学华西药学院 ,成都 610041
【摘　要】　目的:为川产青牛胆的物种鉴定和遗传图谱的构建寻找一种新的途径。方法:采用 RAPD(Ran-
dom Amplified Polymorphic DNA , 随机扩增多态性 DNA)技术对采自 4 个地区 6 个居群的 32个 DNA样品用筛选的
15 个引物进行扩增 , 进而进行聚类分析。结果:RAPD能将 6 个居群的样品明显区分开 , 居群内的遗传差异小于
居群间差异 ,野生环境的样品遗传分化较大。结论:RAPD技术在分子水平上对青牛胆进行鉴定是一种行之有
效的手段 ,从而为青牛胆物种鉴定 、遗传图谱的构建等研究提供分子水平的方法和依据。
【关键词】　青牛胆;RAPD;分子标记
【中图分类号】　R917　　【文献标识码】　A　　【文章编号】　1672-3651(2007)06-0428-03
【收稿日期】　2007-06-01
【＊通讯作者】　王天志:教授 , 博导 , Tel:028-85503639, E-mail:
wangtz12@163.com
　　金果榄为中国药典收载品种 ,野生。在对川
产金果榄基源品种青牛胆 Tinospora sagittata
(Oliv.)Gagnep和峨嵋青牛胆 T.sagittata var.cra-
veniana (S.Y.Hu)H.S.Lo 进行野外调查采集的过
程中发现 ,即使同一产地不同居群的青牛胆植株
形态 ,尤其是叶片差异极大。加之野生资源急剧
减少 ,因此从分子水平对川产青牛胆进行物种鉴
定及遗传育种方面的研究 ,为进一步开发利用青
牛胆提供科学依据十分必要。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料　均采用植物嫩叶 ,变色硅胶快
速干燥后置-76 ℃低温冰箱保存 。材料编号及来
源见表 1 ,分别采自 4个地区 6个居群的 32个个
体。样品经作者王天志鉴定为青牛胆 T.sagittata
(Oliv.)Gagnep和峨嵋青牛胆 T.sagittata var.cra-
veniana (S.Y.Hu)H.S.Lo 。
1.1.2　主要试剂及仪器　引物序列在 TaKaRa公
司合成 ,10倍缓冲液(Mg2+free)、Mg2+ 、dNTP 和 Taq
酶均购自 TaKaRa 公司。高速离心机(BIOFUGE ,
Heraeus),PCR仪(BIO-RAD , Icycler),电泳仪(DYY-
Ⅲ12B型三恒多用电泳仪 ,北京六一仪器厂),凝胶
成像分析系统(BIO-RAD)。
Table 1　Experiment materials
Sample No. Collection area Col lection time
1-9 Sichuan emei Oct.2005
10-19 Sichuan bazhong Oct.2005
20-27 Sichuan bazhong Oct.2005
28 Sichuan dazhou Oct.2005
29-32 Sichuan chengdu Oct.2005
Note:the leaves of 10-19# are ovoid or ellipse , and 20-27# are spiculi-
form or slender spiculiform
1.2 　方法
1.2.1　青牛胆总 DNA的提取及定量　CTAB法提
取总 DNA[ 1] :取冷冻的青牛胆嫩叶快速研成细粉 ,
加入 CTAB液 ,振荡混匀 ,置 65 ℃,加入等体积的
氯仿-异戊醇 ,抽提 2次 ,离心 ,上层水相加入等体
积的无水乙醇 , -20 ℃沉淀 ,去上清 ,空气干燥 ,加
入二蒸水 、Rnase ,保温 ,保存备用。取 10 μL ,1.0%
琼脂糖凝胶电泳。电压 140 V ,电流 100 mA ,紫外
下凝胶显像 ,并用 totallab v2.01测定所提 DNA 的
浓度约为 10 ng·μL-1 。
1.2.2　RAPD-PCR反应程序的优化　采用单因素
考察的方法 , 对影响 RAPD 反应较大的 DNA 、
Mg
2+ 、dNTP 、引物和 Taq 聚合酶浓度进行优化 ,得
到最佳的反应体系 ,25 μL反应体系中 ,模板 DNA
浓度为 10 ng , 2.5 μL 的 10倍缓冲液(Mg2+ free),
MgCl2 2.0 mmol·L-1 ,dNTPs为0.20 mmol·L-1 ,引物
1.0μmol·L-1 ,Taq 酶 1.0 U;反应程序为:94 ℃预
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变性 4 min;94 ℃变性 0.15 min , 36 ℃复性 0.45
min ,72 ℃延伸 1.30 min;进行 45个循环;72 ℃延
长4 min ,4 ℃保存 。
1.2.3　RAPD扩增与聚类分析　从 50个 RAPD随
机引物中筛选出 15个条带清晰 、多态性丰富的引
物 ,按上述反应体系进行扩增 , 1.4%的琼脂糖凝
胶中分离扩增产物 ,电泳结束后用凝胶成像系统
记录 。图 1为引物S29的 RAPD结果 。
Fig 1　The result of PCR using primer S29
　　图中从左至右 ,第1泳道和第 23泳道为mark-
er ,第 2泳道至第 22泳道为 1 ～ 21#样品 ,第 24泳
道至第34泳道为 22 ～ 32#。
重复性好且清晰的条带用于分析 ,有条带记
为1 ,无条带记为 0。按照 Nei 和 Li 的公式 F =
2Nxy (Nx+Ny)获得各样品间的遗传相似度 ,其
中 Nxy 为 2个个体共同享有的RAPD标记 , Nx , Ny
分别为 X 和Y 个体分别拥有的 RAPD标记数 ,再
经 D=1-F 计算相应的遗传距离 ,将得到的数据
输入计算机 ,用非加权配对算术平均法(UPGMA)
和NTSYS软件进行聚类分析构建聚类树状图[ 2] 。
2　结果与分析
2.1　RAPD结果分析
从50个 RAPD随机引物对中筛选出 15个条
带清晰多态性丰富的引物 ,对这 15个引物的扩增
结果进行统计分析(表 2)。15 个引物共扩增出
155个条带 ,平均每个引物可扩增出 10条带 ,扩增
片段多数集中在 0.5 kb ～ 2.0 kb 之间。155 条
