全 文 ：14 生 物 学 通 报 2013 年 第 48 卷 第 10 期
简单序列重复区间扩增多态性 （inter-simple
sequence repeats，ISSR）是由加拿大 Zietkiewicz 等
人在微卫星分子标记（SSR）基础上创建的一种分
子标记技术 ［1－2］。 该技术无需预先克隆和测序，兼
具 RAPD 技术与 SSR 技术优点。 不但成本低、操
作简单，且灵敏度高、检测基因组的多态性强。 目
前已在生物的种质鉴定、遗传多样性检测、基因定
位及遗传图谱等方面得到广泛的应用 ［3］。
观光木（Tsoongiodendron odorum Chun）别名观
光木兰、宿轴木兰、香花木，属于木兰科观光木属
植物，该属只有 1 种且为我国特有，是我国特有的
古老孑遗树种，对研究古代植物区系、古代地理、
古代气候都有重要的科学价值。 观光木产于我国
北纬 26°以南的热带和亚热带山区， 未见成片林
分布，多零星分布于常绿阔叶疏林中（或林缘）或
散生于山区村庄和房前屋后的山坡上 ［4］。 本实验
使用 ISSR 分子标记技术分析江西、广东等地观光
木种群的遗传多样性、基因遗传距离、基因流以及
群体的遗传分化等， 从分子水平上揭示观光木种
群的遗传特性， 为观光木的保护和研究提供一定
的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料 分单株采集幼嫩叶片，然后迅速放入
装有硅胶的封口袋中干燥保存 ［5］，带回实验室置
于-70℃冰箱中保存备用。 为保证样本的代表性，
尽量扩大样本数量， 同时两两样株间保持一定距
离，采样地及数量见表 1。
表 1 10 个观光木群体的产地 、采样编号及采样数
主要试剂： 十二烷基硫酸钠 （sodium dodecyl
sulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化胺（cetyl triethyl
ammonium bromide,CTAB）、Tris 碱、乙二胺四乙酸二
钠 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA－2Na）、
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巯基乙醇，均为分子生
物学纯或分析纯级别，Taq DNA 聚合酶、EcoRⅠ、
RNaseA、GeneRuler TM200 bp plus DNA Ladder 和
1 kb DNA Ladder 购自 Fermentas 公司 ，ISSR 随机
观光木种群遗传多样性的 ISSR研究*
陈 建 曹福祥** 魏小玲
（中南林业科技大学 湖南长沙 410004）
摘要 使用单因素筛选和均匀设计实验建立并优化了观光木 ISSR-PCR 的最佳反应体系，
从 100 条 ISSR 引物中筛选出 8 条多态性好、扩增稳定的 ISSR 引物，106 份材料共扩增出 121 条
条带，其中 109 条呈现多态性，多态位点百分率（PPB）达 90.08%。 扩增片段为 250~2 000 bp，平
均每个引物扩增出 15 条片段， 说明观光木种群间存在丰富的遗传多样性。 观光木种群间的
Nei’s 基因多样性指数（He）=0.3557，Shannon 信息指数（I）=0.5276，种群间的分化系数（Gst）＝
0.6480，而种群内的 He=0.1261，I=0.1939，Gst＝0.3520，说明观光木种群间的遗传多样性是观光
木遗传变异的主要来源。
关键词 观光木 ISSR 遗传多样性
中国图书分类号：Q346 文献标识码：A
*基金项目：国家林业公益行业科研专项子项目 ,中国森林对气候变化的影响与林业适应对策研究 （200804001）
**通讯作者
产地 编号 数量
江西九连山自然保护区 （JB）
江西九连山古坑林场 （JG）
江西省崇义县林场 （CY）
江西省大余县长潭里林场 （DY）
江西省赣南树木园 （GN）
湖南省新宁县林场 （XN）
中南林业科技大学 （LD）
湖南省植物园（SZ）
海南五指山自然保护区 （WZ）
福建牛姆林自然保护区 （NM）
1～10
11～29
30～41
42～49
50～57
58～69
70～74
75～86
87～96
97～106
10
19
