全 文 ：毛脉酸模内生真菌分布特征及其优势菌群
化学成分相似度分析
胡凤1，2，侯素云3，高宁1，程玉鹏1，王振月1
(1．黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040;2．四川省自贡食品药品检验所，四川
自贡 643000;3．石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050035)
摘要:目的 分离得到毛脉酸模内生真菌并分析其优势菌群化学成分相似度。方法 分别从毛脉酸模根、
茎、叶中分离得到内生真菌，并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版)”分析菌群化学成
分相似度。结果 自 1 年生毛脉酸模中共分离得到 42 株内生真菌，通过形态鉴定初步确定了 4 目、5 科、
8属;其中曲霉属(23． 8%)、链格孢属(21． 4%)以及丝核属(16． 7%)为优势菌群;化学成分分析结果表
明:相同种属的内生真菌中，化学成分相似度较高的都分离自宿主同一部位。结论 毛脉酸模内生真菌
具有一定的生物多样性，其分布表现出一定的组织特异性，且同一种属内生真菌的化学成分与其分离部
位有一定相关性。
关键词:毛脉酸模;内生真菌;鉴定;HPLC;相似度
中图分类号:R284． 1 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2012． 04． 008
文章编号:1006-8783(2012)04-0387-05
Distribution of endophytic fungi from Rumex gmelini and similarity analysis of
chemical components of the dominant flora
HU Feng1，2，HOU Su-yun3，GAO Ning1，CHENG Yu-peng1，WANG Zhen-yue1
(1． School of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;2． Zigong
Institute for Food and Drug Control，Zigong 643000，China;3． Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Limited
Company，Shijiazhuang 050035，China)
Abstract:Objective To isolate endophytic fungi from Rumex gmelini Turcz． and analyze the similarity of
the chemical constituents of dominant endophyte． Methods The endophytic fungi was isolated from the
roots，stems and leaves of R． gmelini，and the similarity was analyzed by“Similarity Evaluation System for
Chromatographic Fingerprint of TCM(2004A)”． Results 42 strains were isolated from R． gmelini Turcz．，
which belonged to 4 orders，5 families and 8 genera． Genus Aspergillus，Alternaria and Rhizoctonia were
regarded as dominant endophyte，accounting for 23． 8%，21． 4% and 16． 7% respectively． And the analysis
results of chemical constituents about the dominant flora showed that the sibling endophyte which had
similar constituents located the same tissue． Conclusion Biological diversity，tissue-specificity of location，
and correlation between the chemical constituents and the location of endophytic fungi were observed from
R． gmelini Turcz． ．
Key words:Rumex gmelini Turcz．;endophytic fungi;identification;HPLC;similarity
