全 文 ：Vol. 32 No. 5
May 2012
第 32卷 第 5期
2012年 5月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
凹叶厚朴 Magnolia offi cinalis subsp. biloba ，
为厚朴 Magnolia offi cinalis的亚种，是中国特有的
木兰科木兰属植物。在中药生产中，厚朴及凹叶
厚朴都统称为厚朴，是中国传统的大宗中药材，
其根皮以及枝皮都可入药，具有燥湿消痰等功效，
用于食积气滞，腹胀便秘，痰饮喘咳 [1]。厚朴酚
（Magnolol）与和厚朴酚（Honokiol）是主要活性
成分，具有多种药理作用，包括抗炎，抗心律失
常，抗癫痫，抗血小板，抑制肌肉收缩和抗菌等。
由于资源保护不利，野生厚朴（凹叶厚朴）已濒
临枯竭，在 20世纪 80年代，已被国家定为Ⅱ级
凹叶厚朴离体胚培养的研究
王志毅 1，马英姿 1，王晓明 2，宋 荣 1 ，张 慧 1
(1.中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004; 2. 湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004)
摘 要： 为了满足市场的资源需求，建立优质凹叶厚朴离体再生体系，为凹叶厚朴工厂化生产提供理论依据，
以优质凹叶厚朴离体胚为外植体，以 B5为基本培养基，6-BA、NAA、消毒时间为因素，采用 L9(33) 正交设计，
进行无菌苗培养优化试验。结果表明：最佳消毒方法为 0.1%升汞浸泡 8 min，污染率为 12.6%，外植体生长良好；
最佳组合为 B5 + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 消毒时间 8 min，发芽率高达 87%。
关键词： 凹叶厚朴；正交设计；再生体系；发芽率
中图分类号： S727.34 文献标志码： A 文章编号： 1673-023X (2012)05-0050-04
In vitro embryonic culture of Magnolia offi cinalis subsp. biloba
WANG Zhi-yi1, MA Ying-zi1, WANG Xiao-ming2, SONG Rong1, ZHANG Hui1
(1. School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004,Hunan,China;
2. Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan,China)
Abstract: In order to satisfy the market’s demands for the resources of Magnolia officinalis subsp. biloba (Rehd.et Wils.) Law., set
up a high quality rapid propagation regeneration system of M. officinalis, and provide a theoretical basis for factory production，
the optimization tests of aseptic seedling culture on M. offi cinalis have been carried out by using its embryos as in vitro culture material,
adopting orthogonal design L9(3
4) method, and setting up 6-BA, NAA and disinfected time as the three main factors (every factor having
3 levels) . The results indicate that the best disinfect method was to sterilize the explants by mecruric chloridein （0.l%）for 8 minutes,
and the optimum combination was B5 + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ 8 minutes (disinfection time), its germination rate reached 87%.
Key words: Magnolia offi cinalis subsp. biloba; orthogonal design; regeneration system ; germination rate
收稿日期：2011-12-06
基金项目：国家行业科研专项 (201104023) ；湖南省研究生教改项目 (JG2011B027)；湖南省科技厅项目 (2011NK3042)