12
8
8
12
5
12
10
10
2013年 第 48 卷 第 10 期 生 物 学 通 报 15
引物由上海生物工程技术有限公司合成。
3×CTAB 缓冲液 ： 在 800 mL 双蒸水中加入
CTAB 30 g，NaCl 70.13 g，完全溶解后加入 1 mol/L
Tris-HCl（pH 8.0）75 mL，0.5 mol/L EDTA 30 mL，
PVP 15 g，用双蒸水定容至 1 L，分装备用 ，在使
用时加入 2% β－巯基乙醇。
1.2 方法
1.2.1 观光木 DNA 的提取 参照常规 CTAB 方
法并作适当改进。 1）在研磨时加入少量聚乙烯吡
咯烷酮 ；2）提高提取缓冲液中 β－巯基乙醇的浓
度；3）采用 3×CTAB 提取缓冲液，使材料与缓冲液
充分反应 ；4）提高 NaCl 溶液浓度 ，延长 RNaseA
的消化时间 ；5）最后用琼脂糖凝胶电泳法检测
DNA 浓度。
1.2.2 ISSR-PCR 反应体系 通过单因素和均匀
设计实验得到扩增效果较好的反应体系（20 μL）。
组 分 包 括 ：10 ×PCR Buffer 2 μL， 模 板 DNA
1 μL （20 ng/μL），Taq DNA 聚 合 酶 1 μL，引 物
0.6 μL，Mg2 + 1.6 μL 和 dNTP 1.6 μL， 最 后 用
ddH2O 补足 20 μL。
1.2.3 ISSR-PCR 扩增反应随机引物的筛选 利
用优化后的反应体系， 通过筛选得到 8 条扩增条
带清晰、多态性较高、重复性较好的引物。 设置退
火温度梯度进行 PCR 扩增，各得到 8 条引物的最
适退火温度。
1.2.4 ISSR-PCR 扩增 以提取的所有观光木基
因组 DNA 为模板，ISSR 最佳反应体系、扩增程序
以及筛选出的引物， 分别对所有 DNA 样品进行
ISSR-PCR 扩增，通过琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像
系统拍照，得到所有 DNA 样品的扩增图像。
1.2.5 数据统计 根据琼脂糖凝胶电泳结果进
行人工记录清晰可重复的条带， 对于同一引物的
扩增产物，迁移率相同的条带记为 1 个位点，扩增
阳性（有条带出现）记为“1”，扩增阴性（无条带出
现）记为“0”。 应用 POPGENE32 软件对全部群体
和单个群体进行遗传参数分析 。 并利用 POP-
GENE32 软件计算 Nei’s 遗传一致度和遗传距离，
根据遗传一致度， 采用 UPGMA 法分析群体间的
遗传关系 ［6］。
2 结果与分析
2.1 观光木种群样品的多样性分析 使用 ISSR
最佳反应体系和扩增程序以及筛选出的 8 条 IS-
SR 引物，对观光木种群的 106 份样品进行多态性
分析，得出 ISSR-PCR 扩增结果 （引物 U810 扩增
结果如图 1 所示，见封三）：8 个引物共检测出 121
条片段，其中多态性谱带为 109 条，多态性比率为
90.08％，扩增片段长 250~2 000 bp，说明观光木
种群内蕴藏了丰富的遗传变异， 具有较高的遗传
稳定性。 其中每条引物扩增出 10~18 条多态性片
段， 扩增位点最多的是引物 UBC846， 位点数为
18； 扩增位点最少的是引物 UBC810， 位点数为
11，平均每条引物扩增出 15 条片段。
多样性指数（Shannon 指数，Ⅰ）通常用以表示
种群内和种群间的遗传变异程度。Shannon 遗传多
样性分析结果显示（表 2），在 10 个种群中，Shan-
non 遗传多样性指数以 DY（江西省大余县长潭里
林场）观光木种群最低，WZ（海南五指山自然保护
区）观光木种群最高。种群内平均遗传多样性指数
为 0.1940， 种群间的平均遗传多样性指数为
0.5276， 即种群间和种群内的遗传多样性所占的
比例分别为：63.23%和 36.77%。
Nei 遗传分化指数（H）是衡量种群遗传分化最
常用的指标， 表示在总的遗传变异中种群间变异
所占的比例。 本研究结果显示，WZ 观光木种群具
有稍高的遗传多样性，DY 观光木种群最低。 种的
平均遗传分化指数为 0.3557， 种内平均遗传分化
指数 （Gst）为 0.1261，种群间的遗传分化指数为
0.6480，即种群间的遗传变异占总变异的 64.80%。