收稿日期:2012-03-21
基金项目:国家自然科学基金面上项目(30970300) ;哈尔滨市科技创新人才研究专项资金(优秀学科带头人)项目
(2010RFXXS031) ;黑龙江中医药大学校科研基金(201012)
作者简介:胡凤(1982 －) ，女，硕士，主要从事中药分子生物学研究，Email:hufeng9803@ 163． com;通信作者:王振月(1956 －) ，
男，教授，主要从事中药资源开发与药用植物生物技术研究，电话:0451-87266873，Email:wangzhen_yue@ 163． com。
网络出版时间:2012-07-07 15:41 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1413． R． 20120707． 1541． 005． html
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Aug． 2012，28(4)
毛脉酸模(Rumex gmelini Turcz．)为蓼科酸模属
植物，民间以根入药，对淋病、上呼吸道感染性疾病、
癣病和疮毒有确切疗效，并具有抗肿瘤、抗真菌、镇
咳平喘、降压、抗病毒和抗氧化等作用［1］。研究表
明毛脉酸模中含有白藜芦醇、白藜芦醇苷、酸模素、
大黄素等多种活性成分［2］，具有极大的研究开发前
景。植物内生真菌(endophytic fungi)由于长期生长
于植物内部，往往能产生许多具有与共生植物相似
的活性代谢产物［3］。特别是 1993 年，Stierle 等人首
次从短叶红豆杉 Taxus brevifolio 的韧皮部分离到 1
株能产紫杉醇的内生真菌 Taxomyces anareanae，使
得这一领域的研究获得了广泛的关注［4］。另外，课
题组前期研究结果表明，真菌侵染能提高毛脉酸模
根中多种有效成分的含量［5］。因此，开发毛脉酸模
内生真菌不仅有望发现新的药用资源，同时有助于
提高家种毛脉酸模的质量。
1 材料、仪器与试剂
1． 1 材料
实验用毛脉酸模采自黑龙江中医药大学药用植
物园，采收时间为 10 月份，为 1 年生，植株生长健
壮，表面无病害。经黑龙江中医药大学王振月教授
鉴定为毛脉酸模 Rumex gmelini Turcz．。
1． 2 仪器
PH-71 电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有
限公司) ，二级 B2 型生物安全柜(北京东联哈尔仪
器制造有限公司) ，FL-30 系列生物显微镜(江西枫
林光学仪器有限公司) ，电热手提式压力蒸汽消毒
器(哈尔滨市松花江医疗器械厂) ，美国Waters 600E
高效液相色谱仪，Waters 2487型二极管阵列检测器。
1． 3 试剂
马铃薯，葡萄糖(天津市凯通化学试剂有限公
司，批号:20080725) ，琼脂(北京奥博星生物技术有
限责任公司，批号:20060306) ，升汞(姜堰市环球试
剂厂，批号:2005) ，色谱甲醇(迪马公司，批号:
81229) ，乳酸棉兰染液(自制)，其余试剂均为分析纯。
2 方法
2． 1 毛脉酸模内生真菌的分离与纯化
参考文献［6］，以 75% (体积分数)乙醇与
0． 1%(质量浓度)升汞为表面消毒剂，采用组织块
分离法分离毛脉酸模内生真菌，以表面消毒后未经
切割的组织作为空白对照，观察消毒是否彻底。对
所分离得到的内生真菌采用菌丝顶端纯化法逐步纯
化，将纯化后的菌株转接至马铃薯葡萄糖培养基
(potato dextrose agar，PDA)斜面中，4 ℃保存。
2． 2 毛脉酸模内生真菌的形态鉴定
采用点植法和插片培养法观察所分离毛脉酸模
内生真菌的菌落特征及显微形态特征，参照文献
［7］进行初步形态鉴定，确定到属。
2． 3 毛脉酸模内生真菌提取液的制备
分别取经过活化的各属真菌，接种于 PDA 液体
培养基中，28 ℃培养 7 d，60 ℃水浴将菌丝体及发酵
液共同蒸干。取所得样品 1 g，置于圆底烧瓶中，加
8 倍量 70%(体积分数，下同)乙醇，加热回流 3 h，
提取 3 次，滤过，合并滤液，60 ℃水浴蒸干。用蒸馏
水混悬后，加乙酸乙酯萃取，合并有机试剂，蒸干，得
毛脉酸模内生真菌乙酸乙酯提取物。取 0． 1 g 提取
物，加甲醇 5 mL溶解并定容至刻度，备用。
2． 4 毛脉酸模内生真菌 HPLC分析方法的建立
色谱条件:色谱柱为 Thermo C18柱(5 μm，250
mm × 4． 6 mm) ;流动相为甲醇-0． 1%(体积分数)
H3PO4 水溶液，梯度洗脱;流速:1． 0 mL·min
－1;检
测波长:254 nm;柱温:40 ℃;进样量:20 μL。洗脱
程序见表 1。
表 1 梯度洗脱程序表
Table 1 The table of linear gradient
