全 文 ：［收稿日期］ 20151222(007)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(30970300);黑龙江省自然科学基金面上项目(C2016053) ;黑龙江中医药大学科研基金项目
(015128)
［第一作者］ 丁常宏，博士，副教授，从事中药资源学研究，Tel:0451-87266873，E-mail:goodluckdd81@ 126. com
［通讯作者］ * 王振月，教授，从事中药资源学研究，Tel:0451-87266873，E-mail:wangzhen_yue@ 163. com
产酸模素苷及白藜芦醇苷的毛脉酸模内生真菌筛选
丁常宏1，郭美1，王谦博2，王振月1*
(1. 黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨 150040;2. 广东药学院 附属第一医院 药学部，广州 510080)
［摘要］ 目的:在前期的研究工作中已从不同产地分离得到毛脉酸模内生真菌 278 株，以这些内生真菌为研究对象，寻
找能够通过自身发酵产生酸模素苷、白藜芦醇苷的内生真菌。方法:通过 HPLC检测内生真菌的次生代谢产物，以酸模素苷、
白藜芦醇苷为参照，筛选能够产生酸模素苷、白藜芦醇苷的内生真菌，并测定其含量。结果:发现其中的 11 株内生真菌的次生
代谢产物中含有酸模素苷，5 株次生代谢产物中含有白藜芦醇苷，其中内生真菌 tq-s1 的次生代谢产物中酸模素苷的质量分数
最高(530 μg·g －1)，且白藜芦醇苷的质量分数也最高(224 μg·g －1)。结论:内生真菌的种类和其次生代谢产物的形成受到地
理位置的影响，对于酸模素苷和白藜芦醇苷的高产菌种 tq-s1，可以进行开发利用的研究。
［关键词］ 毛脉酸模;内生真菌;酸模素苷;白藜芦醇苷
［中图分类号］ Ｒ282 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2016)23-0045-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2016230045
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20160920． 0918． 024． html
［网络出版时间］ 2016-09-20 9:18
Screening for Endophytic Fungi of Ｒumex gmelini
Producing Nepodin-8-O-β-D-Glucopyranoside and Polydatin
DING Chang-hong1，GUO Mei1，WANG Qian-bo2，WANG Zhen-yue1*
(1. School of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;
2. Department of Pharmacy，the First Hospital Affiliated to Guangdong
Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China)
［Abstract］ Objective:In the previous study，278 strains of endophytic fungi were separated from
Ｒumex gmelini in different origins． These endophytic fungi were taken as the research object to screen out
endophytic fungi that could produce nepodin-8-O-β-D-glucopyranoside and polydatin through fermentation．
Method:HPLC was used to detect secondary metabolites of endophytic fungi，nepodin-8-O-β-D-glucopyranoside
and polydatin were used as reference to screen out endophytic fungi that could produce nepodin-8-O-β-D-
glucopyranoside and polydatin，and determine their content． Ｒesult:Eleven strains of endophytic fungi whose
