全 文 ：[成分分析]
HPLC制备河套大黄中多羟基芪类化合物 Rhapontin
陈志强1 , 　张文懿2 , 　张学良2 , 　张庆林1 , 　吴祖泽1
(1.军事医学科学院放射医学研究所 ,北京 100850;2.固原市药品检验所 ,宁夏 固原 756000)
收稿日期:2003-12-07
作者简介:陈志强(1972～ ),男 ,天津市人 ,博士生 ,主要从事天然产物化学及药物分析研究。电话:010-68158312。
关键词:河套大黄;Rhapontin;HPLC 分离制备
摘要:目的:分离纯化河套大黄药材活性成分 Rhapontin , 建立测定 Rhapontin 含量的高效液相色谱法。方法:采用亲脂性
吸附树脂与制备型 RP-HPLC 组合分离技术 , 将河套大黄药材乙醇粗提物经亲脂性吸附树脂柱预分离 , 然后由制备型
RP-HPLC 纯化精制。 Rhapontin 的测定以 Kromasil ODS(250×4.6mm , 5μm)为固定相 , 甲醇-水(60∶40)为流动相 , 紫外
检测波长为 320nm。结果:产品经熔点 、EI-MS、IR、UV、1HNM R、13CNMR 和 HPLC 图谱鉴定 ,并与文献 、标准对照品比
较 ,证明为 Rhapontin ,纯度>98%。 RP-HPLC 检测的线性范围为 0.408～ 4.08μg(r =0.9999)。结论:RP-HPLC 检测方
法可用于从河套大黄药材中制备 Rhapontin 的质量控制 ,所建立的制备力法简单 , 重复性好 , 采用的溶剂系统价廉易得。
中图分类号:R284.2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2004)11-0932-02
Preparative separation of polyhydrostilbenes Rhapontin from Rhapontineum ho-
taoense C.Y.Cheng et C.T.Kao.by HPLC
CHEN Zhi-qiang1 , 　ZHANG Wen-yi2 , 　ZHANG Xue-liang2 , 　ZHANG Qing-lin1 , 　WU Zu-ze1
(1 .Insti tute of Radiation Medicine , Academy of Mi li tary Medica l Sciences , Beij ing 100850 , Ch ina;2.Guyuan Insti tu te for Drug Control ,
Ningxia 756000 , Ch ina)
KEY WORDS:Rhapontineum hotaoense C.Y.Cheng et C.T .Kao;Rhapontin;HPLC;separat ion and
preparat ion
ABSTRACT:AIM:To isolate and purify the active substance Rhapontin from Rhapontineum hotaoense C.Y.
Cheng et C.T .Kao and develop a HPLC for quantify ing Rhapontin.METHODS:Combined lipophilic adsorp-
tion resin and preparative RP-HPLC , the ethanol ex tractof R .hotaoense C.Y.Cheng et C.T .Kao w as pre-
isolated by lipophilic adso rption resin , and the enriched ext ract w as purif ied to give 3 , 3′, 5-t rihydro xy-4′-
methyloxystilbene-3-O-β-D-g lucoside by preparative RP-HPLC.RESULTS:By contrasting w ith the li terature
data and standard substance , The 3 , 3′, 5-t rihydroxy-4′-methylo xystilbene-3-O-β-D-glucoside w as ident if ied by
El-MS , IR , UV , 1HNMR , 13CNMR , HPLC and melting point.The final purity of this product is >98%.
CONCLUSION:The developed RP-HPLC is simple , reproducible and easy to operate , and can be used for the
quality control of preparing Rhapontin f rom R .hotaoense C.Y.Cheng et C.T .Kao , and the solvent is inex-
pensive.
