全 文 ：— 29 —现代中药研究与实践2012年第26卷第6期Chin Med J Res Prac,2012 Nov.Vol.26 No.6
生、熟药用大黄高效液相色谱指纹图谱的对比研究
杨 涛1 ，胡昌江1*，周彦池2 ，王 虎1 ，龙兰艳1，吴文辉1
（1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；
2.泸州医学院附属中医医院药剂科，四川 泸州 646000）
摘要 ：目的　对生、熟药用大黄HPLC指纹图谱进行比较研究，同时考察熟大黄炮制过程中加酒与否
对其化学成分的影响。 方法　采用HPLC色谱法，色谱柱Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动
相：甲醇—0.1%磷酸水梯度洗脱，检测波长254 nm，柱温35℃，流速1.0 mL/min。 结果　与生大黄比较，
熟大黄有12个色谱峰减弱至极小甚至消失，7个色谱峰明显增大，其中包括5个指标成分峰；熟大黄与无
酒熟大黄醇提物指纹图谱相似度极高（0.989）。 结论　药用大黄经炮制成熟大黄后，化学成分在种类和含
量上都发生了明显变化。熟大黄炮制过程中加酒与否对其醇提物中化学成分无影响。
关键词 ：药用大黄；熟大黄；高效液相色谱法；指纹图谱；黄酒
中图分类号：R927 文献标识码：A 文章编号：1673-6427(2012)06-0029-04
收稿日期：2012-01-22
基金项目：中医药行业科研专项（201107007）
作者简介：杨涛（1987—），男，硕士研究生，研究方向为中药炮制与制
剂。E-mail:yangtao.21@163.com
*通讯作者：胡昌江（1952—），男，教授，博士生导师。E-mail:hhccjj@
yahoo.com
Comparative Study on HPLC Fingerprints of Stewed Rhubarb and Rhubarb
YANG Tao1, HU Chang-jiang1*, ZHOU Yan-chi2, WANG Hu1, LONG Lan-yan1,
WU Wen-hui1
(1. Chengdu University of TCM, Chengdu 611137, China;
2. Hospital (T.C.M.) Affiliated to Luzhou College, Luzhou 646000, China)
Abstract: Objective To compare the fingerprints of stewed rhubarb and rhubarb by HPLC and inspect the
influence of chemical composition on adding yellowwine or not in the process of preparing the rhubarb. Methods
The HPLC fingerprints method was used by the following conditions: a Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)
with mobile phase in gradient elution composed of methanol and 0.1% phosphoric acid, the detection wavelength
280 nm, the column temperature 35℃, and the flow rate 1.0 mL/min. ResµLt By comparing with rhubarb,
12 chromatographic peaks of stewed rhubarb reduced severely or disappeared, and 7 chromatographic peaks
increased visibly including the 5 distinctive chromatographic peaks. The similarity of the fingerprints between
stewed rhubarb and rhubarb extracted by methanol was 0.989. Conclusion The variety and content of chemical
composition of rhubarb changed evidently after processed to stewed rhubarb. There was no influence for chemical
composition extracted by methanol on adding yellowwine or not in the process of preparing the rhubarb.
