全 文 ：JILIN AGRICULTURAL 53
2010 年第 09 期
（总第 247 期）
吉 林 农 业
JILIN AGRICULTURAL
NO.09，2010
（CumulativetyNO.247）
0 前言
自然杂交是高等植物基因组进化和新物种形成的主要动力之
一。杂交可以融合亲本种的适应性或创造出新的适应性，为植物
抵御不良环境、拓展新生境提供遗传基础 [1]。众所周知，生殖隔
离和独立的遗传谱系是植物“种”的基本特性之一，但部分亲缘
物种之间的生殖隔离可能不彻底，导致自然杂交现象在植物界比
较普遍。Ellstrand（1996） [2] 等通过调查发现全世界 16-34%科
和 6-16%属的物种之间存在自然杂交现象。但是，这一比例可能
远远低估了自然界中真实存在的杂交现象。主要原因在于植物分
类学者在鉴定标本时忽略了标注形态变异的标本有可能是杂交造
成的。此外，以往单纯依据形态特征上的居间性判断杂交并不十
分可靠 [3]。因为居间性也可以通过形态的趋同进化或者环境选择
造成的变异产生，而非杂交的结果。相反，一些形态上并非处于
亲本种间的个体，却有可能是杂交渗入造成的 [4]。近年来，利用
各种分子生物学手段不断在以往未曾记载的科属中发现种间自然
杂交现象。自然杂交和基因渐渗逐步成为保护生物学、生态学和
进化生物学领域关注的热点 [5]。
麻花艽（G. straminea Maxim.）和管花秦艽（G. siphonantha
Maxim.ex Kusn.）是龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gentiana）秦
艽组（sect. Cruciata Gaudin.）内的两个形态近缘种。笔者在青
海省曲麻莱县野外考察途中发现在同一草地环境中分布着形态居于
麻花艽和管花秦艽之间的过渡类群。其叶的形态与麻花艽相似，而
花序和花冠特征位于麻花艽与管花秦艽之间，具有典型的秦艽组形
态特征：单轴分枝，莲座丛叶位于植株中心，基部被枯存的纤维状
叶鞘包裹。尽管麻花艽的花期较管花秦艽为早，但在同域分布区内
三个居群的花期重叠，因此初步推测它们可能是麻花艽与管花秦艽
的自然杂交后代。张小兰等（2009）[6] 研究表明，秦艽组存在快速
成种的现象。物种之间的分化较小，生殖隔离可能不彻底；进一步
暗示这些具有中间形态的个体是两个物种杂交渗入造成的。为了验
证这个假设，我们选择疑似杂交种及其可能的亲本麻花艽和管花秦
艽作为研究对象，试图用 RAPD标记技术进一步明确它们之间的亲
缘关系，同时，也为其他植物杂交种的鉴定提供有益的参考。
1 材料和方法
1.1 材料来源
研究材料分别采自唐古拉山南北两侧，青海省曲麻莱县同一
草地环境生有典型的管花秦艽（顶生花序簇生呈头状，花冠深蓝色、
筒状钟形、花萼筒长 4-6mm）和麻花艽（二歧聚伞花序，花冠黄绿色、
漏斗形、花萼筒长15-28mm）；对于形态介于二者之间的疑似杂交群，
主要依据花颜色和花序结构确定：花为紫色、花序介于簇生与聚
伞花序之间。在野外仔细观察各居群形态特征后进行群体采样，
各居群个体之间的采集距离为 10m以上，作为对照，另采有 6个
不同地区的麻花艽居群。新鲜叶片用硅胶干燥保存。采集的相应
标本，经何廷农教授鉴定，两个亲本种的所有标本分别鉴定为管
花秦艽或者麻花艽，而中间形态标本则认为是一新变型。凭证标
本存于中国科学院西北高原生物研究所标本馆（HNWP）。各居群
具体采样情况见表 1。
表 1 材料来源及居群内遗传变异
凭证标本 采集地 N 经度 纬度 海拔 P Hpop
麻花艽 784 玛多、青海 19 97° 18´ 33° 23´ 4260 55.12 0.2577
麻花艽 844 称多、青海 21 98° 52´ 33° 19´ 3660 57.48 0.2875
麻花艽 913 玉树、青海 20 96° 38´ 32° 35´ 3300 48.03 0.2494
麻花艽 964 曲麻莱、青海 15 96° 09´ 34° 06´ 4400 55.12 0.2800
麻花艽 966 曲麻莱、青海 17 96° 26´ 33° 46´ 3930 49.61 0.2521
麻花艽 1091 当雄、西藏 20 91° 31´ 30° 36´ 4620 54.33 0.2817
麻花艽 1218 八宿、西藏 16 96° 39´ 29° 28´ 3940 48.82 0.2220
管花秦艽 963 曲麻莱、青海 22 96° 09´ 34° 06´ 4400 57.48 0.2936
疑似杂交群 961 曲麻莱、青海 18 96° 09´ 34° 06´ 4400 59.06 0.3197
N：居群采样数量；P：多态位点百分率；Hpop：Shannon 多样性指数
1.2 总 DNA的提取 PCR扩增
采用改进的 CTAB法从叶片中提取总 DNA，用 1.5%的琼脂糖
凝胶电泳检测。选择居群间地理位置相隔较远的 3个居群做 RAPD
预扩增，从 87个随机引物（购自上海生工）中最终获得了 15个
扩增条带清晰、重复性好、背景干净的引物。同时找出最佳反应
