全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2016，28:257-261
文章编号:1001-6880(2016)2-0257-05
收稿日期:2015-09-23 接受日期:2015-12-21
基金项目:中国医学科学院药用植物研究所中央级公益性科研院
所基本科研业务专项基金(YNYZ-13-07)
* 通讯作者 Tel:86-013035998827;E-mail:lixiaohua1030@ 163． com
肾茶多酚提取工艺及其抗氧化活性研究
李晓花1，陈蕾西2，牛迎凤1，刘颖颖1，张丽霞1*
1西双版纳州傣药南药重点实验室 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所云南分所，景洪 666100;
2中国药科大学生命科学与技术学院，南京 210009
摘 要:采用回流提取法，进行单因素试验和 L9(3
4)正交试验，确定肾茶多酚最佳提取工艺;并通过测定 1，1-二
联苯基-2-苦肼自由基(DPPH·)和羟自由基(·OH)清除率评价其抗氧化活性。得到的肾茶多酚的优化提取工
艺为液料比 10∶ 1(mL/g)，50%乙醇回流 3 次，每次提取 2 h，肾茶多酚提取率为 3． 60%，优选的提取工艺稳定可
靠，重现性好。体外抗氧化活性实验结果显示:肾茶多酚的抗氧化能力随质量浓度的增大而增强，在 1 ～ 10 μg /
mL浓度范围内和 100 ～ 1250 μg /mL浓度范围内，其清除 DPPH自由基和羟基自由基的能力略强于抗坏血酸，两
者的对 DPPH自由基半数抑制浓度分别为 5． 78 和 6． 31 μg /mL;对羟基自由基的半数抑制浓度为 851． 1 和
940. 1 μg /mL。
关键词:肾茶;多酚;提取工艺;抗氧化活性
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2016． 2． 016
Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Clerodendranthus spicatus
LI Xiao-hua1，CHEN Lei-xi2，NIU Ying-feng1，LIU Ying-ying1，ZHANG Li-xia1*
1Key Laboratory of Dai and Southern medicine of Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture，Yunnan
Branch Institute of Medicinal Plant，Chinese Academy of Medical Sciences，Yunnan Jinghong 666100，China;
2Department of Life Science and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China
Abstract:Ｒeflux extraction method was used to extract the polyphenols from Clerodendranthus spicatus in this study． Sin-
gle factor experiments and the L9(3
4)orthogonal experiment was applied to optimize the extraction conditions． In addi-
tion，the antioxidant activities of the extract were evaluated by DPPH· and ·OH scavenging assays． The optimal ex-
traction conditions for extracting polyphenols were as follows∶ liquid /solid ratio of 10∶ 1 mL /g，ethanol concentration of
50%，2 h per time，and extract 3 times． Under the optimized conditions，the extraction yield of total polyphenol was up to
3． 60% ． In vitro antioxidant activity of total polyphenols increased with the increasing of concentration，the scavenging a-
bilities against DPPH· and ·OH were stronger than vitamin C within the range of 1-10 μg /mL and within the range of
100-1250 μg /mL，respectively． The IC50 values were 5． 78 and 6． 31 μg /mL toward DPPH·，and 851． 1 and 940． 1 μg /
mL toward ·OH，respectively．