secondary metabolites containing nepodin-8-O-β-D-glucopyranoside were found，meanwhile 5 strains could produce
polydatin． Among them，fungi tq-s1 had the highest mass fraction of nepodin-8-O-β-D-glucopyranoside (530
μg·g －1)and polydatin (224 μg·g －1)in its secondary metabolites． Conclusion:Endogenous fungal species and
formation of their secondary metabolites were affected by geographical location． Further studies shall be conducted
on the development and utilization of high-yield strain tq-s1 of both nepodin-8-O-β-D-glucopyranoside and
polydatin．
［Key words］ Ｒumex gmelini;endophytic fungi;nepodin-8-O-β-D-glucopyranoside;polydatin
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内生真菌(endophytic fungi)是指存在于健康正
常植物的各种组织和器官之内的真菌，被其感染的
植物不会显示出明显的病症，可以经对植物组织内
直接扩增微生物 DNA 的方式来证明其在内部的真
实存在［1-4］。药用植物内生真菌的研究还表明，内
生真菌具有促进宿主植物合成次生代谢产物的能
力。如唐坤等［5］将 1 株拟青霉属内生真菌接种到丹
参幼苗中，对比发现该真菌能够促进丹参幼苗的生
长，且对植物中有效成分丹酚酸的积累有显著的促
进作用。林燕青等［6］从木麻黄中分离出内生真菌-
18，该真菌与苗木共生时，能够显著提高木麻黄的平
均抽梢量。还有一些内生真菌通过发酵作用能够合
成与宿主相同或是相似的次生代谢成分。张鹏
等［7］从云南红豆杉的内生真菌中筛选出 1 株拟盘多
毛孢属真菌，该菌可以经发酵作用产生紫杉醇，产量
能够到达 140 μg·L －1。闵长莉等［8］从植物博落回
的内生真菌中筛选出层出镰刀菌，通过薄层色谱和
高效液相色谱研究发现在其发酵液中含有与宿主
相同的一种次生代谢成分血根碱。吴晓民等［9］从
高山红景天的内生真菌中筛选出 1 株能够通过发
酵产生其宿主主要药效成分红景天苷的菌株。曾
宪军等［10］从麻花秦艽中分离出 1 株能够产生龙胆
苦苷的腐皮镰刀菌。药用植物内生真菌的这些特
点，为利用其通过发酵工业生产药用活性化合物
开辟了新的途径，为提高药用植物活性成分的产
量提供了新思路和新方法，利于中药资源的可持
续利用［11-13］。
毛脉酸模为蓼科多年生草本植物，具有抗肿瘤、
抗菌、抗病毒、镇咳、平喘、降压、抗氧化的作用［1-2］。
毛脉酸模中含有白藜芦醇、白藜芦醇苷、酸模素、酸
模素苷、蒽醌类、多糖等化学成分。其中酸模素苷和
白藜芦醇苷具有很高的药用价值，但毛脉酸模的植
物资源有限，且在逐渐减少，所以寻找能够替代毛脉
酸模植物的微生物资源是一条可行且环境友好的解
决方案。课题组在前期的研究工作中已从不同产地
分离得到毛脉酸模内生真菌 278 株［2］，本研究以这
些内生真菌为研究对象，通过 HPLC 对其次生代谢
产物进行研究，首次以酸模素苷、白藜芦醇苷为参
照，寻找能够通过自身发酵产生以上 2 种次生代谢
产物的内生真菌，并测定其含量，并成功筛选出两种
次生代谢产物的高产菌种。此研究填补了内生真菌
通过发酵同时产生酸模素苷和白藜芦醇苷方面的空
白，为菌株进一步在工业方面地开发利用提供依据，
为植物资源保护和可持续利用做出贡献。
1 材料
课题组前期从黑龙江省乌伊岭(wy)，图强
(tq)，红星(hx)，塔河(th)，加格达奇(jq)，绥棱
(sl)，桃山(ts)，上甘岭(sc)，新林(xl)及黑龙江中
医药大学药用植物园(yy)10 个产地的毛脉酸模
Ｒumex gmelini的根及根茎(经黑龙江中医药大学王
振月教授鉴定)中分离出共 278 株内生真菌，现保
存于黑龙江中医药大学中药资源与开发实验室。白
藜芦醇苷对照品购于成都曼思特生物科技有限公司
(批号 MUST-12121606)，酸模素苷对照品是本课题
组前期从毛脉酸模植物中提取分离得到，经波谱分
析鉴定结构，归一化法计算，含量在 98%以上。
高效液相色谱仪(600 型泵，2487 型二极管阵
