全 文 ：分子植物育种，2008年，第6卷，第1期，第89-94页
MolecularPlantBreeding,2008,Vol.6,No.1,89-94
研究报告
ResearchReport
黄花柳基因组微卫星分离及多态性位点检测
邓玉营 2* 徐立安 1 张博 1 诸葛强 1 黄敏仁 1 王明庥 1
1南京林业大学林木遗传与基因工程重点实验室,南京,210037;2常州工程职业技术学院应用化学技术系,常州,213164
*通讯作者,yydeng@email.czie.net
摘 要 以生物素标记的(CT)15和(GT)15为探针进行杂交，借助磁珠筛选出含微卫星的Sau3AI酶切片段，
构建了黄花柳微卫星富集文库，获得960个阳性克隆。随机挑选360个阳性克隆进行测序，发现含有微卫星
的克隆比例达45%，最后获得的44条非同源性克隆中共含有53个微卫星位点，其中(TC/AG)n，(GA/CT)n，
(CA/GT)n比例最高，占74%。随机选取其中的18个微卫星位点设计引物，用5个种个体混合DNA组成模板
池，检测引物种间的多态性信息，初步筛选出5对引物在柳属种间有很好的通用性。说明微卫星富集法开发
SSR标记不失为一种有效的方法。
关键词 黄花柳,微卫星富集,微卫星多态性
DevelopmentofGenomicbasedMicrosatelitesfromSalixcapreaandSSR
PolymorphicLociIdentificationinSalixSpecies
DengYuying2* XuLian1 ZhangBo1 ZhugeQiang1 HuangMinren1 WangMingxiu1
1TheKeyLaboraloryofForestGeneticsandGeneEngineering,NanjingForestyUniversity,Nanjing,210037;2DepartmentofAppliedChemistry
Technology,ChangzhouInstituteofEngineeringTechnology,Changzhou,213164
*Corespondingauthor,yydeng@email.czie.net
Abstract Inpresentresearch,weconstructedthemicrosatelites-enrichedlibrariesofSalixcapreathatcontained
960Sau3AI-digestedmicrosatelitespositiveclonesidentifiedbytheapproachofstreptavidinmagnespherepara-
magneticparticlesandblotedwiththeoligoprobesofbiotinylated (CT)15and (GT)15.Threehundredandsixty
cloneswererandomlyselectedtobesequenced,andtheresultsshowedthatthetestedclonecontainingmicrosatel-
litemightaccountfor45%and44cloneswereidentifiedasnon-homologycloneswith53microsateliteloci,
whichthemotifof(TC/AG)n,(GA/CT)nand(CA/GT)nrepeatswouldbemuchmorehigh,approximate74%.The
primersdesignedbasedonrandomlyselected18microsatelitelociwereemployedtodetectthegeneticpolymor-
phisminthefiveSalixspecies,whichfiveprimerpairsofthedesignedprimersmightbesuitableforthepolymor-
phicanalysisinSalixspecies.Thisresearchwehavestronglyrecommendedthatthemicrosatelites-enrichedpro-
cedureswouldbeoneoftheeficientmethodsforthedevelopmentofSSRinSalix.