作者简介：王志毅 (1985-)，女，河南新乡人，硕士研究生，研究方向为资源植物的开发与利用；E-mail: hnxxwzy@163.com
通讯作者：马英姿 (1967-)，女，河南巩义人，副教授，博士，研究方向为资源植物的开发与利用；E-mail: ma_yingzi@163.com
保护植物和Ⅱ级保护野生中药材。由于资源的不
断减少，大批生长年限不足的厚朴（凹叶厚朴）
被提前砍伐，造成药材整体质量下降，《中华人
民共和国药典》对厚朴（凹叶厚朴）有效成分厚
朴总酚的含量规定也由 3%降到了 2%，这种情况
在国家标准制订的历史中是罕见的 [2]。湖南永州
产凹叶厚朴有效成分含量高，植株优良。利用生
物技术方法对优质凹叶厚朴进行快速繁殖研究、
实现规模化生产是解决资源不足的有效途径 [3-4]。
本研究对凹叶厚朴离体胚进行培养，获取最佳培
养方法，为进一步规模化生产奠定了基础 [5-7]。
DOI:10.14067/j.cnki.1673-923x.2012.05.020
51第 32卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
1 材料与方法
1.1 材 料
试验材料来自湖南永州产优质凹叶厚朴，采
其种子作为外植体。
1.2 方 法
1.2.1 外植体处理
用解剖刀夹破种壳，取出胚囊，然后依次用
75%酒精进行表面消毒 15～ 30 s、无菌水漂洗 3
～ 4次、0. 1% 氯化汞消毒 6～ 10 min、无菌水再
次漂洗 5～ 6次，最后用无菌滤纸或纱布吸干、
备用 [8-9]。
1.2.2 不同种类及质量浓度的激素选择
通过单因素预实验，得出 B5 培养基最适合外
植体生长，细胞分裂素 6-BA，KT和细胞生长素
NAA，IBA对外植体的生长起到促进作用。因此
在相同基本培养基上分别添加两种激素进行双因
素试验，统计每组的发芽率和污染率，从而选择
适合的激素种类和质量浓度组合。
1.2.3 最佳配比方案选择
在对适合的细胞分裂素和生长素及质量浓度
选择后，设计正交试验，分别以细胞分裂素，细
胞生长素和消毒时间为 3因素，不同质量浓度和
时间分别设计 3个水平，同时采用 SPSS 17.0统计
软件对试验数据进行方差分析，LSD法对各因素
各个水平之间进行多重比较 [10-11]，确定最佳配比
方案。
1.3 培养基制作
制备 B5固体培养基，调 pH 值为 5. 8～ 6. 0，
用广口瓶分装，置于 LDZX-40Ⅱ型自动电热压力
蒸汽灭菌锅，于 1. 06 kg/cm2 的压力下 121 ℃消毒
2 h[12]。
1.4 培养方法及条件
采用 B5固体培养基：琼脂 6. 5～ 7.0 g/L，蔗
糖 25 g/L，pH值 5. 8～ 6.0，于 ( 25±1)℃、暗培
养 8～ 10 d 后，再进行光照培养（2 000 lx），15
d 后统计发芽率 [13]。
2 结果与分析
2.1 不同种类及质量浓度的激素对离体胚培养的
影响
将消毒处理后的凹叶厚朴离体胚在 B5 固体培
养基上进行培养，同时添加不同种类及质量浓度
的细胞分裂素和生长素，定期观察离体胚的生长
情况，统计发芽率和污染率 [14]，试验结果见表 1
～ 3。
通过表 1和表 2可知，当保持生长素 NAA 质
量浓度一致，改变分裂素 6-BA 的质量浓度时，平
均发芽率为 51.25%，最高发芽率为 68%；而用分
裂素 KT时，平均发芽率为 45.75%，最高发芽率
仅为 62%，并且各质量浓度的 6-BA对芽的诱导率
都要高于相应质量浓度 KT，这足以说明 6-BA 对
发芽率的影响要比 KT的更为显著。
比较分析表 1 和表 3，当每组分裂素 6-BA 的
质量浓度保持一致时，取相同质量浓度的生长素
NAA、IBA 作对比试验：结果表明 NAA 对发芽率
的诱导效果好于 IBA。因此，选用分裂素 6-BA 和
生长素 NAA 作为进一步培养的激素种类。
表 1 6-BA 与NAA 的组合
Table 1 Combination of 6-BA and NAA
培养基 6-BA/(mg·L- 1) NAA /( mg·L- 1)接种数 /个发芽率 / % 污染率 / %
B5 0.0 0.0 35 18 12.0
B5 0.5 0.1 35 32 22.6
B5 0.5 0.2 35 49 28.4
B5 1.0 0.1 35 68 23.8
B5 1.0 0.2 35 56 25.6
表 2 KT 与NAA 组合
Table 2 Combination of KT and NAA
培养基 KT/(mg·L- 1) NAA/ ( mg·L - 1) 接种数 /个 发芽率 / % 污染率 / %
B5 0.5 0.05 35 31 19.5
B5 0.5 0.10 35 46 21.7
B5 1.0 0.05 35 62 30.6
B5 1.0 0.10 35 54 26.8
表 3 6-BA 与IBA 组合
Table 3 Combination of 6-BA and IBA
培养基 6-BA /(mg·L- 1) IBA/ ( mg·L - 1)接种数 /个发芽率 / % 污染率 / %
B5 0.5 0.05 35 30.6 25.3
B5 0.5 0.10 35 43.8 24.7