列检测器，Empower 色谱工作站，美国 Waters 公
司)，BSD-100 型振荡培养箱(上海博讯实业有限公
司医疗设备厂)，DK-S24 型电热恒温水浴锅(上海
森信实验仪器有限公司)，二级 B2 型生物安全柜
(北京东联哈尔仪器制造有限公司)。
甲醇(色谱纯，美国 Dikma 公司，批号 81120)，
磷酸(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批
号 20140527)，水为娃哈哈饮用纯净水。葡萄糖(分
析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号 13-
201-00311)，琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公
司，批号 01-024)。
2 方法
2. 1 菌株的活化 采用点植法，将保存的毛脉酸模
内生真菌接种到新鲜 PDA 平板培养基上，28 ℃，
3 ～ 5 d进行活化培养。观察菌落形态，待长势较好
时进行下一步的接种。
2. 2 发酵培养 将活化后的菌株接种于 500 mL锥
形瓶中(每瓶含有液体培养基 300 mL)，28 ℃，160
r·min －1下发酵培养 7 d(个别菌种发酵 10 ～ 15 d)。
将菌体及发酵液在 60 ℃下水浴蒸干得到内生真菌
发酵产物。记录各内生真菌发酵产物的质量。另取
马铃薯葡萄糖液体培养基 300 mL，60 ℃下水浴蒸
干，作为空白培养基。
2. 3 毛脉酸模内生真菌次生代谢产物的提取 取
蒸干后的毛脉酸模内生真菌发酵产物，称取 4 g 置
于圆底烧瓶中，加入甲醇 20 mL，称质量。加热回流
2 次，每次 2 h，补足损失后滤过，合并滤液。得到毛
脉酸模内生真菌的提取液，该提取液经微孔滤膜
(0. 45 μm)滤过作为供试品溶液备用。同时将空白
培养基做同样处理。
2. 4 对照品溶液的制备 分别精密称取白藜芦醇
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苷、酸模素苷对照品 2. 25，1. 70 mg，甲醇溶解，定容
至 25 mL 量瓶内，配制成质量浓度依次为 0. 09，
0. 068 g·L －1的对照品溶液。
2. 5 HPLC 测 定 条 件 Gemini C18 色 谱 柱
(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)。流速 1. 0 mL·min －1，柱
温 35 ℃，检测波长 254 nm(酸模素苷)和 303 nm
(白藜芦醇苷)，进样量 10 μL。流动相为甲醇-
0. 1%磷酸水，梯度洗脱:0 min，30% 甲醇;0 ～ 50
min，30% ～100%甲醇;50 ～ 60 min，100%甲醇。
3 结果与分析
通过对 278 株提取自不同产地的毛脉酸模中的
内生真菌进行筛选，发现其中的 11 株内生真菌的次
生代谢产物中含有酸模素苷(jq-s9，tq-s1，tq-s2，xl-
s5，xl-s10，jq-l3，jq-l14，tq-l11，xl-s3，xl-s11，ts-l1)(表
1，图 1) ，5 株次生代谢产物中含有白藜芦醇苷(jq-
s9，tq-s1，tq-s2，xl-s5，xl-s10)(表 1，图 2)。
表 1 产生酸模素苷和白藜芦醇苷的内生真菌
Table 1 Endophytic fungi producing nepodin-8-O-β-D-
glucopyranoside and polydatin
菌株 种属 成分 质量分数 /μg·g － 1
jq-s9 环梗孢属 Annellophora 酸模素苷
白藜芦醇苷
280
166
tq-s1 链格孢属 Alternaria 酸模素苷
白藜芦醇苷
530
224
tq-s2 链格孢属 Alternaria 酸模素苷
白藜芦醇苷
441
204
xl-s5 链格孢属 Alternaria 酸模素苷
白藜芦醇苷
474
182
xl-s10 链格孢属 Alternaria 酸模素苷
白藜芦醇苷
427
163
jq-l3 链格孢属 Alternaria 酸模素苷 76
jq-l14 链格孢属 Alternaria 酸模素苷 154
tq-l11 链格孢属 Alternaria 酸模素苷 143
xl-s3 链格孢属 Alternaria 酸模素苷 382
xl-s11 链格孢属 Alternaria 酸模素苷 526
ts-l1 青霉属 Penicillium 酸模素苷 246
按 1 瓶(300 mL)发酵液计算，菌 tq-s1，tq-s2，jq-
s9，xl-s3，xl-s5，xl-s10，xl-s11 所含酸模素苷成分均在