　　河套大黄为蓼科(Polygonaceae)大黄属(Rhapontineum)
波叶组(Sect.Rhapontinapontica)植物 Rhapontineum ho-
taoense C.Y Cheng e t C.T.Kao.的根和根茎[ 1] , 主含蒽醌类
成分 , 同时含有荧光极强的多羟基芪类化合物(polyhydros-
tilbenes , 简称 PHS)成分 Rhapontin。 近年来大量的研究发
现 ,除早已知道的抗菌作用以外 , PHS 类成分还有扩张毛细
血管改善微循环[ 2] 、降血脂 、降血糖[ 3] 、抗肿瘤 、抑制过敏反
应 、调控机体免疫防御系统 、抗血栓以及抗氧化等作用。为
深入研究 PHS 类化合物的生物活性 , 开发 PHS 类新药 ,均需
要制备大量的 PHS 类化合物单体 , 因此 ,研究 PHS 类化合物
Rhapontin 的高效分离纯化方法具有重要的意义。
制备型 HPLC 具有可快速 、较大量地制备纯度高物质的
特点 , 作者首先将河套大黄粗提取物用亲脂性大孔树脂 AB-
8 柱预处理后 ,在由制备型 HPLC 纯化精制 , 从而分离得到
高纯度的产品———PHS 类化合物 Rhapontin。
1　仪器与材料
Waters 600E 高效液相色谱仪 , 配有 996 型 PDA紫外检
测器 , 717plus 自动进样系统;Millennium32色谱管理系统;
JNM-ECA-400 超导 NMR仪;Zabspec质谱仪;亲脂性大孔吸
附树脂 AB-8购自南开大学化工厂;甲醇(色谱纯);乙腈(色
谱纯);超纯水 , 其它试剂均为分析纯。
2　方法与结果
932
2004 年 11 月
第 26 卷　第 11期
中 成 药
Chinese T raditional Patent Medicine
November 2004
Vol.26　No.11
2.1　HPLC 检测条件　色谱柱:大连国家色谱研究分析中
心KromasilTM C18分析柱(250mm×4.6mm , 5μm);流动相:
甲醇-乙腈-水(35∶5∶60);检测波长:320nm;流速 1mL·
min-1;进样量:2μL;温度:25°C。
2.2　HPLC 制备条件 　色谱柱:Bondapak® PrepLCTM制备柱
(100mm×40mm , 15 ～ 20μm):流动相:甲醇-水(60∶40);检测
波长:320nm;;流速 15mL·min-1;进样量:2mL;温度:25°C。
2.3　Rhapontin 的提取和纯化 　取河套大黄根茎 , 干燥 , 粉
碎 ,过 200 目筛 ,加入 95%乙醇(固液比 1∶7)索氏提取器提
取 ,薄层层析检测提取程度 , 至对照品位置无蓝色荧光。冷
却 ,过滤 ,加入氯化钙固体过量 , 滴加 5% NaOH 溶液至 pH
为9 ,放置过夜 。过滤 , 滤液减压浓缩 , 得 Rhapontin 粗品。
粗品加水溶解 ,水液装入 AB-8 大孔吸附树脂柱中 ,进行柱层
析分离 , 以乙醇-水混合液梯度洗脱 , 混合液中水从 100%变
化到 5%, 同时乙醇从 0 变化到 95%。 50mL 分段收集 ,
HPLC 检测 ,合并浓缩主要含 Rhapontin 的流份。 将上步产
品溶于适量 40%丙酮-水中 , 重结晶 2 次 , 室温放置 , 得到白
色针状结晶 。接上步产品溶于适量 50%甲醇-水中 , 直接经
过 RP-HPLC 纯化 , 适当浓缩 , 冷冻干燥 , 得到 Rhapontin 白
色针状结晶。
2.4　HPLC 测定方法
2.4.1　标准曲线及线性范围:精密称取 Rhapontin 标准品
5.10mg ,置 25mL 量瓶中 , 加甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 ,
作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液 2 , 4 , 6 , 8 , 10 , 20μL
按照上述色谱条件测定 , 以峰面积为纵坐标 , 进样量为横坐
标作标准曲线 , 得回归方程为 Y =0.40 +4112.30X , r =
0.9999。结果表明 , 进样量在 0.408 ～ 4.08μg 峰面积与进样
量呈良好线性。
2.4.2　精密度试验　精密吸取对照品溶液分别进样 5 次 ,
每次10μL ,测得各次峰面积积分值 , 计算 RSD=0.337%,表
明仪器精密度良好。
2.4.3　重复性试验　精密量取供试品溶液 1mL , 共量取 5
份 ,置 5mL量瓶中 , 加甲醇稀释至刻度 , 摇匀 , 按照上述色谱
条件测定 , Rhapontin 含量的 RSD =1.37%。
2.5　HPLC 制备分离结果及产品鉴定 　HPLC 制备分离结
果见表 1 , 制备色谱图见图 1。
表 1　 制备型 RP-HPLC的分离效果
组别 质量(mg) 纯度(%) 提取率(%)
分离前 90.4 66.3 -
分离后 59.5 99.4 98.7
1-Rhaponton　2-desoxyrhaponton
图 1　Rhaponton的制备型 RP-HPLC图谱
Fig.1　Chart of Rhapontin by preparative RP-HPLC
　　分离纯化得到的物质为白色针状结晶 ,熔点为 228°C ～
230°C , 硅胶薄层板上紫外灯下照射呈强蓝紫色荧光 ,Molish
反应阳性。 UVλMeOHmax nm:221 , 305 , 324;质谱分析测定得分子
量为 420 , 推测分子式为 C21 H24 O9 。 1HNMR(DMSO-d6)
δppm:7.07(1H , d , J=2.0Hz ,H-2′), 7.02(1H , d , J=16.5Hz ,
H-β), 6.96(1H , dd , J=2.0/ 8.3Hz ,H-6′), 6.90(1H , d , J=7.
