全 文 ：〔收稿日期〕2007-01-22
〔基金项目〕湖南省教育厅科研资助项目(03C292)。
〔作者简介〕刘叶蔓(1975-),女,湖南新化人,讲师,主要从事药用植物生物技术方面的研究。
凹叶厚朴茎段愈伤组织诱导中的褐变控制研究
刘叶蔓,彭 菲,罗跃龙
(湖南中医药大学,湖南 长沙 410007)
〔摘要〕目的 研究愈伤组织诱导过程中的褐变问题。方法:将采集的标本进行外植体灭菌法再接种到培养
基,在培养基中加抗褐变剂,进行防褐变试验。结果 外植体在4℃冰箱冷藏48h的预处理对褐变有较好的控制
效果。在培养基中加入抗褐变剂比加入吸附剂抗褐变效果好,抗褐变剂中 Vc的效果最佳,吸附剂 PVP比活性炭
好。结论 培养条件,以低温遮光处理效果较好,光、温两个因素中,凹叶厚朴对光敏感,遮光能有效抑制褐变。液体
浅层静置培养10d后转入固体培养抗褐变的效果比单纯的固体培养效果好。
〔关键词〕凹叶厚朴;茎段;愈伤组织;褐变控制;冷藏外植体;抗褐变剂;吸附剂;液体浅层静置培养
〔中图分类号〕R282.2 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1000-5633(2007)04-0036-02
Studyonbrowningcontrolincalusinducedbystem
fragmentsofMaganoliabiloba(RehdetWils)cheng
LIUYe-man,PENGFei,LUOYue-long
(TCMUniversityofHunan,Changsha,Hunan410007,China)
〔Abstract〕ObjectiveTostudythebrownstainingofMaganoliabiloba(RehdetWils)cheng
stemfragmentsasexplantsduringinducingthecalus.MethodTheexplantwassterilizedand
inoculatedinaculturemediuminwhichtheanti-brownstainingagentwasadded.ResultsThe
pretreatedexplantsin4℃ for48hwereefectivetocontrolbrownstaining;Theanti-browning
agentaddedintothemediumwerebeterthantheadsorbentsintomedium;VitaminCwasthe
bestmaterialinalanti-browningstainagents,andtheadsorbentPVPwasbeterthanactive
carbon.ConclusionThelow-temperatureisefectiveforthetissuecultureconditions,Maganolia
biloba (RehdetWils)chengissensitivetolightcomparedwithtemperaturefactors,andthe
culturingefectsoftheexplantaremoreefectiveintheshalow-liquidstaticculturefor10
days,comparedwiththatinthesolidonlyculture.
〔Keywords〕Maganoliabiloba(RehdetWils)cheng;stemfragment;calus;browningcon-
trol;refrigeratingexplants;anti-browningmaterials;adsorbent;shalow-liguidstaticculture
凹叶厚朴 Maganoliabiloba(RehdetWils)cheng为木
兰科植物,以干燥根皮及枝皮入药,有燥湿消痰、下气除满功
效,用于治疗湿滞伤中、消化不良、呕吐泻痢、痰饮咳喘等病
症。近年来,凹叶厚朴野生资源濒临枯竭,已被列为国家Ⅲ级
保护植物。刘贤旺等[1]对凹叶厚朴进行了组织培养及愈伤组
织超低温保存的研究,为凹叶厚朴的资源再生和种质保存提
供了宝贵的技术资料和理论依据。在此基础上开展试验,发
现在凹叶厚朴茎段组织培养过程中,褐化现象严重,需要多
次转瓶才能诱导出愈伤组织。鉴于此,笔者专门针对凹叶厚
朴茎段组织培养中出现的褐变现象进行了一系列比较试验,
现报道如下。
1材料与方法
1.1 外植体及培养基
4月底采自湖南省森林植物园,以嫩枝顶芽及稍下的茎段
作外植体。愈伤组织的诱导采用刘贤旺的实验结果,即:B5+
2,4-D2mg/L+6-BA1mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8~6.0。每次处
理10瓶,每瓶5个外植体,外植体大小约为0.6cm×0.6cm。
1.2 方法
1.2.1 外植体灭菌 预处理后的材料用 75%乙醇消毒 30s,
2007年8月第27卷第4期
Aug.2007Vol.27No.4
湖 南 中 医 药 大 学 学 报
JournalofTCM Univ.ofHunan36