Key words: Rheum officinale Baill. ; stewed rhubarb; HPLC; Fingerprint; Yellowwine
临床及中药用药市场对生熟大黄存在功效差异不明
确，实际运用混乱的状况；同时，关于生熟药用大黄
异同的研究还较少，对其高效液相色谱指纹图谱的研
究还未见报道。因此，本课题旨在对川产道地药材药
用大黄生熟品从高效液相色谱指纹图谱的角度比较
其异同，同时考察熟大黄在炮制的过程中辅料黄酒对
药物的影响，为大黄在临床的生熟异用提供科学合理
的依据。
1　实验材料
1.1　药材
大黄药材购自四川成都新荷花大黄种植基地，经
药用大黄为川产道地药材，系采用蓼科植物药用
大黄Rheum officinale Baill. 的干燥根及根茎入药，味
苦，性寒，为临床常用中药。其炮制品众多，功效亦
各有偏重。其中，生大黄泻下作用峻烈，具有攻积
导滞、泻火解毒的功能；而熟大黄经酒蒸后，泻下作
用缓和，并能增强活血祛瘀之功 [1]。调查发现，目前
DOI:10.13728/j.1673-6427.2012.06.017
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本校炮制教研室卢先明教授鉴定为蓼科植物药用大
黄Rheum palmatum L.的干燥根茎。各炮制品炮制方
法 [1]如下（均于中药炮制实验室自行炮制）。
生大黄：刮去外皮，切厚片或块，低温烘干。
熟大黄：取生大黄片或块适量，用黄酒拌匀，闷1.5
h至酒被吸尽，置笼屉内，隔水蒸24 h，取出，干燥。
每100 kg大黄片或块，用黄酒30 kg。
无酒熟大黄：取生大黄片或块适量，用清水拌
匀，蒸制方法与时间与熟大黄同。
1.2　试药
芦 荟 大 黄 素（ 批 号：110756-200806， 纯
度 >98%）、 大 黄 酸（ 批 号：110757-200206， 纯
度 >98%）、 大 黄 素（ 批 号：110756-200110， 纯
度>98%）、大黄酚（批号：110796-200716，纯度
>98%）、大黄素甲醚（批号：110758-200611，纯度
>98%）均购自中国药品生物制品检定所。甲醇（色
谱纯，美国TEDIA公司），纯净水，为色谱流动相；
甲醇为分析纯。黄酒（四川省仪陇银明黄酒有限责任
公司）。
1.3　仪器
Waters高效液相色谱仪（Waters 2695高效液相
色谱泵系统, Waters 2996 PAD检测器， Empower 数据
处理软件），BS200S电子天平（感量0.001 g，德国
Sartorius公司），BP211D电子天平（感量0.01 mg，
德国Sartorius公司），KQ-300E超声清洗器（功率
300 W）。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
色 谱 柱：Kromasil-C18 柱（250 mm×4.6 mm，
5μm）；流动相：A：甲醇，B：0.1%磷酸水溶液（梯
度洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；
检测波长：254 nm；分析时间：85 min；进样量：10
μL。
表 1 梯度洗脱程序
Tab.1 Programs of gradient elution
时间（min） 甲醇A（%） 0.1%磷酸水溶液B（%）
0 5 95
3 20 80
13 35 65
20 40 60
25 47 53
46 55 45
71 75 25
79 100 0
85 100 0
2.2　对照品溶液的制备
精密称取大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、
大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL中
含大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚各16 μg，
含大黄素甲醚8 μg的对照品混合溶液。
2.3　供试品溶液的制备
精密称取生大黄，熟大黄及无酒熟大黄粉末（过
40目筛）各约0.5 g，加入甲醇25 mL，称重，浸泡12 h，
超声30 min，提取液放冷至室温，补足重量，过滤，
取续滤液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过即得，备用[2]。
2.4　方法学考察
2.4.1　精密度试验　　取同一批次生大黄供试品溶