Keywords Salixcaprea,Microsatelites-enriched,Microsatelitepolymorphiclocus
微卫星DNA(microsateliteDNA)是一类由少数
几个核苷酸组成的串联重复序列，分布于整个基因
组(TautzandRenz,1984;Lindaetal.,2000)。尽管微
卫星DNA分布于基因组不同位置，但两端序列相对
保守，可以用来设计特异性引物有效扩增重复序列
用于标记。微卫星标记具有数量大、分布均匀和多态
性高，共显性标记及检测方便等优点。自从1991首
基金项目：本研究由国家自然基金(30471406)和常州市武进区科技局科学项目(WN2007021)资助
次在林木树种中报道有微卫星存在 (Conditand
Hubbel,1991)以来，微卫星标记已成为群体遗传结
构、遗传图谱构建和数量性状基因 QTL定位、辅助
选择等领域研究中的重要标记 (Lianetal.,2003;Yin
etal.,2004)。
柳树(Salix.L.)属于杨柳科(Salicaceae)，是防护
林、水土保持林、风景林及用材林的重要树种，具有
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
较高的生态和经济价值。柳树染色体n=19，核基因组
相对较小，便于遗传操作；种间杂交和无性系繁殖容
易，种间和种内多态性高。柳属中部分种，和农作物
一样世代短，一年即开花，这在木本植物中是十分罕
见的，为开展林木遗传学研究带来了极大的方便，具
有很高的研究价值。近年来柳树中开始应用SSR来
进行研究，Palme等(2003)利用PCR-RFLP和cpSSR
两种分子标记技术测定欧洲黄花柳(S.caprea)群体
的叶绿体DNA的遗传变异。Lian等(2003)用SSR和
cpSSR标记研究日本富士山柳树 S.reni的群体遗
传结构和繁殖动态。但可供查找的标记不多(Hanley
etal.,2002;Barkeretal.,2003;Stamatietal.,2003)，
数量仍然制约着 SSR标记在柳树中的应用。获得
SSR标记的传统方法需要构建基因组微卫星文库，
大量筛选阳性克隆，工作量大，效率低下；为避免大
量克隆的筛选，本研究提出了一种高效且较为经济
的柳树微卫星筛选分离策略，适用于进行柳属大规
模微卫星标记开发。
1材料和方法
1.1植物材料
采集杞柳(S.integra)，簸箕柳(S.suchowensis)，垂
柳(S.babylonica)，黄枝白柳(S.albavar.vitelina)，黄
花柳(S.caprea)的新鲜叶片，保存于-70℃冰箱中供
提取DNA用。
1.2DNA的提取
采用改进的CTAB裂解—硅珠吸附法 (张博等,
2004)提取柳属5个种的DNA，并用DneasyPlant
MiniKit提取黄花柳DNA用于建库。
1.3酶切并与Sau3AI接头连接
黄花柳DNA用Sau3AI酶切，在1%琼脂凝胶电
泳分离,收集300~1000bp的片段，与Sau3AI接头
(TaKaRaLAPCRTM inVitroCloningKitTAKARA,
Co.,Ltd)连接，去磷酸化接头连接后形成缺口，对末端
进行修饰：2.5μL10×扩增缓冲液，1.5μLdNTP(终浓
度0.15μmol/L)，2.0μLMgCl2 (终浓度2.0mmol/L)，
0.2μLTaq酶 (终浓度1U/μL)，5.0μL接头DNA片
段。72℃温浴30min补平缺口。
1.4生物素标记的探针的亲和捕获
100μL的DNA95℃变性5min，在72℃下10min，
然后迅速加入3μL生物素标记的(CT)15或(GT)15探
针及2.6μL的20×SSC缓冲液，温和地混合，在低于
理论Tm值5~12℃(本实验(CT)15和(GT)15的杂交温
度都为61℃)条件下进行杂交，缓慢降至室温并温育
10min，加入重悬的链霉亲和素化磁珠(Promega公
司)，用0.1×SSC冲洗磁珠，最后用2mmol/LTris-Cl
(pH8.0~8.5)溶解，即为捕获的微卫星DNA片段。
1.5克隆富集微卫星文库
用 Sau3AI接头对应的引物 C1(5-GTA-
CATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-
3)进行PCR扩增，在1%琼脂糖凝胶电泳检测。切胶，
用试剂盒 (WizardRSVGelandPCRClean-UpSys-
tem)纯化。将纯化的产物与pGEM-TEasy载体连接。
用PCR扩增的方法检测插入片段的大小，重组质粒
用蓝白斑筛选，并转化DH5α细胞。
1.6重组质粒DNA提取与测序
筛选白色阳性克隆，提取带插入序列质粒，以
M13正向引物用ABI3100测序仪测序。
1.7检索分析并对在微卫星两侧设计引物
用Factura软件删除质粒碱基。用DNASTAR进
行同源检索，去除重复的序列。用Perl脚本程序(SS-
RFinder)寻找微卫星序列，用PrimerPremier5.0设计
引物。本实验选择引物长度20bp左右，产物的长度
为100~300bp。
1.8检测所设计的引物并对反应条件进行优化
随机选取杞柳和簸箕柳各10个个体,黄花柳2
个个体，黄枝白柳和垂柳各一个个体，最后等量混合
组成模板池，检测其中的18对微卫星引物在柳属5
个种间的多态性信息。“Touch-down”PCR反应过程：
变性94℃，30s；退火60℃，30s(以后每个循环降低
0.7℃)；延伸72℃，1min；循环15次；变性94℃，30s；
退火 49.5℃，30s；延伸 72℃，1min；循环 14次；最