t /min φ(甲醇)/%
φ［0． 1%(体积分数)
H3PO4 水溶液］/%
0． 00 30 70
50． 00 100 0
70． 00 100 0
经方法学考察证实，该方法精密度与重复性良
好，供试品溶液在 24 h内稳定。
2． 5 毛脉酸模内生真菌优势菌群乙酸乙酯部位化
学成分相似度分析
分别取曲霉属、链格孢属、丝核属毛脉酸模内生
真菌乙酸乙酯提取液，按“2． 4”项下条件进样分析。
将同属真菌所得色谱图导入国家药典委员会“中药
色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版)”中，选
择对照峰，设定时间窗宽度为 0． 5 min，经自动匹配，
以均值法生成对照图谱，建立共有模式。并以此共
有模式为标准，采用夹角余弦算法对各批样品进行
整体相似度评价，分别计算出各菌株色谱图间及与
对照图谱之间的相似度。
3 结果与分析
3． 1 毛脉酸模内生真菌分离及鉴定结果
883 广东药学院学报 第 28 卷
结果表明，空白对照组并无真菌生长，证明表面
消毒彻底，所得菌株均为内生真菌。从 1 年生毛脉
酸模中共分离得到 42 株内生真菌，其中从根中分离
得到 20 株，茎中分离得到 5 株，叶中分离得到 17
株。经菌落形态及显微特征观察，参考相关文献［7］
鉴定得出，42 株内生真菌确定种属的有 38 株，分属
于 4 目、5 科、8 属;另有 4 株未见孢子产生，种属未
知，暂归为其他类群。见表 2。
表 2 毛脉酸模内生真菌分离结果
Table 2 The result of isolate endophytic fungi from Rumex gmelini Turcz．
目 科 属
分离数量 /株
根 茎 叶 总计
丝孢目
丝孢科
柱格孢属(Ramularia) 3 － － 3
曲霉属(Aspergillus) 5 － 5 10
小尾孢属(Cercosporella) 2 － － 2
暗色孢科
长蠕孢属(Helminthosporium) 1 2 － 3
链格孢属(Alternaria) 4 － 5 9
瘤座孢目 瘤座孢科 镰刀孢属(Fusarium) 3 － － 3
丛梗孢目 丛梗孢科 木霉属(Trichoderma) － 1 － 1
无孢目 无孢科 丝核属(Rhizoctonia) － 2 5 7
其他类群 2 － 2 4
总计 20 5 17 42
3． 2 毛脉酸模内生真菌分布特征比较分析
由表 2 可以看出，1 年生毛脉酸模中，自不同组
织部位分离得到的内生真菌数量存在着较大差异:
根和叶是内生真菌主要的侵染部位，所得到的内生
真菌数分别占分离得到的内生真菌总数的 47． 6%
和 40． 5%;而从茎中分离得到的内生真菌数仅占总
数的 11． 9%。从分离得到的真菌种类来看，42 株内
生真菌分属于 8 个不同的属(其中 4 株种属未知) ，
表明毛脉酸模内生真菌具有一定的物种多样性。通
过比较可以看出，1 年生毛脉酸模在秋季(10 月份)
时，内生真菌以曲霉属(占分离总菌数的 23． 8%)、
链格孢属(占 21． 4%)、丝核属(占 16． 7%)为优势种
群。然而各种属分布并不均匀，根中分离得到的内生
真菌种类占 8个属中的 6个，而叶和茎中的种类相对
较少。柱格孢属、小尾孢属和镰刀孢属仅从根中能分
离得到，而木霉属仅存在于茎中，可见毛脉酸模内生
真菌在宿主的体内分布具有一定的组织特异性。
3． 3 毛脉酸模优势内生真菌菌群乙酸乙酯部位化
学成分的相似度分析结果
以按“2． 5”项下操作所得的共有模式为标准，
采用夹角余弦算法对各批样品进行整体相似度评
价，分别计算出各菌株色谱图间及与对照图谱(R)
之间的相似度。3 种优势内生真菌菌群乙酸乙酯部
位化学成分的相似度分析结果见表 3 ～ 5。
表 3 曲霉属内生真菌化学成分相似度结果
Table 3 The similarity of the chemical constituents of the Aspergillus strains
S2 S3 S15 S48 S51 S7 S9 S10 S14 S18 R
S2 1． 000 0． 207 0． 126 0． 822 0． 195 0． 147 0． 270 0． 108 0． 121 0． 137 0． 372
S3 0． 207 1． 000 0． 881 0． 123 0． 130 0． 273 0． 183 0． 219 0． 277 0． 292 0． 531
S15 0． 126 0． 881 1． 000 0． 103 0． 230 0． 182 0． 113 0． 166 0． 278 0． 382 0． 235
S48 0． 822 0． 123 0． 103 1． 000 0． 104 0． 114 0． 135 0． 199 0． 164 0． 107 0． 698
