全 文 ：　[收稿日期] 　2010-12-11;2011-05-17修回
　[基金项目] 　河南省创新人才工程项目(2005-126-49);河南科技学院博士基金项目(050106);河南科技学院重点基金项目(050121)
　[作者简介] 　刘会超(1964-),男 ,教授 ,从事观赏植物生物技术研究工作。 E-m ail:liu hc918@yahoo.com.cn
[ 文章编号] 1001-3601(2011)07-0457-0188-04
紫玉兰花粉的生活力测定及贮藏方法
刘会超 , 贾文庆 , 郭艳艳
(河南科技学院 , 河南 新乡 453003)
　　[摘　要] 为了探明紫玉兰花粉生活力测定方法以及适宜的贮藏方法 ,采用离体培养法 、醋酸洋红染色法 、碘-碘化钾染色法和 TTC(氯化三苯基四氮唑)染色法等方法研究了花粉寿命长短与环境条件的关系。
结果表明:4种测定方法中只有离体培养法适用于紫玉兰花粉生活力测定;培养基中添加不同浓度的蔗糖和硼酸对花粉的萌发有促进作用 ,紫玉兰花粉萌发的最适培养基为 2%蔗糖 +0.001%硼酸 ,萌发率达
90.57%;在贮藏 5d的情况下 ,花粉最适宜的贮藏条件为-80℃,不干燥 。[关键词] 紫玉兰;花粉;培养基;染色;贮藏[中图分类号] S567.19 [文献标识码] A
The Determination of Magnolia liliiflora Pollen
Viability and Its Storage Method
LIU Hui-chao , JIA Wen-qing , GUO Yan-yan
(Henan Institute o f Science and Technology , Xinxiang , Henan 453003 , China)
　　Abstract:In order to explo re appropriate sto rag e method and opt imum determinat ion method and
study the relationship be tw een the po llen life and the storage environment , iso lated culture , carmine
acetate dyeing 、I-KI staining and TTC staining methods w ere used to determine the f resh po llen ability of
Magnol ia li li i f lora.The results showed that culture media w ith different concentrat ion of sucro se and
bo ric had good effects on the pollen germination.The pollen germinating pe rcentage reached the highest(90.05%)af ter incubated on the media supplemented w ith 2% sucro se and 0.001%boric acid.The best
condi tions to keep vitality o f pollen is in no t dry environment at -80℃, the sto rag e ability lasted for more
than 5 d.
Key words:Magnolia l il ii f lora;pollen;cul ture;dyeing ;storage
　　紫玉兰(Magnol ia li l ii f lora Desr.), 又名木
兰 、辛夷 ,为木兰科木兰属大型灌木 ,是非常珍贵的
花木 ,一般生长在山坡林缘[ 1] 。紫玉兰花具有很高
的观赏价值和药用价值。花粉是种子植物遗传信息
的载体 ,早期采集 、贮存花粉 、花粉生活力测定是进
行人工辅助授粉或杂交授粉的基础[ 2] 。花粉生活力
对授粉受精有重要影响。不同类群植物花粉在自然
条件下的寿命 、花粉的适宜贮存条件 、营养条件以及
花粉生活力的适宜测定方法均有所差异[ 2] 。掌握花
粉适宜的培养 、贮存条件及生活力检测的方法对于
提高植物育种效率具有较高的实际应用价值 。
目前 ,国内学者主要在繁殖技术[ 3] 、栽培管
理[ 4] 、组培[ 5] 等方面对紫玉兰进行了较为深入的研
究 ,而有关紫玉兰花粉方面的研究尚未见深入报道 。
为此 ,笔者对紫玉兰花粉的生活力及贮藏特性进行
了研究 ,旨在摸索花粉生活力测定的方法 ,进而研究
花粉寿命长短与环境条件的关系 ,探求保存花粉的
合适方法 ,为紫玉兰育种及品种改良提供理论依据 。
1 材料与方法
1.1 材料
2010年 4月 14日上午 9:00-10:00 ,采集紫玉
兰花朵 ,带回实验室后去除花瓣取花药于培养皿内 ,
置于(25±1)℃的培养箱散粉 12 h 后 ,收集花粉放
入 4℃冰箱中贮藏备用。
1.2 方法
1.2.1 紫玉兰花粉形态观察 将干燥花粉和新鲜
花粉涂于黑色导电胶上 ,放在扫描电镜下观察测定。