1 000 μg以上，其中内生真菌 tq-s1 的次生代谢产物
中酸模素苷的含量最高(530 μg·g －1)，含量最低的
是 jq-l3(76 μg·g －1)。白藜芦醇苷的含量在内生真
菌 jq-s9，tq-s1，tq-s2，xl-s5，xl-s10 的次生代谢产物中
相差不多，其中内生真菌 tq-s1 的次生代谢产物中白
藜芦醇苷的含量最高(224 μg·g －1)，含量最低的是
xl-s10(163 μg·g －1)。由此可见内生真菌 tq-s1 是
图 1 内生真菌提取液及酸模素苷的 HPLC(254 nm)
Fig． 1 HPLC of extracts of endophytic fungi and nepodin-8-O-β-D-
glucopyranoside(254 nm)
图 2 内生真菌提取液及白藜芦醇苷的 HPLC(303 nm)
Fig． 2 HPLC of extracts of endophytic fungi and polydatin(303
nm)
可以同时产生酸模素苷和白藜芦醇苷的菌种，且为
高产菌种。
4 讨论
酸模素苷的化学式为酸模素-8-O-β-D-葡萄糖
苷，基本作用与酸模素相似，具有抗氧化和抗真菌的
作用［14-15］，是毛脉酸模的药用有效成分。本研究中
筛选出的 11 株毛脉酸模的内生真菌在与宿主共生
的过程中经宿主影响，其次生代谢产物中也含有此
种成分，这可能是植物和真菌在物质水平和基因水
平长期交流的结果。由于酸模素具有抗真菌的活
性，所以与毛脉酸模共生的真菌显然对这种化学物
质能够产生抵抗能力。白藜芦醇苷可以对癌细胞的
生长和迁移起到抑制作用，抗肿瘤活性良好。张玉
松等［16］通过细胞水平的实验发现白藜芦醇能够显
著抑制乳腺癌细胞的生长，同时能够阻碍癌细胞的
迁移并降低其侵袭能力。孙海榕等［17］研究发现白
藜芦醇苷对肝癌细胞的增殖和迁移也有一定的抑制
作用。另有研究发现白藜芦醇苷能够减少脑梗死大
鼠的缺血性损伤，起到改善血脑屏障渗透性的作
用［18］，白藜芦醇苷能够提高巨噬细胞的抗炎能
力［19］，且能够有效的抑制糖尿肾病的发生和发
展［20］，等等。综上所述，酸模素苷和白藜芦醇苷都
具有较高的药用价值，如果能够通过内生真菌发酵
的方法高效经济地获得大量的酸模素苷和白藜芦醇
苷，将会为药物的生产提供更便捷的途径，为中药资
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源的可持续发展做出贡献。
本研究中使用的这些真菌是从图强(tq)，塔河
(th)，新林(xl)，加格达奇(jq)，绥棱(sl)，乌伊岭
(wy)，红星(hx)等 10 个产地的毛脉酸模中分离出
来的，通过 HPLC法筛选发现有 11 株可以产生酸模
素苷，这 11 株真菌是从加格达奇、图强、桃山、新林
4 个地方的野生毛脉酸模中分离出来的，5 株内生真
菌通过发酵能够产生白藜芦醇苷，分别是从加格达
奇、图强、新林 3 地区的毛脉酸模中分离得到。由此
可以推断内生真菌的种类和其次生代谢产物的形成
受到地理位置的影响，呈现出明显的地域性。同时
jq-s9，tq-s1，tq-s2，xl-s5，xl-s10 这 5 种内生真菌既能
够产生酸模素苷又可以产生白藜芦醇苷，2 种次生
代谢产物的形成在这些内生真菌的代谢过程中可能
存在一定的联系，而且通过对比发现这 5 种内生真
菌产酸模素苷的平均能力显著高于只能单独产生酸
模素苷的另外 6 种真菌(jq-l3，jq-l14，tq-l11，xl-s3，
xl-s11，ts-l1)。其中内生真菌 tq-s1 发酵后的提取物
中酸模素苷和白藜芦醇苷的含量都是最高，在今后
的研究中将通过优化该菌种培养条件，对 tq-s1 进行
诱变育种等方式提高其产生酸模素苷和白藜芦醇苷
的稳定性和生产效率，为工业化大规模生产奠定
基础。
［参考文献］
［1］ 吉林省中医中药研究所． 长白山植物药志［M］． 长
春:吉林人民出版社，1982:299．
［2］ 张广庆，赵海鹏，王振月，等．酸模属植物的化学成分
与药理活性研究进展［J］．世界科学技术—中医药现
代化，2008，10(5):86-93．
［3］ Hallmann J，Quadt H A，Mahaffee W． Bacterial
endophytes in agricultural crops［J］． Can J Microbiol，
1997，43(10) :895-914．
［4］ 周启武，于龙凤，路浩，等．小花棘豆和变异黄芪内生
真菌显微分布及定量检测［J］． 微生物学报，2014，54
(5):572-581．
［5］ 唐坤，李标，郭顺星． 一株促进丹参生长和提高丹酚
酸含量的活性内生真菌［J］． 菌物学报，2014，33
(3):594-600．