9Hz ,H-5′), 6.89(1H , d ,H=16.5Hz ,H-α), 6.77(1H , Br.s , H-
2), 6.66(1H , Br.s , H-2), 6.48(1H , t , J=1.8Hz , H-4), 4.90
(1H , d , J=7.7Hz , anomeric-H), 3.82(3H , s ,-OCH3), 4.0-3.3
(sugar-H);13CNMR(DMSO-d6)δppm:agly cone 160.1(C-5),
159.5(C-3), 148.4(C-4′), 147.5(C-3′), 140.5(C-1), 131.5
(C-1′), 129.5(C-β), 127.2(C-α), 119.7(C-6′), 113.3(C-2′),
112.5(C-5′), 108.0(C-2), 106.5(C-6), 103.8(C-4), 56.2(-
OCH3);g lucosyl:101.9(C-1″), 77.7(C-3″, 5″), 74.4(C-2″),
71.1(C-4″), 62.5(C-6″)。 1HNM R和13CNM R数据与文献报
道的数据一致[ 4] 。化合物 Rhapontin鉴定为 3 , 3′, 5-三羟基-
4′-甲氧基芪-3-O-B-D-葡萄糖苷(3 , 3′, 5- trihydroxy-4′-methy-
loxy stilbene-3-O-β-D-g lucoside 即 Rhapontin)。
3　分析与讨论
3.1　在制备 Rhapontin 粗品时 ,在索氏提取器提取浓缩液中
加入氯化钙固体过量 ,滴加 5%NaOH 溶液至 pH 为 9 , 放置
过夜 ,过滤 , 其目的是除去河套大黄药材总提物中所含的大
量蒽醌类化合物。原理是蒽醌类化合物与钙离子在微碱性
条件下会形成蒽醌钙络合物 , 该络合物不溶于水及有机溶
剂 ,可以过滤除去[ 5] , 使滤液中 Rhapontin 的含量相对增高 ,
结晶时所受干扰较小 , 滤液经减压浓缩 , 放置 , 即析出得到
Rhapontin 粗品。
3.2　本实验以河套大黄干燥根茎为原料 ,采用乙醇提取 、预
处理 、大孔树脂纯化 、HPLC 制备方法进行了 PHS 类化合物
Rhapontin 的分离纯化研究 ,得出如下结论:利用亲脂性大孔
吸附树脂 AB-8 和制备型 HPLC 组合分离技术 , 能较好地解
决 Rhapontin 在分离纯化过程中性质不稳定的问题 , 初步优
选出批量制备 Rhapontin 的工艺条件。分离所得的 Rhapon-
tin 产品 ,经1HNMR , 13CNMR , IR , UV , EI-MS ,HPLC 和熔点
鉴定以及与对照对照品比较 , 纯度达到 99.37%。
参考文献:
[ 1] 　Cheng J R , Gao Z J.Plant of R hapont ineum in China[ J] .Jour-
nal of Beijing M edical Universi ty (Sup), 1993 , 25(5):9-10.
[ 2] 　Li J L , Wang Z B , Li J S.(S tudy of hypoglycemia ef fect on
Rheum emodi Wall[ J] .Chinese Herbal Medicines , 1998(20),
5:249-250.
[ 3] 　Basu A.The potent ial of protein kinase C as a target of ant icancer
t reatment[ J] .Pharmac Ther , 1993;59:257.
[ 4] 　Matsuda H , Tomohiro N , Hiraba K , et al.Study on anti-Oketsu
activity of rhubarb II.Anti-allergic effects of sti lbene components
f rom Rhei undulati Rhizoma(dried rhizome of Rheum undulatum
cultivated in Korea)[ J] .Biol-Pharm-Bull.2001 , 24(3):264-
267.
[ 5] 　Xia Z N , Zhou C , Sun G Y , et al.Preparing anth raglycosides of
Rheum by ext racting and de-extracting method[ J] .C hinese Tra-
di tionl Patent Medicine , 1999 , 21(9):478-479.
933
2004 年 11 月
第 26 卷　第 11期
中 成 药
Chinese T raditional Patent Medicine
November 2004
Vol.26　No.11