S51 0． 195 0． 130 0． 230 0． 104 1． 000 0． 127 0． 110 0． 123 0． 123 0． 208 0． 218
S7 0． 147 0． 273 0． 182 0． 114 0． 127 1． 000 0． 200 0． 459 0． 418 0． 144 0． 482
S9 0． 270 0． 183 0． 113 0． 135 0． 110 0． 200 1． 000 0． 725 0． 142 0． 120 0． 471
S10 0． 108 0． 219 0． 166 0． 199 0． 123 0． 459 0． 725 1． 000 0． 172 0． 134 0． 456
S14 0． 121 0． 277 0． 278 0． 164 0． 123 0． 418 0． 142 0． 172 1． 000 0． 757 0． 441
S18 0． 137 0． 292 0． 382 0． 107 0． 208 0． 144 0． 120 0． 134 0． 757 1． 000 0． 260
R 0． 372 0． 531 0． 235 0． 698 0． 218 0． 482 0． 471 0． 456 0． 441 0． 260 1． 000
注:表中编号均为所分离内生真菌菌株的编号，下同。
983第 4 期 胡凤，等．毛脉酸模内生真菌分布特征及其优势菌群化学成分相似度分析
从毛脉酸模根、叶中共分离得到 10 株曲霉属
内生真菌，占全部内生真菌菌株的 23． 8%。菌
S2、S3、S15、S48、S51 是从毛脉酸模根中分离得到，
菌 S7、S9、S10、S14、S18 是从毛脉酸模叶中分离得
到。由表 3 可知，菌 S2 与菌 S48 的相似度为
0． 822，菌 S9 与菌 S10 的相似度为 0． 725，菌 S14
与菌 S18 的相似度为 0． 757，菌 S3 与菌 S15 的相
似度为 0． 881，都在 0． 7 以上。可见，曲霉属内生
真菌中相似度较高的菌株都是从毛脉酸模的同一
组织中分离得到的。
表 4 链格孢属内生真菌化学成分相似度结果
Table 4 The similarity of the chemical constituents of the Alternaria strains
S6 S11 S41 S47 S16 S22 S32 S49 S52 R
S6 1． 000 0． 116 0． 403 0． 712 0． 104 0． 491 0． 424 0． 112 0． 444 0． 711
S11 0． 116 1． 000 0． 921 0． 110 0． 111 0． 133 0． 106 0． 310 0． 117 0． 138
S41 0． 403 0． 921 1． 000 0． 107 0． 362 0． 409 0． 465 0． 107 0． 114 0． 813
S47 0． 712 0． 110 0． 107 1． 000 0． 108 0． 113 0． 109 0． 103 0． 107 0． 132
S16 0． 104 0． 111 0． 362 0． 108 1． 000 0． 103 0． 303 0． 108 0． 361 0． 596
S22 0． 491 0． 133 0． 409 0． 113 0． 103 1． 000 0． 632 0． 113 0． 457 0． 713
S32 0． 424 0． 106 0． 465 0． 109 0． 303 0． 632 1． 000 0． 309 0． 853 0． 865
S49 0． 112 0． 310 0． 107 0． 103 0． 108 0． 113 0． 309 1． 000 0． 307 0． 132
S52 0． 444 0． 117 0． 114 0． 107 0． 361 0． 457 0． 853 0． 307 1． 000 0． 832
R 0． 711 0． 138 0． 813 0． 132 0． 596 0． 713 0． 865 0． 132 0． 832 1． 000
从毛脉酸模根、叶中共分离得到 9 株链格孢属
内生真菌，占全部内生真菌菌株数的 21． 4%。菌
S6、S11、S41、S47 是从毛脉酸模根中分离得到，菌
S16、S22、S32、S49 和 S52 是从毛脉酸模叶中分离
得到。由表 4 可知，相似度较高的菌株有:菌 S6
和菌 S47 相似度为 0． 712;菌 S11 和菌 S41 相似度
为 0． 921;菌 S32 和菌 S52 相似度为 0． 853;菌 S32
和菌 S22 相似度是 0． 632。可见，链格孢属内生真
菌中相似度较高的菌株都是从毛脉酸模的同一组
织中分离得到的。
表 5 丝核属内生真菌化学成分相似度结果