［6］ 林燕青，吴承祯，谢安强，等． 木麻黄(Casuarina
equisetifolia)内生真菌的分离与促生菌株的筛选［J］．
北华大学学报:自然科学版，2015，16(4):522-528．
［7］ 张鹏，刘博，周蓬蓬，等． 一株产紫杉醇内生真菌 YN6
的分离及鉴定［J］． 中国生物化学与分子生物学报，
2011，27(10):961-967．
［8］ 闵长莉，汪学军，赵梦凡，等． 博落回内生真菌的分
离及产血根碱菌株的筛选［J］． 中国中药杂志，
2014，39(22):4288-4291．
［9］ 吴晓民，任谓明，杨信东，等． 高山红景天内生真菌
的分离及产红景天苷菌株的筛选［J］． 时珍国医国
药，2014，25(11):2769-2772．
［10］ 曾宪军，杨欣，丁仁芳，等． 一株产龙胆苦苷的麻花
秦艽内生真菌的分离鉴定［J］． 时珍国医国药，2015，
26(8):2024-2027．
［11］ 吴秀丽，张怡轩，赵文倩，等． 真菌 EST-I 及 EST-II 对
人参皂苷 Ｒg1 定向转化为人参皂苷 F1 的研究［J］．
沈阳药科大学学报，2008，25(1):73-76．
［12］ Liu L，Dong Y S，Qi S S，et al． Biotransformation of
steriodal saponins in Dioscorea zingiberensis C． H．
Wright to diosgenin by Trichoderma harzianum ［J］．
Appl Microbiol Biotechnol，2010，85(4) :933-940．
［13］ Ding C H，Du X W，Xu Y，et al． Screening for
differentially expressed genes in endophytic fungus strain
39 during co-culture with herbal extract of its host
Dioscorea nipponica Makino［J］． Curr Microbial，2014，
69(4) :517-524．
［14］ Choi G J，Lee S W，Jang K S，et al． Effects of
chrysophanol，parietin，and nepodin of Ｒumex crispus on
barley and cucumber powdery mildews［J］． Crop
Protection，2004，23(12) :1215-1221.
［15］ Gautam Ｒ，Karkhile K V，Bhutani K K，et al． Anti-
inflammatory， cyclooxygenase (COX )-2， COX-1
inhibitory，and free radical scavenging effects of Ｒumex
nepalensis［J］． Planta Med，2010，76(14) :1564-1569．
［16］ 张玉松，庄志祥，焦旸，等． 白藜芦醇苷对乳腺癌细胞
转移潜能影响观察［J］． 中华肿瘤防治杂志，2014，21
(22):1788-1793．
［17］ 孙海榕，王璐瑜，王忠鑫． 白藜芦醇苷通过抑制
microＲNA-21 表达抑制肝癌细胞增殖和迁移［J］． 中
国生物化学与分子生物学报，2015，31 (11):
1220-1226．
［18］ 季辉，张祥建，杜媛媛，等． 白藜芦醇苷在缺血性脑血
管病中的保护机制［C］． 福建:中华医学会第十七次
全国神经病学学术会议，2014．
［19］ Lou T，Jiang W，Xu D，et al． Inhibitory effects of
polydatin on lipopolysaccharide-stimulated ＲAW 264. 7
cells［J］． Inflammation，2015，38(3):1-8．
［20］ Huang K，Chen C，Hao J，et al． Polydatin promotes Nrf2-
AＲE anti-oxidative pathway through activating Sirt1 to
resist AGEs-induced upregulation of fibronetin and
transforming growth factor-β1 in rat glomerular
messangial cells［J］． Mol Cell Endocrinol，2015，399
(19):178-189．
［责任编辑 邹晓翠］
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