DNA扩增带中 ,127 条带具有多态性 , 占 82.0%。
每个引物可扩增出 5 ～ 12条多态性带 ,平均为 8.5
条 ,多态性频率平均为 81.6%。表明样本具有丰
富的多态性。
2.2　聚类结果
32个样本经筛选的 15个样本 RAPD扩增后 ,
经NTSYS 软件分析 , 结果如图 2。遗传距离在
0.04 ～ 0.39之间。在 0.39处 32个样本分成 2组 ,
分别是四川大学华西植物园一组(29#～ 32#),
采自野外的其他青牛胆和峨嵋青牛胆一组(1#～
28#),在 0.37处峨嵋青牛胆(1#～ 9#)与采自巴
中和达州的青牛胆(10#～ 28#)被区分开 , 约
0.33处采自达州的青牛胆(28#)与采自巴中的青
牛胆(10#～ 27#得以区分 ,在约 0.24处采自巴中
的近卵形或椭圆形叶(10#～ 19#)与披针形至狭
长披针形叶(20#～ 27#)得以分开。
Table 2　List of primers sequences and amplification results
Primer Sequence
Total
bonds
Polymorphic
bonds
Polymorphic
rates(%)
OPH1 GGTCGGAGAA 10 9 90.0
OPH7 CTGCCATCGT 13 11 85.0
OPH12 ACGCGCATGT 14 12 85.7
S24 AATCGGGCTG 9 8 88.9
S27 GAAACGGGTG 10 9 90.0
S28 GTGACGTAGG 12 11 91.7
S29 GGGTAACGCC 11 8 72.3
S30 GTGATCGCAG 10 7 70.0
S201 GGGCCACTCA 8 5 62.5
OPH18 GACGCCACAC 10 8 80.0
S208 AACGGCGACA 13 10 76.9
S500 TCGCCCAGTC 9 8 88.9
S503 ACACAGAGGG 6 5 83.3
S507 ACTGGCCTGA 8 6 75.0
S508 CCCGTTGCCT 12 10 83.3
Total 155 127 82.0
3　讨　论
3.1　从遗传分析结果可以看出 ,川产的野生青牛
胆及峨嵋青牛胆与家种的青牛胆遗传距离最大 ,
野生样本遗传分化较高 。从实验结果得知 ,青牛
胆与峨嵋青牛胆在分类学上种与变种的关系值得
商榷 ,因为他们的遗传距离差异比青牛胆种内(野
生与家种)的差异更小。
3.2　RAPD作为一种显性遗传标记 ,能有效标记
中国天然药物　2007年 11月　第 5卷　第 6期 Chin J Nat Med　Nov.2007　Vol.5　No.6　429　
Fig 2　The molecular phylogenetic tree of 32 samples
居群间与居群内的遗传关系 。实验有效区分了 4
个地区6个居群的样品 ,并且能从分子水平解释
生物的外在形态尤其是叶片形态差异 ,在本试验
中有效区分了四川巴中两个居群间不同叶部形态
的青牛胆。结果显示 ,居群内的遗传差异远小于
居群间的遗传差异。
该研究作为在分子水平上对青牛胆进行鉴定
的有效方法 ,为川产青牛胆物种鉴定 、遗传图谱的
构建等深入研究提供了分子水平的科学依据 。
参 考 文 献
[ 1] 　Williams JGK , Kubelik AR , Livak KJ , et al.DNA polymorphisms
amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[ J] .Nu-
cl Acids Res , 1990 , 18(22):6531-6535.
[ 2] 　高文远(Gao WY).当归药材道地性的 RAPD 分析[ J] .中草
药(Chin Tradit HerbDrugs), 2001 , 23(10):926-929.
RAPD Analysis of Tinospora sagittata and T.sagittata var.
craveniana Produced in Sichuan
YANG Bing , WANG Xiao-Jing , WANG Tian-Zhi＊ , LUO Yu
West-China School of Pharmacy , Sichuan University , Chengdu 610041 , China
【ABSTRACT】　AIM:To develop a new method for the species identification and genetic map construction of Tinospora sagittata
(Oliv.)Gagneps.METHODS:32 samples from 5 areas(6 clusters)have been amplified adopting 15 selected primers through applied
clustering analysis.RESULTS:RAPD could differentiate samples from 6 different clusters.The inner cluster differences were smaller than
exterior clusters.There were larger genetic differentiations among wild samples.CONCLUSION:RAPD is an effective method for T.
sagittata (Oliv.)Gagneps identification in molecular degree , and it has set up a foundation for the Tinospora sagittata (Oliv.)Gagneps
species identification and genetic map.
【KEY WORDS】　Tinospora sagittata (Oliv.)Gagnep;RAPD;Molecular marker
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