Key words:Clerodendranthus spicatus (Thunb．)C． Y． Wu;polyphenols;extraction technology;antioxidant activity
肾茶［Clerodendranthus spicatus (Thunb．)C． Y．
Wu］，又名猫须草，为唇形科肾茶属植物，主产广东
海南，广西南部，云南南部，台湾及福建［1］;傣医药
中肾茶又称“雅糥妙”，入土、水塔，全草入药，有利
尿、抗菌、消炎、溶石、排石等作用。傣医书《档哈
雅》记载傣医用其治疗小便热涩疼痛、腰酸、腰痛等
泌尿系统疾病已有 2000 年历史，目前有袋泡茶应用
于临床。现代研究表明，肾茶在抗炎、抗菌、利尿排
石等方面有较好的疗效［2，3］;肾茶中富含多种化学
类型的成分，包括黄酮类、二萜类、三萜类、多酚及多
酚酸类等成分［4］。大量研究表明，植物多酚具有清
除自由基、抗氧化、延缓衰老，预防心血管疾病、防
癌、抗辐射等活性［5，6］。本研究在单因素实验基础
上，采用 L9(3
4)正交试验设计对肾茶中多酚的提取
工艺进行优化，并以 1，1-二联苯基-2-苦肼自由基
(DPPH·)和羟自由基(·OH)清除实验评价其抗
氧化活性，为肾茶的进一步开发提供依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 试药
肾茶，采自中国医学科学院药用植物研究所云
南分所试验基地，经张丽霞副研究员鉴定为唇形科
植物肾茶 Clerodendranthus spicatus (Thunb．)C． Y．
Wu的干燥全草;没食子酸购自中国食品药品检定
研究院(批号:110831-201204，纯度 89． 9%);福林
酚试剂(BＲ，南京奥多尼生物科技有限公司);DPPH
(BＲ级，98%，成都艾科达化学试剂有限公司) ;碳
酸钠、过氧化氢、水杨酸(分析纯，天津市大茂化学
试剂厂);硫酸亚铁(分析纯，上海第二钢铁厂)。
1． 1． 2 仪器
XL-5 型流水式粉碎机(上海润实电器有限公
司);721 型分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有
限公司);DＲＲH-S4 数显恒温水浴锅(上海双捷仪器
设备有限公司);PL 203 型电子天平(梅特勒-托利
多仪器(上海)有限公司)等。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 多酚标准曲线的建立
按照 GB /T8313-2008 介绍的 Folin-Ciocalteu 方
法建立标准曲线。准确称取 45 mg没食子酸对照品
(GA，相对分子量 188． 14)，蒸馏水溶解于 50 mL 棕
色容量瓶中摇匀定容待用。用移液管分别移取
1. 0、2． 0、3． 0、4． 0、5． 0 mL 的标准没食子酸溶液于
100 mL容量瓶中摇匀定容，其没食子酸的工作液浓
度分别为 0． 9、1． 8、2． 7、3． 6、4． 5 μg /mL。分别移取
不同浓度的没食子酸溶液与水(做空白对照)1 mL
于 10 mL棕色容量瓶中，加入 10%福林酚试剂 5 mL
摇匀后反应 3 ～ 8 min，加入 7． 5%碳酸钠溶液 4 mL，
混匀。将反应体系室温反应 2 h，在 765 nm 处测定
吸光值。以为吸光度(A)横坐标，为没食子酸浓度
纵坐标绘制标准曲线。
1． 2． 2 肾茶全草多酚的提取及测定
称取 1 g肾茶粉末，按照单因素和正交试验设
置的条件进行多酚回流提取，得到总多酚提取物;用
移液管移取 2． 5 mL多酚样液于 50 mL 棕色容量瓶
中，用提取溶剂稀释至刻度作为供试溶液;再吸取 1
mL供试溶液加入 5 mL10%的福林酚试剂，待反应 3
～ 8 min后加入 4 mL 7． 5%的碳酸钠溶液，30 ℃水
域 1 h后于 765 nm处测吸光值 A765，代入标准曲线
方程换算成稀释液中多酚含量值后按下式计算得到
多酚含量。
ω = C × V × N / 1000 M
式中:C—多酚浓度，μg /mL;V—提取液体积
(mL);N—稀释倍数;M—样品质量。
1． 2． 3 肾茶多酚提取单因素试验
肾茶全草经干燥、粉碎，称取 0． 5 g 干粉 /份，不
同溶剂浓度、不同液料比、不同提取时间和不同提取
次数的单因素条件下进行提取，提取液过滤后定容，
取适量提取液稀释至一定倍数，按 1． 2． 2 项下方法
进行检测，每个实验 3 次重复，取平均值。单因素实
验水平设定见表 1，实验结果见图 1。
表 1 单因素水平表
Table 1 Factors and levels for single factor experiments
因素 Factors 水平 Levels
乙醇浓度 Ethanol concentration (%) 0 30 50 70 95
液料比 Liquid-solid ratio (mL /g) 10 15 20 25 30
提取时间 Extraction duration 1 2 3 4 5
提取次数 Times of extraction 1 2 3 4 5
1． 2． 4 肾茶多酚提取正交试验设计
为了进一步优化提取条件，根据单因素试验结
果，选取 4 个因素:乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取
时间(C)、提取次数(D)，采用 L9(3
4)进行正交试
验，每个实验 3 次重复，取平均值。因素水平见表
2，正交试验结果见表 3，方差分析结果见表 4。