后延伸72℃，8min；4℃保存；20μL反应体系：3μL
(20ng)左右；MgCL2的浓度1.5mmol/L；dNTP的浓
度200μmol/L；Primer(R&F)的浓度0.5μmol/L；Taq
酶0.8U/μl；10×PCR扩增缓冲液；最后用非变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳检测扩增出的产物。
2结果与分析
2.1微卫星文库构建
提取柳属 5个种的若干个体 DNA，Sau3AI酶
90
黄花柳基因组微卫星分离及多态性位点检测
DevelopmentofGenomicbasedMicrosatelitesfromSalixcapreaandSSRPolymorphicLociIdentification
切，片段主要集中在200~1500bp(图1)。切下300~
1000bp的片段，连接到去磷酸化的Sau3AI接头上，
补平缺口后，用Sau3AI接头引物C1进行PCR检测，
在500bp左右有比较清晰PCR条带(图2)，表明片段两
侧连上接头，去磷酸化接头连接后形成的缺口被补平。
图1黄花柳基因组DNA酶切结果
注:M:100bpladdermarker;1:DNA对照;2:酶切
Figure1TheresultofgenomeDNAofS.capreadigestedby
Sau3AI
Note:M:100bpladdermarker;1:GenomicDNA;2:Genomic
DNAdigestedbySau3AI
图2黄花柳DNA与Sau3AI接头连接的PCR检测
注:M:100bpladdermarker;1:PCR扩增产物
Figure2PCRdetectionforlinkageofDNAandSau3AIcassete
Note:M:100bpladdermarker;1:PCRproduct
连接产物经过 PCR扩增后，与生物素标记的
(CT)15和 (GT)15探针杂交，经磁珠固定得到连接
Sau3AI接头的微卫星的片段，进行PCR扩增(图3)，
图3用(CT)15和(GT)15探针杂交筛选后PCR扩增结果
注:M:100bpladdermarker;1:杂交后PCR扩增产物;2:杂交
后2次PCR扩增产物
Figure3PCRamplificationsafterhybridizationwithbiotin-(CT)15
andbiotin-(GT)15
Note:M:100bpladdermarker;1:PCRproductafterhybridiza-
tion;2:SecondPCRproductafterhybridization
大小在500bp左右，与预期设想相吻合，捕获到了含
微卫星的片段。
转化DH5α细胞提取质粒，用PCR反应进行电
泳检测的结果表明(图4)，插入片段大小变化明显，符
合转化的要求。
图4质粒PCR检测
Figure4PCRdetectionofinsertionfragmentsinplasmids
2.2序列分析
在生物素标记的(CT)15和(GT)15探针构建的960
个克隆文库中，随机挑取360个进行测序，序列去除
空载体和低质量序列。依据Linda等(2000)对微卫星
的划定标准：单核苷酸重复(mono-)>15bp，二核苷酸
重复(di-)>14bp，三核苷酸重复(tri)>15bp，四核苷酸
重复(tetra-)>16bp，五核苷酸重复(penta)>20bp，360
个富集文库克隆中，162个克隆中含不同类型的微卫
星序列(45%)，用DNAStar对含有微卫星的162条序
列进行重叠群检索，最后得到44条非同源性的序列。
对这44条非同源性的序列进行统计，共找到53
个微卫星位点。根据Weber(1990)提出的标准，把53
个微卫星位点按微卫星核心序列排列方式的差异，分
成完全型 (perfect)、不完全型 (imperfect)和复合型
(compound)3类，其中完全型37个，不完全型10个，
复合型6个。
从微卫星种类上看，53个微卫星中以(TC/AG)n，
(GA/CT)n，(CA/GT)n为主，占74%；(A/T)n，(AT/TA)n多
数是伴随二碱基微卫星出现在一个位点中，还发现了
三碱基微卫星(GGT)n，(ACC)n，(CTC)n，(GCT)n，(CCT)n，
(GGC)n等。单核苷酸微卫星重复次数最多有20次，
二核苷酸微卫星重复次数在4~16之间，三核苷酸微
卫星重复次数最多有5次。
2.3引物设计及通用性检测
选取18个微卫星位点用来设计引物，表1列出
了选取的18个微卫星序列、根据两翼保守序列设计
的引物、PCR期望片段大小。
18对引物中，4对引物无多态性，9对无法扩增，
5对引物表现多态性(Scs1,Scs2,Scs3，Scs16,Scs17)。5
对引物分别在在5个种内进行PCR扩增，微卫星位
点(Scs1)在簸箕柳、杞柳、黄枝白柳、垂柳间成功扩增
(图5)，共检测到6个等位基因，大小在110~353bp之
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
间，种间变化明显；微卫星位点(Scs2)在杞柳、黄枝白
柳、垂柳间成功扩增(图5)，检测到4个等位基因，在
128~242bp之间变化；微卫星位点(Scs3)在其它4个
种间成功扩增 (图 5)，检测到 3个等位基因，在
表1黄花柳18个微卫星的两翼引物及PCR期望大小
Table1Repeatmotif,primersequenceandPCRproductsizeof18microsatelitesfrommicrosatelite-enrichedgenomiclibraryof
S.caprea.