B5 1.0 0.05 35 52.0 26.4
B5 1.0 0.10 35 58.8 31.2
王志毅，等：凹叶厚朴离体胚培养的研究52 第 5期
2.2 最佳培养方案的确定
确定分裂素和生长素种类后，选择因素
A ：6-BA (0.5、1.0、0.1 mg·L-1) ， 因 素 B ：
NAA(0.05、0.1、0.2 mg·L-1) ，因素 C ：消毒时间
(6、8、10 min) ，3因素 3 水平，选用 L9(33) 正交
表做正交试验 ( 见表 4)，同时采用 SPSS 17.0统
计软件对试验数据进行方差分析，LSD法对各因
素各个水平之间进行多重比较 [15]( 见表 5)。
通过表 4 的数据分析，可以得出各因素内各
个水平之间的极差 (R)。极差的大小反映了该因
素的影响程度，极差大的因素对实验结果的影响
也大。从 R 的大小可知，对发芽率影响因素的大
小依次是：6-BA> NAA>消毒时间。从表 4 还可
得出各因素的最优水平组合即 6-BA：0.5 mg/L，
NAA：0.1 mg/L，消毒时间：8 min，该组合方式
对凹叶厚朴离体胚培养的发芽率可高达 87% 。
表 5则显示出方差分析结果： 因素 A (6-BA)
和因素 B (NAA) 对胚发芽率影响显著 (P≤ 0.05)。
经 LSD 多重分析比较得出：因素 A (6-BA) 的各个
水平之间存在显著差异 ( P< 0.05)；因素 B (NAA)
的水平 1、2（0.05、0.1 mg·L- 1) 之间无显著差异（P
> 0. 05），水平 2、3（0.1、0.2 mg·L- 1) 之间和 1、
3（0.05、0.2 mg·L- 1) 之间均存在显著差异 (P <
0.05)；因素 C（消毒时间）各个水平之间也无显
著差异 (P > 0. 05)。
表 4 L9(33)正交试验结果
Table 4 Results of L9(33) orthogonal test
实验序号 因素 A 因素 B 因素 C 实验结果
6-BA/ ( mg·L-1) NAA/( mg·L-1) 消毒时间 /min( 0.1%HgCl) 接种数 /个 发芽数 /个 发芽率 / %
1 0.5 0.05 6 30 21 70.0
2 0.5 0.10 8 30 27 87.0
3 0.5 0.20 10 30 17 56.7
4 1.0 0.05 8 30 18 60.0
5 1.0 0.10 10 30 17 56.7
6 1.0 0.20 6 30 7 23.3
7 0.1 0.05 10 30 15 50.0
8 0.1 0.10 6 30 16 53.3
9 0.1 0.20 8 30 7 23.3
均值 K1 0.722 33 0.600 00 0.488 67
均值 K2 0.466 67 0.666 67 0.577 67
均值 K3 0.422 00 0.344 33 0.544 67
R 30.033 32.234 8.900
表 5 L9(33)正交试验的方差分析
Table 5 Variance analsis of L9(33) orthogonal tests
变异来源 离差平方和 自由度 均方差 均方比 P
因素 A 0.157 2 0.079 22.806 0.042
因素 B 0.173 2 0.087 25.144 0.038
因素 C 0.121 2 0.006 1.758 0.363
误差 0.007 2 0.003
综上分析，在凹叶厚朴离体胚培养的过程中，
分裂素 6-BA选用 0.5 mg/L，生长素 NAA选用
0.05或 0.1 mg/L ，消毒时间 ( 6、8、10 min) 对结
果的影响差异不显著。从正交试验的方差分析可
知：生长素 NAA在 0.05～ 0.1 mg/L都适合离体
胚的生长，但从无菌苗的生长势来看，NAA 为 0.1
mg/L时生长势较好 (图 1、图 2)，因而激素 NAA
浓度选用 0.1 mg/L。
图 1 NAA 0.05 mg/L,25 d后的生长情况
Fig. 1 Growth condition of M. officinalis with
NAA 0.05 mg/L,after 25 days
53第 32卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
3 小 结
本研究对适合凹叶厚朴离体胚生长的激素种
类及浓度分别进行了双因素试验和正交试验，从
中筛选凹叶厚朴离体胚最适培养基。由正交试验
和方差分析结果可知，6-BA、NAA、消毒时间 3
因素的最佳水平组合为 B5 + 6-BA 0.5 mg/L + NAA
0.1 mg/L+ 消毒时间 8 min，发芽率高达 87%。该
结果也为今后凹叶厚朴优质资源再生体系构建以
及次生代谢研究等方面奠定了良好的基础 [16-17]。
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[本文编校：吴 毅 ]
图 2 NAA 0.1mg/L,25d后的生长情况
Fig. 2 Growth condition of M. officinalis with
NAA 0.1 mg/L, after 25 days