1． 2． 5 验证试验
取肾茶干粉 3 份，每份 0． 5 g，按照优选的提取
工艺 A2B1C2D3 进行 3 次验证实验，结果如表 5 所
示。
1． 3 抗氧化活性研究［7，8］
1． 3． 1 DPPH自由基清除能力的测定
将肾茶多酚提取液配成浓度为 1、2、3、4、5、6、7
μg /mL的溶液，移取 1 mL 多酚提取液与 3 mL，2 ×
10-4mol /L的 DPPH 溶液摇匀反应 30 min 后在 571
nm处测吸光值 A1;同时测定 1 mL对应浓度提取液
加入 3 mL无水乙醇反应 30 min 后的吸光值 A2;作
为对照，在 1 mL蒸馏水中加入 3 mL DPPH溶液反
852 天然产物研究与开发 Vol. 28
表 2 正交试验因素水平 L9(3
4)
Table 2 Factors and levels of L9(3
4)orthogonal experiments
水平 Levels
因素 Factors
A B C D
1 30 10 1 1
2 50 20 2 2
3 70 30 3 3
应 30 min 后测吸光值 A0，以抗坏血酸为阳性对照
组。每个实验做 3 份平行试验，取平均值，清除率计
算公式为:
清除率(%)=［A0-(A1-A2)］/A0 × 100
式中:A1—1 mL 多酚溶液与 3 mL DPPH 反应
后的吸光值;A2—1 mL 多酚溶液与 3 mL 无水乙醇
反应后的吸光值;A0—1 mL 蒸馏水与 3 mL DPPH
空白的吸光值。
1． 3． 2 羟基自由基清除能力测定
将多酚溶液的浓度配制成 100、250、500、750、
1000、1250 μg /mL的溶液，取 1 mL向试管中一次加
入 1 mL 9 mmoL /L的 FeSO4 溶液与 1 mL不同浓度
的多酚提取液、6 mL 9 mmol /L 的水杨酸溶液和 1
mL 9 mmol /L的过氧化氢溶液，室温放置 60 min 后
517 nm处测定吸光值 A1，以蒸馏水代替水杨酸在相
同条件下测吸光值 A2，将多酚提取液用蒸馏水代替
在相同条件下测吸光值 A0，每个实验 3 次重复，取
平均值。清除率按照下式计算:
清除率(%)=［A0-(A1-A2)］/A0 × 100
式中:A1—多酚与过氧化氢-水杨酸体系反应后
的溶液在 571 nm处测得的吸光值;A2—用蒸馏水代
替水杨酸与体系反应后测得的吸光值;A0—用蒸馏
水代替多酚提取液与体系反应后测得的吸光值。
2 结果与分析
2． 1 线性关系测定结果
没食子酸含量在 0 ～ 40 μg /mL 内与其吸光度
保持较好的线性关系，线性回归方程为 y =
47. 175x-0． 4903，相关系数 Ｒ = 0． 9994。
2． 2 单因素试验结果
由图 1 试验结果显示:乙醇浓度、液料比、提取
时间和提取次数均会影响肾茶多酚提取效果，在单
因素试验的基础上，正交试验因素水平设定为:乙醇
浓度设定为 30%、50%和 70%;液料比确定为 10∶ 1、
20∶ 1 和 30 ∶ 1(mL /g);提取时间因素水平为 1、2 h
和 3 h;提取次数设定为 1、2 和 3 次三个水平。
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0多
酚
提
取
率
Ex
tra
ct
io
n%
ra
te
(%
)
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0多
酚
提
取
率
Ex
tra
ct
io
n%
ra
te
(%
) 3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0多
酚
提
取
率
Ex
tra
ct
io
n%
ra
te
(%
)
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0多
酚
提
取
率
Ex
tra
ct
io
n%
ra
te
(%
)A B
C D
0 10%20%30%40%50%60%70%80%90 100 5 10% 15% 20% 25% 30% 35
0% 1% 2% 3% 4% 5% 6 0% 1% 2% 3% 4% 5% 6
乙醇浓度
Ethanol%concentration(%)
液料比
Liquid/solid%ratio(mL/g)
提取时间
Extraction%duration(h)
提取次数
Times%of%extraction
图 1 乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取时间(C)及提取次数(D)对肾茶多酚提取的影响
Fig. 1 Effects of ethanol concentration (A)，liquid /solid ratio (B) ，extraction duration (C)and times of extraction (D)on yield
of total polyphenols from C． spicatus
2． 3 正交试验优化结果
通过方差分析可知，各因素对多酚提取效率的
影响作用依次为:D ＞ A ＞ C ＞ B，即提取次数 ＞乙醇
浓度 ＞提取时间 ＞液料比;液料比对肾茶多酚提取
率影响最小，乙醇浓度和提取次数对肾茶多酚提取
率具有显著性影响(P ＜ 0． 05)。因此，肾茶多酚回