编号
SerialNo.
Scs1
Scs2
Scs3
Scs4
Scs5
Scs6
Scs7
Scs8
Scs9
Scs10
Scs11
Scs12
Scs13
Scs14
Scs15
Scs16
Scs17
Scs18
微卫星
SSRrepeatmotif
(CA)5CTT(CA)10
(AC)15
(GA)12
(GA)5A(GA)5
(CT)9/(CA)16
(GGC)5
(TA)5
(AGC)5
(TC)12
(CCT)5
(GA)4
(GGT)5
(A)14TTTTCGTTCAACACCTCATC(A)20
(GA)4
(A)17/(T)5
(GA)4
(T)10CC(A)7
(AT)6
两翼设计的引物
Primersequence(5-3)
F:ATTTATGGGTTGGTCG
R:GGGATACTTCAATCTC
F:CTGGACAGCAGCCTTTA
R:GACGCACATACACCATTAC
F:AGATGAGATGGAGGACTG
R:TTGGGTGATGAAATGG
F:TCTTATGGTCGTGGTGG
R:CATGACTCCCCTTCGTC
F:GTACTACCGATTTATTTAGAAGA
R:CTTTTTCCACTCGCCAC
F:AGAGGGAATAGGAAAGTG
R:GCACCAACCACTTCAACT
F:CCGTATTGAGTAGTTGTGC
R:AACGAATGGTCATGGCAG
F:AATTCGATTACTATACGGG
R:CTTGGCGTAATCATGGTC
F:GACTGCTCCTGATACTGT
R:ATTAGCGNCCNACCCGAA
F:GAGATCAGCAGCAGCAAC
R:GTGAAATTGTTATCCGCT
F:CGGAACCACTCAACGATT
R:AGGGTGCAATGTGCGTTC
F:TTGGTGACTGCTCCTGAT
R:TATCCGCTCACAATTCCA
F:GGTAAAACCTATTACGTTCAAT
R:CCGTGAATCATCGAATCTTT
F:AGGTTGTTCAGCCGAGCTCT
R:CAGAGAGCATGCCTGTTTGA
F:TGCGGCAGGATCATTACTGT
R:CTGCGCTCTTNTNCTATNCG
F:AAGCATCCCTTGCCAATACA
R:GCAGCGAATTGCGATAAGTA
F:ATGCCTGTTTGAGCGTCATT
R:AACGTTCCAAACGCTCAGAA
F:CTCTTGGTATGCCGTAAGCA
R:ATCTTGGCATGCAGCCTAAG
期望PCR产物
Predictedproductsize
190bp
160bp
162bp
147bp,353bp
168bp
270bp
185bp
259bp
194bp
170bp
197bp
229bp
255bp
198bp
152bp
200bp
209bp
218bp
类型
Type
Ⅱ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅰ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅲ
Ⅰ
注:F:正向引物;R:反向引物;Ⅰ:完全型;Ⅱ:不完全型;Ⅲ:复合型
Note:F:ForwardPrimer;R:ReversePrimer;Ⅰ:Perfect;Ⅱ:Imperfect;Ⅲ:Compound
122~190bp之间变化；微卫星位点(Scs16)(图6)在5
个种DNA模板池、杞柳中成功扩增，检测到5个等位
基因，在147~404bp之间变化。
微卫星位点(Scs17)(图 6)在 5个种 DNA模板
92
池、杞柳、簸箕柳中成功扩增，检测到6个等位基因，
大小在147~353bp之间变化。说明这几个引物可以
进一步应用于杞柳、簸箕柳和黄枝白柳等树种的遗传
研究。
3讨论