用扫描电子显微镜(Quanta 200)测定花粉的极轴和
赤道长度 ,并计算 P/E 值;通过扫描电子显微镜照
片观察远极面 、近极面和局部的外壁纹饰 、网眼大小
和网脊宽度 ,测量 、记录数据[ 6-7] 。
1.2.2 最佳培养基筛选 试验采用 2因素(蔗糖 、
硼酸)完全随机设计的方法 ,培养基中蔗糖浓度分别
为 0 、2%、4%、6%、8%、10%;硼酸浓度分别为 0 、
0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%。培养
基均添加琼脂 8g/ L ,pH 5.8。具体步骤:取2滴培养
基于凹玻片上 ,用头发丝蘸取少量花粉均匀散于培养
基上 ,将凹玻片置于铺有 2层湿滤纸的培养皿中 ,在
(25±1)℃的培养箱中培养 12 h后 ,观察统计出萌发
的花粉数和未萌发的花粉数。各处理 3次重复 ,每重
复统计花粉数不少于100粒 ,计算萌发率。
　贵州农业科学　2011 , 39(7):188～ 191　Guizhou Ag ricultural Science s
萌发率/ %=(视野萌发花粉粒数/视野总花粉
粒数)×100
1.2.3 花粉染色法
1)醋酸洋红染色法。取少量花粉于载玻片上 ,加
1滴醋酸洋红溶液 ,盖上盖玻片 ,立刻置于显微镜下观
察。凡被染成深红色的为有生活力的花粉 ,被染成淡
红色的为无生活力的花粉。观察 3张载玻片 ,每片取3
个视野 ,计算有生活力花粉百分率的平均值[ 8] 。
2)I2-KI染色法 。取少量花粉置于载玻片上 ,
加 1滴 I2-KI溶液 ,盖上盖玻片 ,静置 3 ～ 4m in后置
于显微镜下观察。染色后有生活力的花粉呈蓝色 ,
无生活力的花粉无色 。观察 3 张载玻片 ,每片取 3
个视野 ,计算有生活力花粉百分率的平均值[ 9] 。
3)T TC(氯化三苯基四氮唑)染色法 。取少量
花粉放在载玻片上 ,加1滴 0.5%TTC 溶液 ,盖上盖
玻片 ,置 30℃恒温箱中 , 10 ～ 15min 后镜检 。凡被
染成红色的花粉活力强 ,淡红次之 ,无色者为没有活
力或不育花粉。观察 3载玻片 ,每片取 3个视野 ,计
算有生活力花粉百分率的平均值[ 10] 。
1.2.4 不同贮藏条件测定 花药采集后 ,装入离
心管中真空干燥 3h ,然后在以下 6种环境条件下贮
存:A.室温;B.室温(干燥剂干燥);C.4℃;D.4℃
(干燥剂干燥);E.-80℃;F.-80℃(干燥剂干燥)。
贮藏每间隔 1d 、3 d后 ,取出花粉置于试验筛选所得
最佳培养基中培养 , 12 h 后观察统计花粉萌发率 。
花粉耐贮藏力是以待测花粉活力保持时间即待测样
品活力降为零的时间长度来表示。
2 结果与分析
2.1 紫玉兰花粉的形态
经扫描电镜(1600倍)观察 ,花粉粒平均极轴长
42.14μm ,平均赤道轴长 21.68μm , P/E≈2.07 。花
粉均具有远极单萌发沟 、左右对称 、异极 、极面观为
椭圆形或长椭圆形 、侧面观为舟形 、两端较尖;萌发
沟长度直达两端闭合;表面有明显的瘤状突起和粗
颗粒 ,纹饰不明显(图版-1 ～ 3)。干燥花粉的萌发沟
多开裂 ,在扫描电镜下较新鲜花粉清晰(图版-4 、8)。
2.2 离体培养法对紫玉兰花粉萌发的影响
如表 1所示 ,对照与其他处理的差异极显著 ,对
照花粉萌发率最低 ,12 h花粉的萌发率仅为1.61%;
在仅添加蔗糖的培养基中 ,花粉萌发率比对照有显
著提高 ,在蔗糖浓度为 2%时达最大值7.72%,当蔗
糖浓度大于 2%时 ,花粉萌发率呈下降趋势。结果
表明 ,花粉萌发的最适宜蔗糖浓度是 2%;在仅添加
硼酸的培养基中 ,随着硼酸的增多 ,花粉萌发率显著
增多 ,硼酸浓度为 0.001%时 ,花粉的萌发率达最大
值 7.33%,硼酸浓度大于 0.001%时 ,花粉的萌发率
也随之下降 。因此 ,花粉萌发的最适宜的硼酸浓度
为 0.001%。培养基中同时添加不同浓度的蔗糖和
硼酸 ,得出最佳培养基为 2%蔗糖+0.001%硼酸 ,
花粉萌发率达最大值 90.05%。
2.3 不同染色方法对花粉生活力的影响
观察发现 ,用醋酸洋红染色后 ,花粉粒均呈深红
色(有生活力)(图版-5);碘-碘化钾染色后 ,花粉均
染成黄褐色(无生活力)(图版-6);而 T TC 染色后花
粉均未染色(无生活力)(图版-7)。因这 3种染色法
的观察结果均与离体培养法所得的最大萌发率
90.05%有显著差异。所以 ,醋酸洋红染色法 、碘-碘
化钾染色法 、T TC染色法均不能作为测定紫玉兰花
粉生活力的方法 ,只有离体培养法较合适 。
　　注:1～ 3.新鲜花粉;2.花粉侧面;3.花粉极面;4.干燥花粉;5.醋酸洋红染色照片;6.碘-碘化钾染色照片;7.T TC染色照片;
8.花粉萌发照片。
　　Note:1～ 3.f resh pollen;2.side pollen;3.poleo pollen;4.dry pollen;5.photo of carmine acetate dyeing;6.photo of I-KI dyeing;
7.ph oto of T TC staining;8.photos of pollen germinat ion.