处理 褐变率 诱导率
固体培养 40.0 55.0
液体浅层静置培养 28.0 70.0
再用 0.1%升汞溶液浸泡 10min,无菌水冲洗 4次,吸干,在
PVP1g/L溶液中切割,接种到培养基上。
1.2.2 防褐化试验 分 4个方面分别进行,即:外植体预处
理、培养基中加入防褐变剂或吸附剂、培养条件、固体培养和
液体浅层静置培养后再固体培养。外植体预处理:用洗衣粉
清洗,自来水冲洗 1h,沥干后,保鲜膜密封置于 4℃的冷藏
箱分别冷藏 24、48h,设对照为不冷藏。培养基中加抗褐变
剂和吸附剂试验:培养基中加入 Vc(10mg/L)、LH(1g/L)、
巯基乙醇(1mL/L)、PVP(1g/L)、活性炭(2g/L)。培养条件
试验:①低温遮光处理(20℃,遮光 20d后,转入 25℃及
光下,光强 1500LX);②遮光处理(25℃,遮光 20d,转入
25℃及光下,光强 1500LX);③对照(25℃,每天光照 10
h,光强1500LX)。培养基:固体培养,在配好的培养基中加
入 6.5g/L的琼脂;液体浅层静置培养,不加琼脂,瓶内培养
基深度约为 0.4cm,培养 10d后,转入固体培养基中。计算
方法:
诱导率=(形成愈伤组织的外植体块数/接种的外植体块
数)×100%。
褐变率=(褐变的外植体块数/接种的外植体块数)×100%。
2结果
2.1 外植体预处理对褐变的影响
由表 1可看出预冷处理有降低褐变的效果,使褐变率从
对照的45%降低为30%~35%。冷藏时间48h比24h好。
2.2 培养基中加抗褐变剂和吸附剂对褐变的影响
表 2结果看出,抗褐变剂和吸附剂能很明显的防止外植
体的褐变,而且抗褐变剂的效果比吸附剂好,前者褐变率为
10.5%~18%,后者达到20.5%~25.5%。
2.3 培养条件对褐变的影响
表 3实验中,低温遮光处理与遮光处理的抑制褐变率相
差不大,而两者与对照比较,都有较大的差异。由表3的结果
看来,在 20~25℃之间,凹叶厚朴茎段愈伤组织的诱导对温
度要求不严格,而对光敏感。
2.4 固体培养基和液体浅层静置培养
由表 4的结果来看,液体浅层静置培养一段时间后再转
入固体培养基中比单纯固体培养基中的效果要好。
3结论
本文从 4个方面考察了不同处理对凹叶厚朴茎段诱导
愈伤组织中褐变的影响:(1)外植体在 4℃冰箱冷藏 48h的
预处理对褐变有较好的控制效果,这可能与低温状态下,细
胞内多酚氧化酶活性降低以及酚类化合物合成减少有关。
(2)在培养基中加入抗褐变剂和吸附剂,抗褐变剂的效果比吸
附剂好,抗褐变剂中 Vc的效果最佳,其作用机制主要是通过
将多酚氧化酶(PPO)作用下形成的醌类物质重新还原为酚而
减轻褐变[2]61-62,这与前人的试验结果一致[3]。PVP是酚类物质
的专一性吸附剂,在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的
保护剂[4]16-17,防止褐变的效果比无机吸附剂活性炭好。(3)培
养条件以低温遮光处理效果较好,光温两个因素中,凹叶厚
朴对光敏感,遮光能有效抑制褐变,这可能是在黑暗条件下,
阻断了酚类物质的生化合成途径,降低了酚类化合物的含
量,同时抑制了 PPO活性,减轻了酚类物质的氧化有关[4]18,光
照会提高PPO的活性,促进酚类物质的氧化。温度对褐变造成
的影响有两个方面的原因:较低的温度有利于伤口的愈合;另
外,会降低PPO的生物活性,从而减轻褐变[2]63。(4)液体浅层静
置培养 10d后转入固体培养比单纯的固体培养效果好,前
期的液体浅层静置培养使伤口处外溢的酚类物质能迅速扩
散到培养液中去,减轻了醌类物质在外植体四周的聚集,自
体抑制效应减弱。
参考文献:
[1]刘贤旺,杜 勤,赖学文.凹叶厚朴组织培养的研究[J].江西林业科
技,1997,(2):1-4.
[2]于守超,赵兰勇,王 芬,等.植物组织培养中外植体褐变机理研究
进展[J].山东林业科技,2004,(5).
[3]苏梦云,姜景民.乐东拟单性木兰茎段愈伤组织诱导与褐变控制的
研究[J].林业科学研究,2004,17(6):757-762.
[4]崔堂兵,郭 勇,张长远.植物组织培养中褐变现象的产生机理及
克服方法[J].广东农业科学,2001,(3).
处理 褐变率 诱导率
冷藏24h 35.5 63.5
冷藏48h 30.0 68.0
不冷藏 45.0 52.0
表1不同预处理对外植体褐变的影响 (%)
处 理 褐变率 诱导率
Vc(10mg/L) 10.5 85.5
巯基乙醇(1mL/L) 12.5 82.5
LH(1g/L) 18.0 80.0
PVP(1g/L) 20.5 75.5
活性炭(2g/L) 25.5 70.5
表2抗褐变剂与吸附剂对褐变的影响 (%)
处理 褐变率 诱导率
低温遮光 26.5 71.0
遮光 28.0 69.0
对照 36.5 62.0
表3不同培养条件对褐变的影响 (%)
表4固体培养和液体浅层静置培养对褐变的影响 (%)
刘叶蔓,等 凹叶厚朴茎段愈伤组织诱导中的褐变控制研究第4期
(责任编辑 徐爱良)
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