在GenBank中，柳属只有43个SSR标记可供利
用 (Hanleyetal.,2002;Barkeretal.,2003;Stamatiet
al.,2003)，所以要进行柳属SSR标记的应用，构建基
因库是首要步骤。本研究以生物素标记的寡核苷酸
探针进行杂交，再借助磁珠的固定作用分离出含微
卫星的DNA片段，文库中富集微卫星，然后进行测
序。选取其中的18个微卫星位点设计引物，筛选出5
对引物在柳属种间有很好的通用性。该方法快速、高
效，45%的克隆中含不同类型的微卫星序列，远远高
于常规方法2%~3%的阳性克隆率(张增翠和侯喜林,
2004)；但阳性克隆数低于李新国等(2004)采用同样
方法在日本扁柏中构建的微卫星基因组文库
(65.6%)，一方面构建的基因组文库(960个阳性克隆)
不大；另一方面柳属核基因组较小，重复序列也较日
本扁柏少。所以总体来讲，该方法是一种较为有效的
柳属微卫星开发策略。
SSR标记检测的关键是标记引物要在种间有效
扩增出微卫星位点(Kijasetal.,1995)，本研究采用5
个种个体混合DNA组成模板池，并结合种内个体进
一步验证的方法来检测微卫星位点：初筛时，混合
DNA组成的模板池有效的检测引物的种间多态性，
不至于漏掉可用引物；在种内个体间进一步验证又
可以对个体的多态性信息有所了解，实验证明比较
高效。但也有出现矛盾的现象：如图5，在扩增簸箕柳
(10个个体)混合模板时没有条带，但在扩增簸箕柳
单独个体时却有条带。对这种现象分析认为，混合模
板中由于所加DNA样品较多，导致有些含有多态性
位点的DNA模板相对较少，可能会影响这些位点的
有效扩增。所以在以后利用模板池检测时，混合模板
的样品数量不能太多，每个种4个个体左右较理想。
微卫星标记重复次数的选择上，本研究初步筛
选到的 5对引物，重复次数高的位点 (Scs1,Scs2,
Scs3)主带比较明显，多态性好；也验证了重复次数
n>12~15更适于作遗传标记(Weber,1990)。但本研究
发现重复次数较少的微卫星Scs16，Scs17也能有效
的扩增，同时Lian等(2003)用cpSSR标记研究日本
富士山柳树S.reni时发现用(A)10~(A)14做cpSSR微
卫星标记时也有高的多态性。所以在选择柳属微卫
星标记时，重复次数尽量保证在12~15重复以上，但
对于重复次数较少，两侧适宜设计引物的微卫星也
可以设计引物在个体间验证它的多态性。
微卫星标记核心序列排列方式的选择上，Mil-
bourne等 (1997)在马铃薯微卫星标记研究中提出，
选用核心序列排列方式为完全型的微卫星是获得多
态性微卫星标记的最佳选择。但本实验选取了不完
全型和复合型微卫星 (Scs1,Scs4,Scs5,Scs13,Scs15,
Scs17)进行了扩增，实验结果表明：Scs1和 Scs17的
多态性也较好；同时，Barker等(2003)在Salixburjatica
中得到的9个柳树种间通用性引物中，有4个是不完
黄花柳基因组微卫星分离及多态性位点检测
DevelopmentofGenomicbasedMicrosatelitesfromSalixcapreaandSSRPolymorphicLociIdentification
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
全型和复合型的。说明柳属中不完全型和复合型微卫
星位点也是多态性微卫星标记的重要来源。
本实验同时发现：黄花柳的(CT)n和(GT)n富集
文库获得的SSR标记引物在扩增乔木柳中的垂柳时
效果较差(图5)。同Tuskan等(2004)在杨柳科 SSR
引物通用性的研究结果是一致的：SSR标记引物在
亲缘关系较远时，扩增效果越差。因此针对不同种构
建富集文库，开发SSR标记，将提高SSR标记的筛
选效率。
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