体系和扩增程序。引物及其序列见表 2。
表 2 RAPD引物一览表
引物 序列 引物 序列
S1382 GAGACCAGAC S1387 CTACGCTCAC
S1400 TTGCCTTCGG S1451 CAATCGGGTC
S1459 CTTGGCACGA S1503 TGCGGGAGTG
S1507 CACAGACCTG S1508 AAGAGCCCTC
S1512 CTCCCAGGGT S1514 CTCTCGGCGA
S1515 CCCACACGCA S1519 AGCCTCGGTT
S2125 CAAGCCGTG S2129 GGCTCTGGGT
S2130 GGGATAAGGG
反应体系为 25µl：1×PCR buffer（10 mmol/L Tris–HCl（pH
9.0），50mmol/L KCl， 0.1% Triton® X-100）；2.5mmol/L MgCl2，
100µmol/L dNTPs，0.5µM 引物，1.5units Taq DNA聚合酶，20-40ng
DNA模板。反应程序为：94℃ 60s， 36℃ 60s，72℃ 90s 2个循环，
接以 94℃ 45s，37℃ 60s，72℃ 80s38个循环，最后在 72℃保存
麻花艽和管花秦艽（龙胆科）之间自然杂交的RAPD分析
李小娟
（青海民族大学化学与生命科学学院，青海 西宁 810007）
摘要：利用 RAPD分子标记技术对同域分布区内麻花艽 (Gentiana straminea Maxim.）和管花秦艽（G.siphonantha Maxim.ex
Kusn.）及其形态位于二者之间的疑似杂交群进行亲缘关系分析。结果表明，疑似杂交群拥有麻花艽和管花秦艽各自的特征性谱带。表
明这些具有中间形态的个体是麻花艽和管花秦艽的自然杂交后代。
关键词：麻花艽；管花秦艽；自然杂交；RAPD
中图分类号：Q945.78 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-09-0053-3
54 JILIN AGRICULTURAL
7min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外成像系统观察并照相。
1.3 数据分析
RAPD是显性标记，每一个清晰可辨认的条带计为一个位点，
有带计为 1，无带、弱带计为 0。形成 0/1矩阵图输入计算机。为
衡量RAPD水平上的遗传变异程度，采用POPGENE v.1.31软件分析，
用 Shannon表型多样性指数计算遗传多样性。采用 NTSYS2pc 2.0
分析软件进行 UPGMA聚类分析。
2 结果
2.1 疑似杂交群及其亲本的 RAPD图谱特点
15个引物在 9个居群中共扩增出 127条带， 扩增 DNA片段
长度介于 200-2 000bp。每个引物扩增的多态性条带从 5-l3条不
等，平均为 8.4条。其中 110条具有多态性。总的多态条带百分
率（PPB）为 86.61%，各居群的多态性位点百分率（P）在 48.03-
59.06% 之间，在居群水平上的 Shannon 多样性指数（Hpop）在
0.2220-0.3197之间。疑似杂交群显示了最高的多态性位点百分
率（59.06%） 和 Shannon多样性指数（0.3197）（表 1）。
利用多个引物对青海曲麻莱地区同域分布的两个亲本物种的
所有个体进行 RAPD引物筛选，发现用引物 S1459扩增出的两条带
（190bp和 210bp）分别是管花秦艽（963）和麻花艽（964）的
特征带，前者出现在所有管花秦艽个体中，而在麻花艽中不存在；
后一条带出现在所有的麻花艽个体中，在管花秦艽中不存在。利
用这一引物扩增疑似杂交个体，这两条带都出现在所有的疑似杂
交个体中（图 1），从而初步证实这些个体是来源于管花秦艽和
麻花艽之间的杂交种。
图 1 引物 S1459的 RAPD扩增
注：1－ 6：来自麻花艽不同居群各一个体；7－ 12：疑似杂交种；13－ 17：管花秦艽，
*所指为疑似杂交种和亲本之一共有的 RAPD标记。
2.2 疑似杂交群及其推测亲本的亲缘关系分析
利用表型相似性系数（Jaccard系数）和遗传距离（Nei遗传
距离）对各居群样品之间的遗传关系进行了统计和分析（表 4）。
麻花艽 7个居群相似度和遗传距离在一定范围内变化（I=0.7783
－ 0.8869、D=0.1200-0.2506），说明麻花艽的遗传结构与生存
环境有很大的关系。采自青海曲麻莱同域分布区内的麻花艽（964）
与管花秦艽（963）居群之间遗传相似度最低和遗传距离最远
（I=0.8169，D=2022），而疑似杂交群（961）与麻花艽（964）
之间的相似性最高和遗传距离最近（I=0.8830、D=1245），与管
花秦艽（963）稍低（I=0.8421，D=1718）。
表 3 麻花艽、管花秦艽和疑似杂交种 9个居群的
遗传距离（D）和遗传相似度（I）
Pop ID 784 961 844 913 964 1091 1218 966 963