图版 紫玉兰花粉的形态及染色结果
Fig.1　Magnolia lilii f lora pollen form and staining photo
·189·　第 7 期 刘会超 等　紫玉兰花粉的生活力测定及贮藏方法
表 1 花粉在完全随机试验中 12 h的萌发状况
Table 1　The condition of pollen germination in the completely random test 12h later %
萌发率
Germination per centag e
蔗糖浓度 Sucro se concentration
0 2 4 6 8 10
硼酸浓度/ % 0.000 61±0.01 7.72±0.02 7.37±0.01 7.27±0.02 6.43±0.04 5.16±0.01
Pq MNOPno M NOPnop MNOPnop NOPnopq OPnopq
Bo ric acid 0.001 7.33±0.00 90.05±0.01 72.31 ±0.07 42.41±0.04 36.94±0.07 28.70±0.10
Concentration MNOPnop Aa Bb GH fg HIhi JKj
0.002 6.99±0.00 57.24±0.06 51.96±0.01 39.61±0.01 28.52±0.01 20.56±0.00
MNOPnop DEd EFe GHIgh JKj Lk
0.003 5.73±0.03 59.99±0.05 46.18±0.04 36.84±0.03 27.87±0.01 12.89±0.00
OPnopq CDcd FG f HIhi JKj MN lm
0.004 3.45±0.00 64.15±0.01 39.62±0.00 28.61±0.00 24.96±0.01 8.98±0.00
OPopq Cc GHIgh JKj KLjk JMNOlmn
0.005 2.63±0.00 57.21±0.04 34.03±0.00 20.67±0.01 13.30±0.01 8.09±0.01
OPpq DEd IJi Lk M l MNOPmno
　注:不同大 、小写字母分别表示在 0.01 、0.05水平上存在差异(下同)。
　Note:Diferent lower ca se and capital le tte rs in the same co lumn indicate the significant lev el at 0.05 and 0.01 level respective-
ly.The same below.
表 2 不同贮藏环境条件下花粉的萌发率
Table 2　Germina tion pe rcentag e of pollen unde r different stor age environment %
时间/d
T ime
常温
Normal
temperature
常温+干燥剂
Normal tem perature and
desiccating agent
4℃
4℃+干燥剂
4℃ and desicca ting
agent
-80℃
-80℃+干燥剂
-80℃ and
de siccating agent
2 1.67±0.03 Cb 2.30±0.02 Cb 28.46±0.19 Aa 26.04±0.15 Aa 22.46±0.08 ABa 0.08±0.06 BCb
5 0.00±0.00 Cb 0.00±0.00 Cb 0.00±0.00 Cb 0.00±0.00 Cb 2.47±0.02 Cb 0.01±0.02 Cb　
2.4 不同贮藏环境条件对花粉生活力的影响
由表 2可以看出 ,在同一贮藏条件下 ,花粉萌发
率随贮藏时间的延长而下降。贮藏 2 d时 , 4℃不干
燥的萌发率最高达 28.46%, -80℃不干燥的萌发
率最低为 22.46%;贮藏 5 d时 ,常温 、4℃贮藏的花
粉都不再萌发 , -80℃不干燥的萌发率仍可达到
2.47%,在干燥的条件下降至 0.01%。故在贮藏
5d的条件下 ,紫玉兰花粉最适宜的贮藏条件为 -
80℃,不干燥。
3 结论与讨论
3.1 紫玉兰花粉的形态观察