由此可见，Nei 指数和 Shannon 信息指数都显示出
大量的分子变异存在于观光木种群之间。
2.2 观光木种群的聚类分析 利用 8 个 ISSR 引
物产生的 121 条多态片段计算种群间的遗传距
离，获得的遗传距离系数矩阵见表 3。 表中数据得
出 ：10 个观光木种群间的遗传距离为 0.1933 ~
0.5347，平均距离 0.34。 其中 JB（江西九连山自然
保护区 ）与 XN（湖南省新宁县林场 ）以及 CY（江
表 2 观光木种群的遗传多样性统计分析
样本数 多态位点数 多态位点百分比 观测等位基因数 有效等位基因数 Nei’s 基因多样度 Shannon 信息指数
平均值 106 109 90.08% 1.9835 1.6156 0.3557 0.5276
标准差 0.1280 0.3025 0.1389 0.1752
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西省崇义县林场）与 DY（江西省大余县长潭里林
场 ）的观光木种群 间 的 遗 传 距 离 最 小 （Dmin =
0.1933）， 说明它们之间存在较近的亲缘关系；JB
和 NM（福建牛姆林自然保护区）的观光木种群间
的遗传距离最大 （Dmax=0.5347），说明它们彼此间
存在较大的遗传差异。
基于 ISSR 指纹的 UPGMA 聚类结果如图 2 所
示，10 个观光木种群划分为 3 支： 包括 2 个大类
群和 1 个独立组。
第一大类群包括 JB、XN、JK（江西九连山古坑
林场）、SZ（湖南省植物园）、LD（中南林业科技大
学）等 5 个种群。
图 2 观光木种群的亲缘关系聚类分析图
第二大类群包括 CY、DY、GN（江西赣南树木
园）以及 NM 等 4 个种群。
独立组：WZ 的观光木种群游离于两大类群之
外，与其他品种的亲缘关系都较远，显示其独特的
遗传特性，形成了独立组。
3 讨论
3.1 观光木种群的遗传多样性水平 遗传多样
性是物种长期进化的产物， 是种群生存和发展的
前提。 不同的物种在遗传变异分布格局上也存在
着差异， 有些植物的遗传变异主要存在于种群之
内，如向振勇等 ［7］揭示了云南小桐子的遗传变异
主要存在于居群内，占总变异的 63.50%；杨传平
等 ［8］对西伯利亚红松 19 个种源的遗传多样性分
析表明种群内的基因多样性占总群体的 67.02%，
种群间占 32.98% 。 也有一些植物的遗传变异
主要存在于种群间，如金花茶 ［9］基因分化系数为
0.5752，遗传变异主要存在于种群间；彭云滔等 ［10］
研究的野生罗汉果的种群间也产生了较大的遗传
分化（Gst=0.569）。
本研究从结果看出观光木种群内变异水平小
于种群间的变异水平。 因为观光木为木兰科单种
属植物，种群小而且分布广泛，不能与其他种属进
行杂交，只有通过自交遗传的方式进行繁衍，因此
种群内的遗传变异来源很少 。 种群间的基因流
Nm 为 0.2715<1，说明种群间的地理隔离大，基因
交流有限也导致观光木种群内的遗传变异小。
不同种群间遗传变异大小可以在某种程度上
说明该生物对不同环境适应的广泛程度。 本研究揭
示观光木遗传多样性的特点 ：观光木种群的多
态位点比率占 90.08%， 说明观光木的不同种群内
蕴藏了丰富的遗传变异， 保持较高的遗传稳定性，
对环境具有很强的适应能力。 同时，种群内多态位
点百分率、Nei’s 基因多样性指数和 Shannon 多样
性指数的平均值均小于种群间的值，种群间的遗传
变异占总遗传变异的 64.80%， 说明种群间的遗传
表 3 Nei’s（1979）遗传一致度（右上）和遗传距离（左下）
PopID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
*****
0.2682
0.3921
0.3864
0.4792
0.1933
0.3134
0.3735
0.4615
0.5347
0.7647
*****
0.3313
0.3747
0.3942
0.2848
0.34
0.3879
0.3399
0.3786
0.6756
0.718
*****
0.1933
0.2801
0.2735
0.3129
0.3846
0.4633
0.2816
0.6795
0.6875
0.8242
*****
0.2134