Table 5 The similarity of the chemical constituents of the Rhizoctonia strains
S19 S36 S37 S39 S45 S40 S43 R
S19 1． 000 0． 126 0． 789 0． 380 0． 737 0． 447 0． 471 0． 596
S36 0． 126 1． 000 0． 159 0． 177 0． 125 0． 113 0． 742 0． 313
S37 0． 789 0． 159 1． 000 0． 420 0． 861 0． 134 0． 184 0． 367
S39 0． 380 0． 177 0． 420 1． 000 0． 406 0． 477 0． 370 0． 745
S45 0． 737 0． 125 0． 861 0． 406 1． 000 0． 331 0． 487 0． 890
S40 0． 447 0． 113 0． 134 0． 477 0． 331 1． 000 0． 372 0． 861
S43 0． 471 0． 742 0． 184 0． 370 0． 487 0． 372 1． 000 0． 871
R 0． 596 0． 313 0． 367 0． 745 0． 890 0． 861 0． 871 1． 000
已从毛脉酸模茎、叶中共分离得到 7 株丝核
属内生真菌，占全部内生真菌菌株数的 16． 7%。
菌 S19、S36、S37、S39、S45 是从毛脉酸模叶中分离
得到，菌 S40 和菌 S43 从毛脉酸模茎中分离得到。
由表 5 可知，菌 S19 和菌 S37 的相似度为 0． 789，
菌 S19 和菌 S45 的相似度为 0． 737，菌 S37 和菌
S45 的相似度为 0． 861，菌 S36 和菌 S43 的相似度
为 0． 742。可见，除菌 S36 和菌 S43 外，丝核属内
生真菌中相似度较高的菌株都是从毛脉酸模的叶
中分离得到。
4 讨论
本研究采用组织块分离法，共从 1 年生毛脉酸
模内分离得到 42 株内生真菌，结果表明毛脉酸模
内生真菌具有一定的多样性。与本课题组从同一
地区产的狭叶柴胡分离得到的内生真菌［8］相比
093 广东药学院学报 第 28 卷
较，二者的内生真菌种类存在一定差异。例如，柱
格孢属、小尾孢属、木霉属、丝核属均未见于狭叶
柴胡内生真菌，而狭叶柴胡中数量较多的毛霉属
真菌在毛脉酸模中也未分离得到，这表明部分毛
脉酸模内生真菌可能存在一定的宿主专一性，这
尚需进一步的侵染实验作为验证。通过比较 1 年
生毛脉酸模根、茎、叶中内生真菌数量可以看出，
根中内生真菌较多，且各种属数目差别并不大，优
势菌群并不明显;叶中内生真菌数量虽然也较多，
但其种属数目较少，且 3 种优势种群数量基本一
致;而茎中内生真菌无论在数量还是种类上均较
根与叶有较大的差距。另外，各部位内生真菌的
种属比例与毛脉酸模总内生真菌中相应种属所占
比例也存在较大差异，表明毛脉酸模内生真菌分
布存在一定的组织差异性与专一性，其原因可能
是不同部位的组织结构、生长发育特征、所含营养
物质等均存在差异，从而对内生真菌的侵染与定
植造成影响［9］。现有研究表明植物材料的采集地
点、气候环境、年龄等均对分离结果有一定的影
响［10］，但本文仅对秋季(10 月份)采收的 1 年生毛
脉酸模内生真菌分布特征进行了分析，对于不同
产地及不同生长期的毛脉酸模内生真菌的动态分
析，将在后续研究中进行报道。
曲霉属、链格孢属与丝核属真菌是 1 年生毛脉
酸模内生真菌的优势菌群，三者共占到内生真菌
分离总株数的 61． 9%，对其进行化学成分相似度
分析具有一定的代表性。本研究采用 HPLC 法对
各菌的乙酸乙酯提取物进行了比较分析，结果表
明同属的不同菌种的化学成分存在差异;而在相
同菌属中，分离自同一组织部位的内生真菌化学
成分相似度明显高于分离自不同组织部位的内生
真菌。这表明同一组织部位的内生真菌的次生代
谢产物出现了“趋同”的倾向，提示“内生真菌能够
产生与宿主相同或相似的化学成分”，可能是“协
同进化”［11］的结果，其确切分子机制还有待进一
步研究。此外，本文所采用的 HPLC 方法虽然是目
前内生真菌化学成分研究的通用方法［12］，且具有
高效、快速、灵敏等特点;但它是基于化学成分的
极性差异而不是具体化合物结构差异来区分不同
成分的，因此可能导致在分析过程中，某些化合物
相似度较高仅仅是因为极性相似，而不是因为结构
相同或生物合成途径相关。这就使得相似度分值的
准确性受到了影响。LC-MS 以及 LC-MS /MS 的应
用将有助于提高结果的准确性，我们将在随后的工
作中选择代表性较强的内生真菌进行相关研究。
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( 责任编辑: 刘晓涵)
193第 4 期 胡凤，等．毛脉酸模内生真菌分布特征及其优势菌群化学成分相似度分析