952Vol. 28 李晓花等:肾茶多酚提取工艺及其抗氧化活性研究
流提取优选工艺为 A2B1C2D3，即乙醇浓度为 50%、 液料比 10 倍、提取时间为 2h条件下提取 3 次，
表 3 肾茶多酚提取工艺正交实验结果分析
Table 3 Orthogonal experimental results for the extraction of total polyphenols from C． spicatus
序号
No．
因素 Factors
A B C D
多酚含量
Content of
polyphenols (%)
1 1 1 1 1 2． 43
2 1 2 2 2 2． 91
3 1 3 3 3 3． 00
4 2 1 2 3 3． 62
5 2 2 3 1 2． 73
6 2 3 1 2 3． 16
7 3 1 3 2 3． 05
8 3 2 1 3 2． 66
9 3 3 2 1 2． 82
Ⅰ 2． 78 3． 03 2． 75 2． 66
Ⅱ 3． 17 2． 77 3． 12 3． 04
Ⅲ 2． 84 2． 99 2． 93 3． 09
Ｒ 0． 39 0． 27 0． 37 0． 43
表 4 提取工艺方差分析
Table 4 Variance analysis of extraction technology
指标
Index
方差来源
Sources of variance SS f F p
A 0． 810 2 5． 013 0． 015
多酚含量 Extract rate (%) B 0． 424 2 2． 186 0． 134
C 0． 544 2 2． 963 0． 071
D 0． 954 2 6． 373 0． 006
2． 4 验证试验
按照最佳提取条件进行验证，多酚提取率平均
为 3． 6%，结果与正交试验中 4 号试验结果相近，由
此可见正交试验的结果可靠且工艺稳定可行。
表 5 验证实验结果
Table 5 Ｒesults of verification test
提取工艺
Extraction technology
重复 Ｒepetition
1 2 3
多酚平均含量
Content (%)
A2B1C2D3 3． 59 3． 63 3． 58 3． 60
由表 5 实验结果显示:优选的肾茶多酚提取工
艺稳定，重现性好，具有较高的多酚提取效率。
2． 5 肾茶多酚抗氧化活性实验
2． 5． 1 肾茶多酚清除 DPPH自由基的活性
由图 2 实验结果显示，肾茶多酚对 DPPH 自由
基的清除率略优于抗坏血酸，SPSS 13． 0 计算二者
的半数抑制浓度分别为 5． 78 和 6． 31 μg /mL。
2． 5． 2 肾茶多酚对羟基自由基的清除力
由图 3 结果显示，肾茶多酚提取物对羟基自由
基的清除率优于抗坏血酸效果，二者的 IC50分别为
851． 1 和 940． 1 μg /mL。
3 讨论与结论
自由基(Free radical)是指能独立存在，含有未
062 天然产物研究与开发 Vol. 28
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
抑
制
率
In
hi
bi
tio
n%
ra
te
(%
)
0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8
多酚 Polyphenols
Vc
浓度
Concetration(μg/mL)
图 2 肾茶多酚对 DPPH自由基的清除率
Fig. 2 DPPH· scavenging effect of polyphenols from C．
spicatus
0
浓度
Concetration(μg/mL)
70
60
50
40
30
20
10
0
抑
制
率
In
hi
bi
tio
n%
ra
te
(%
)
多酚 Polyphenols
Vc
200% 400% 600% 800 1000%1200%1400
图 3 肾茶多酚对羟基自由基的清除率
Fig. 3 ·OH scavenging effect of polyphenols from C． spicatus
成对电子的原子、原子团、分子或离子。在正常情况
下，人体内的自由基处于产生与清除的动态平衡之
中。生理状态下的自由基浓度是很低的，不仅不会
损伤机体，而且还显示出独特的生理作用，在调节细
胞间的信号传递和细胞生长、调节相关基因和信号
通路、诱导细胞增殖和凋亡、抑制病毒和细菌等方面
起重要的作用。但在病理情况下，如果自由基产生
过多或清除过慢，由于自由基非常活泼，化学反应性
极强，则可引起细胞生物膜上的脂质过氧化和蛋白
质、核酸(DNA)变性，导致细胞和组织损伤，诱发各
种疾病，造成生物体损害，甚至加速机体的衰老和死
亡。许多研究证明，体内自由基产生过多或清除能
力下降是疾病和衰老的“元凶”，它与全身性疾病
(如炎症、肿瘤、衰老、血液病、糖尿病等)和各脏器
疾病(如心、肝、肺、肾、脑、皮肤等)的发生均有密切
关系［9］。
本实验通过优化肾茶多酚的回流提取工艺，采
用正交试验设计法，优化的工艺条件为:10 倍量
50%乙醇回流 3 次，每次提取 2 h，肾茶多酚提取率
为 3． 60%。体外抗氧化活性结果显示:肾茶多酚具
有较强的抗氧化活性，且在一定范围内其抗氧化活
性与浓度呈现良好的量效关系。本实验可以为肾茶
的开发利用提供一定的实验依据。
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