液，分别按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，以
大黄酚色谱峰（24号峰）为参照峰，计算各共有峰
的相对保留时间和相对峰面积。结果表明,各共有峰
相对保留时间和相对峰面积稳定, RSD<3%，符合指
纹图谱分析要求，仪器精密度良好。
2.4.2　重复性试验　　取同一批次生大黄粉末5份，
精密称定,按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按
“2.1”项下色谱条件分别测定，记录指纹图谱。以
大黄酚色谱峰（24号峰）为参照峰，计算各共有峰
的相对保留时间和相对峰面积。结果表明,各共有峰
相对保留时间和相对峰面积稳定, RSD<3%，符合指
纹图谱分析要求，重复性良好。
2.4.3　稳定性试验　　取同一批次生大黄供试品溶
液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0 h、3 h、6 h、
9 h、12 h和24 h进样，记录色谱图。以大黄酚色谱峰（24
号峰）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相
对峰面积。结果表明,各共有峰相对保留时间和相对
峰面积稳定, RSD<3%，表明样品24 h内基本稳定。
2.5　样品测定
按照上述确定的供试品溶液的制备和检查方
法，分别对生大黄、熟大黄及无酒熟大黄供试品溶液
进行检测。
2.6　生熟大黄HPLC指纹图谱对比
取生熟大黄供试品溶液各10 μL分别注入液相
色谱仪，记录85 min色谱图（见图1）。以大黄酚色
谱峰（24号峰）的保留时间和峰面积为1，计算各主
要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。取同一批药
用大黄饮片自制的熟大黄，制成3批样品分别测定，
特征峰数据取均值，结果见表2。
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图 1 生熟大黄醇提物 HPLC 指纹图谱
Fig.1 HPLC-fingerprint of stewed rhubarb and rhubarb extracted by
methanol
注：20：芦荟大黄素；22：大黄酸；23：大黄素；24：大黄酚；25：
大黄素甲醚
表 2 生熟大黄醇提物指纹图谱相对保留时间和相对峰面积（254 nm）
Tab.2 Retention time and peak area in HPLC-fingerprint of stewed
rhubarb and rhubarb
峰号
相对保留时间 相对峰面积
生大黄 熟大黄 生大黄 熟大黄
1 0.074 — 0.374 —
2 0.091 0.090 0.492 0.308
3 0.099 — 0.283 —
4 0.116 — 0.283 —
5 0.151 — 0.511 —
6 0.179 — 0.357 —
7 0.309 0.308 4.514 0.251
8 0.322 0.321 1.693 0.114
9 0.366 0.365 3.437 0.207
10 0.398 — 0.658 —
11 0.409 — 1.169 —
12 0.415 — 0.320 —
13 0.478 — 0.398 —
14 0.499 — 0.650 —
15 0.511 — 0.241 —
16 0.532 0.531 0.237 0.099
17 0.576 0.574 2.129 0.147
18 0.590 0.588 4.502 0.305
19 0.614 0.611 2.280 0.114
20 0.769 0.768 0.394 0.463
21 0.797 — 0.369 —
22 0.874 0.873 0.278 0.318
23 0.979 0.979 0.393 0.516
24 1.000 1.000 1.000 1.000
25 1.024 1.025 0.376 0.214
注：“—”表示该处色谱峰相对峰面积极小或无特征峰，可以忽略。
图1及表2可以看出，相对于生大黄，熟大黄指
纹图谱各相应色谱峰或增或减几乎均有所变化。其
中，有12个色谱峰减弱至极小甚至消失（5、10、
11、14 号峰减弱至极小；1、3、4、6、12、13、
15、21号峰消失），但同时也有7个色谱峰明显增大
（2、16、20、22、23、24、25号峰）。
2.7　熟大黄和无酒熟大黄HPLC指纹图谱比较
取熟大黄及无酒熟大黄供试品溶液各10 μL分
别注入液相色谱仪，记录85 min色谱图（见图2）。