本研究所观察到的紫玉兰花粉属于小型花粉 ,
形状为球状花粉。在扫描电镜下外壁较粗糙 ,表面
小穴分布均匀 , 没有网状纹饰。极轴平均长度
40.25 ～ 49.11μm , 赤道轴平均长度在 20.31 ～
23.68μm , P/E 在 1.86 ～ 2.07μm 。紫玉兰花粉外
壁表面纹饰与芮飞燕等[ 6]对红花玉兰等 5个玉兰种
花粉形态观察及分类学意义的观察结果一致 。说
明 ,花粉表面纹饰不会由于地区性差异而发生变化 ,
性状稳定 ,适合推广;但紫玉兰花粉的大小和形状却
存在差异 ,一方面可能是由于地区性差异所致 ,另一
方面可能是在材料处理过程中存在差异所致 。
3.2 离体萌发法对紫玉兰花粉萌发的影响
该研究采用不同浓度配比的蔗糖 、琼脂和硼酸
混合培养基进行花粉萌发离体培养实验研究 ,结果
表明:1)蔗糖对花粉萌发起促进作用 。紫玉兰花
粉萌发所需蔗糖的最佳浓度为 2%,大于这个浓度
花粉萌发率呈下降趋势 ,其原因可能是蔗糖浓度过
高会造成花粉细胞质壁分离 ,从而影响花粉的萌发 ,
而蔗糖浓度适宜时 ,花粉内外的渗透压才能保持平
衡 ,从而可维持花粉正常的生活力 ,有利于萌发[ 13] 。
2)硼对花粉的萌发和花粉管的伸长有促进作
用[ 1 4-15] ,不含硼酸的培养基中花粉萌发率很低 ,最适
宜的硼酸用量为 0.001%,大于这个浓度花粉萌发
率也呈下降趋势。离体萌发法可以模拟自然界中花
粉萌发的柱头环境 ,可视为测定花粉萌发率的最佳
方法。
3.3 染色法对紫玉兰花粉萌发的影响
3.3.1 碘-碘化钾染色法 碘-碘化钾染色法是利
用新鲜的花粉有淀粉积累 ,遇碘呈蓝色反应这一特
性来检测花粉的生活力的 。但有报道[ 16] 认为:某些
植物退化的花粉和失活的花粉也有淀粉积累 ,遇碘
同样呈蓝色反应 ,会造成花粉生活力高的假象。本
试验发现 ,碘-碘化钾染色法测定紫玉兰花粉生活力
结果全无生活力 ,可能是因为这个花粉不含淀粉或
含淀粉量极低难以检测出来 ,这个结果有待进一步
研究。
3.3.2 TTC 染色法 T TC染色法的基本原理是:
当 TTC 渗入细胞后 ,可被呼吸代谢中的还原酶所
还原 ,并由无色的氧化型变成红色的还原型 ,由此来
判断花粉的生活力。但本试验的结果却表明 , T TC
无法使紫玉兰花粉着色 ,可能是紫玉兰花粉自身特
性(如花粉壁的厚薄 ,花粉外壁的组成物质 ,花粉内
各种酶活性的强弱等)的影响所致。
3.3.3 醋酸洋红染色法 具有生活力的花粉的脱
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氢酶 ,在催化去氢的过程中 ,把氢转移到其他的物质
上去 ,使用醋酸洋红与催化过程中产生的氢结合成
红色化合物 ,从而使具有生活力的花粉变为红色 。
但该方法有个缺点 ,当花粉失去活力时间较短时 ,该
酶的活性仍然存在。所以 ,花粉生活力测定时间非
常关键 ,如测定时间偏早 , 该方法的测定结果偏
高[ 17] ,但如果花粉放置时间过长 ,则测定结果偏低 。
所以 ,该方法适合那些花粉生活力丧失后脱氢酶活
性也丧失的植物。本试验结果显示 ,无论是发育良
好的饱满花粉 ,还是发育不良的干瘪花粉 ,均被染成
红色 ,说明该方法所得数据偏高 ,不适合紫玉兰花粉
生活力的检测。
由上可见 ,这 3种染色法都不适合测定紫玉兰
花粉生活力。
3.4 不同贮藏环境条件对花粉生活力的影响
花粉生活力的强弱受遗传因素和环境因素的影
响 ,而影响花粉寿命的关键因子是花粉含水量和贮
藏温度 ,低温 、干燥处理是长期保存花粉的必要条
件[ 18-19] 。试验表明 ,4℃和-80℃低温贮藏条件下花
粉的萌发率比室温贮藏明显要高且这与罗凤霞等对
丁香花粉生命力及贮藏条件的研究结果一致[ 20] 。
而紫玉兰花粉却随着温度的降低不易干燥贮藏 ,这
个结果有待进一步研究 。因此 ,可归纳为紫玉兰花
粉适宜低温 、不干燥贮藏 。
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(责任编辑:王　海)
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