0.3195
0.3784
0.3647
0.4383
0.3828
0.6193
0.6742
0.7557
0.8079
*****
0.292
0.3237
0.2644
0.362
0.359
0.8243
0.7422
0.7607
0.7265
0.7468
*****
0.2695
0.213
0.3676
0.3797
0.731
0.7118
0.7313
0.685
0.7234
0.7638
*****
0.2816
0.4289
0.5184
0.6883
0.6785
0.6808
0.6944
0.7677
0.8082
0.7546
*****
0.4072
0.5143
0.6303
0.7118
0.6292
0.6451
0.6963
0.6924
0.6513
0.6655
*****
0.3574
0.5858
0.6848
0.7546
0.6819
0.6984
0.6841
0.5955
0.5979
0.6995
*****
2013年 第 48 卷 第 10 期 生 物 学 通 报 17
变异是观光木种群遗传多样性的主要变异来源。
3.2 观光木种群的聚类分析 基于 ISSR 指纹的
UPGMA 聚类结果显示 10 个观光木种群被聚合成
2 个大类群和 1 个独立组。 湖南新宁的种群（引种
于江西九连山）与江西九连山保护区的种群遗传距
离最近，遗传相似性高而聚为一类，说明引种的观
光木，能够适应当地的环境条件，遗传变异小，可能
是由于新宁的种群小，分布零散，种群内基因交流
少，导致种群内的遗传分化小，这与它们遗传背景
的一致性相符合。湖南省植物园与中南林业科技大
学的观光木种群引种于新宁， 在聚类分析中，2 个
种群的遗传距离近而划为一类，与湖南新宁和江西
九连山保护区种群的遗传相似性高而划为第一大
类中。说明同一种源的观光木在引种后遗传多样性
的变化较小，而人工栽培的种群由于其环境条件的
优越性，对物种的保护好，种群较大而集中，可能是
导致该种群与引种源产生遗传分化的原因。
江西省崇义县林场（人造观光木林）与大余县
长潭里林场的遗传距离较近聚为一类， 江西省赣
南树木园与大余县长潭里林场和崇义县林场聚为
一大类， 说明了地理隔离较小的种群也有较近的
亲缘关系。
海南五指山保护区的种群较小， 零散分布于
海拔 1 000~1 200 m 处， 叶片的形状和大小与其
他种群有较大的差别，其叶片大，顶端急尖，生长
环境和气候条件与其他种群也有很大的差别 ，在
聚类分析中，该种群与其他种群的遗传距离较远，
相似系数低，独自划为一类。热带与亚热带气候的
差异，以及海拔分布的差异，导致观光木种群在形
态和基因结构上都与其他种群产生较大的差异。
3.3 观光木保护生物学上的意义 植物群体的遗
传变异水平和群体遗传结构是其进化历史、 分布
范围、生活型、繁育方式、种子散布机制等各种不
同因素综合作用的结果， 与其适应性和进化潜力
密切相关， 故检测植物的遗传变异水平及其空间
结构，是探讨各种进化因素的前提，同时关系到物
种保护和复壮的策略与措施的制定 ［11］。 不同物种
的多样性水平和居群遗传结构会有很大的不同 ，
对一个物种应采取何种保护策略和措施， 必须建
立在对该物种群体遗传学研究的前提下 ［12］。
本研究结果表明观光木种群间的变异大于种
群内的， 并且不同分布地区出现了明显的遗传分
化，说明该植物对环境的适应能力较强。遗传多样
性不是造成观光木濒危的主要原因， 观光木人工
林栽培的成功也是一个很好的印证。 在观光木采
样过程中， 相关人员了解到观光木种群在急剧减
少，对观光木种群的保护没有得到重视，当地居民
也缺乏保护意识， 只有在保护区内尚可见零散分
布的观光木。同时，成年的观光木也因遭大量砍伐
导致数量越来越少，而其自然更新困难，人为因素
干扰频繁，观光木的幼苗数量很少。观光木自然种
群面临着灭绝的危险。因此，对观光木的保护首先
需要加强宣传教育， 提高民众对观光木的保护意
识，加强保护力度，使其生境不受破坏。 对本种的
保护还应着重在开花、结种、种子出芽和幼苗成长
等环节上，促进其自然更新。 同时，应加强异地引
种，扩大观光木人工林栽培面积。
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（E-mail:csfucao@163.com.）