以熟大黄指纹图谱作为参照，采用国家药典委员会
《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》（科
研版）软件进行分析，结果见表3。
图 2 熟大黄和无酒熟大黄醇提物 HPLC 指纹图谱
Fig.2 HPLC-fingerprint of stewed rhubarb extracted by methanol
表 3 熟大黄与无酒熟大黄指纹图谱相似度考察结果
Tab.3 Similarity of the fingerprints from stewed rhubarb
熟大黄 无酒熟大黄 对照图谱
熟大黄 1.000 0.989 0.998
无酒熟大黄 0.989 1.000 0.997
对照图谱 0.998 0.997 1.000
3　讨论
本实验中分别考察了220、254、280、320、380
nm波长处的色谱图，结果表明色谱图在254 nm处各
色谱峰的峰形较好，色谱信息丰富，且分离度较好。
同时考察了甲醇—水溶液、乙腈—0.1%磷酸水溶液、
甲醇—0.1%磷酸水溶液三个流动相，结果表明以甲
醇—0.1%磷酸水梯度洗脱，峰型较好，分离度较高，
出峰多，故确定为本次实验的流动相。另外，实验考
察了60%甲醇、80%甲醇和甲醇作为样品的提取溶
媒，同时对提取方法及时间进行了考察，确定样品用
甲醇先浸泡12 h再超声提取30 min。
通过熟大黄指纹图谱与生大黄比较，有12个色
谱峰减弱至极小甚至消失，这可能是因为大黄在炮制
成熟大黄过程中某些不耐高温的化学成分受到高温
蒸汽的严重破坏所致；同时有7个色谱峰明显增加，
其中包括5个游离蒽醌类指标性成分，这可能与大黄
经炮制成熟大黄过后结合蒽醌类被破坏而减少，游离
蒽醌类增多有关，从而也佐证了熟大黄泻下攻积作用
减弱的药效学变化。
从熟大黄和无酒熟大黄醇提物HPLC指纹图谱的
比较来看，它们的相似度很高，差异甚微，表明熟大
(文下转第51页)
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2.4　最佳萃取工艺验证
初步得到最佳萃取工艺条件，将各个范围进行综
合试验考虑，本试验选取的优化工艺为PEG400质量
分数为15%， (NH4)2SO4浓度为3.4 mol·L
-1，pH值为
9.0、水浴温度为70℃、水浴时间为30 min和料液比
为1.00。
2.4.1　样品处理　　在最佳萃取工艺条件下，参照2.2
萃取盐酸小檗碱，共做3组平行试验，所得到的样品
参照2.2.3~2.2.4方法，得到浓度，再代入公式（1）、
（2），得到萃取率。
2.4.2　结果　　三组平行试验萃取率分别为
99.49%、99.40%、99.67%，平均值为99.52%，经过
双水相萃取后，除去了绝大部分水溶性杂质，提高了
盐酸小檗碱的浓度，使其后续纯化变得简单。
3　讨论
由以上研究可知，PEG400/双水相萃取盐酸小檗
碱时，相比小，分配系数大，分离效果好，而一般有
机溶剂对环境有一定危害，且产品中的残留量不易
除去。以选定的非离子表面活性剂PEG400/ (NH4)2SO4
构成的双水相体系用于盐酸小檗碱的萃取，最大的
分配系数可达819，最大平均萃取率99.52%，说明
小檗碱大部分被分配在表面活性剂富集相(上相)
中，而且大部分水溶性杂质留在下相盐溶液中，使后
续纯化过程变得方便。另外结果表明双水相体系中
PEG400浓度、 (NH4)2SO4浓度、pH值及温度等因素都
对双水相体系的相比、分配系数及小檗碱的萃取率均
有影响，试验得出最佳的萃取条件为PEG400的浓度
为15%， (NH4)2SO4的浓度为3.4 mol·L
-1，pH值为9.0，
温度为70℃，水浴时间为30min，料液比1.00。有关
盐酸小檗碱在PEG400/ (NH4)2SO4双水相体系中的分
配机理有待进一步研究。
从本文可以看出，双水相体系具有易操作、分离
快、萃取率高，且对环境无害的特点，表面活性剂可
以循环利用，为小檗碱的分离富集提供了一种有效的
方法，完全有望用于工业化生产。
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黄在炮制过程中加酒与否对其醇部位的化学成分是
没有影响的。然而，我们通过对两种熟大黄在活血化
瘀药效学作用方面比较发现，熟大黄明显优于无酒熟
大黄，这说明黄酒的加入对熟大黄的炮制具有重要意
义。因此，不能仅以指纹图谱相似度评价的方法来推
测药效，还有待进行更深层次的研究探索。
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