784 **** 0.8371 0.8396 0.7822 0.8650 0.8497 0.8526 0.8430 0.7836
961 0.1778 **** 0.8312 0.8137 0.8830 0.7999 0.7908 0.8665 0.8421
844 0.1748 0.1848 **** 0.8232 0.8735 0.8303 0.8204 0.8761 0.8257
913 0.2456 0.2061 0.1946 **** 0.8479 0.8053 0.7783 0.8355 0.7613
964 0.1450 0.1245 0.1352 0.1650 **** 0.8309 0.8230 0.8869 0.8169
1091 0.1628 0.2233 0.1860 0.2166 0.1852 **** 0.8416 0.8480 0.7821
1218 0.1594 0.2347 0.1979 0.2506 0.1948 0.1724 **** 0.8010 0.7756
966 0.1708 0.1433 0.1323 0.1798 0.1200 0.1649 0.2219 **** 0.8214
963 0.2439 0.1718 0.1915 0.2728 0.2022 0.2458 0.2541 0.1968 ****
注：对角线上为遗传相似度，下为遗传距离。
相似性反映在树状图上则更加直观。利用 Jaccard相似性系
数进行的 UPGMA聚类结果表明（图 2）：麻花艽 7个种群大致被
分为 2个分枝，其中来自西藏的 2个样本（1218、1091）和青海
玛多居群（784）聚为一枝，而来自青海的称多居群（844）和曲
麻莱的 2个居群（966、964）共 3个样本聚为另一枝。值得注意
的是，疑似杂交群（961）与同域分布区的麻花艽（964）和另一
个曲麻莱居群（966）首先聚为一类，再与麻花艽其他分布区的居
群（844、784、1218、1091、913）聚类，最后与管花秦艽（963）
聚类。由此可见疑似杂交群与麻花艽的亲缘关系较近，与管花秦
艽相对较远。表明这些杂交个体可能与麻花艽存在反复的回交，
从而拥有更多来自该物种的基因组成成分。
图2 麻花艽、管花秦艽和疑似杂交种9个居群聚类分析树状图（UPGMA）
3 讨论
在植物的系统演化过程中，杂交被认为是一个关键的现
象，是网状进化以及多倍体或部分二倍体物种形成的重要因素。
Ellstrand等（1996）在欧洲不列颠群岛、斯堪第那维亚和北美
大平原、美洲西部山区以及夏威夷等 5个物种区系研究中发现，
自然杂种在区系总物种数中所占的比例平均为 11%。但自然杂交
在各类群中并不是随机分布的，而是集中在一定的科属中，出现
的频率也与科属大小无关。杂交类群多数情况下发生在邻域或同
域的同一系或组的近缘种内 [7]，多年来，杂种形态特征上的居
间性一直被用作鉴定杂种的重要标准，但研究表明，尽管杂种表
现出亲本的混合或过渡性状，但亲本性状所占比例在不同杂种中
差异很大。因此，对于那些中间性状不明显或者不能确定亲本的
杂交种，则需要用更有说服力的证据加以论证。近年来，随着分
子生物学的迅速发展，一些新的方法，如等位酶、RFLP、RAPD、
ISSR、AFLP和 SSR等标记由于都是双亲遗传，可以根据遗传的叠
加性判断一个特定的植物是不是杂种，因而被广泛应用于杂交研
究和验证中。用 RAPD验证自然杂交最典型的例子是 Crawford等
（1993）[8] 发现在杂种 Margyracaena skottsbergii中存在双亲
Acaena argentea和 Margyracaena digynus的所有物种特异性谱
带，并且 RAPD证据与形态学上的推断完全一致。此后，RAPD方
法在杂种研究中被广为使用。从图 1可以清晰地看到， 利用引物
S1459可以使麻花艽（964）和管花秦艽（963）的特征性谱带（190bp
和 210bp）出现在所有的疑似杂交个体中，这个结果与形态学标
记结果相印证，充分说明了疑似杂交群是麻花艽和管花秦艽的杂
交后代。在后续研究中则需要通过发展单拷贝基因序列或者片段
来检查这些杂交后代是 F1还是 F2代以及深入探讨形态鉴定和遗
传标记之间的一致性。
从 Anderson（1949）提出杂交渐渗这个概念至今，有关杂
交的文献不胜枚举，青藏高原被称之为“世界第三极”，但发生
在这个特殊环境下的自然杂交的报道却并不多见。根据现有的文
献，Taylor G.1951 年发表了一个杂交种 Meconopsis x cookie
G. Taylor，该种仅见于青海省玛沁县等局部地区，50年后，袁
长春等 [9] 用核糖体 ITS区序列验证了此杂交种是红花绿绒蒿（M.
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punicea）和五脉绿绒蒿（M. quintuplinervia）的杂交后代；除
此以外，王晓茹等 [10] 采用等位酶分析方法证明中国青藏高原特
有种 -高山松（Pinus densata）是起源于第三纪的油松（Pinus
tabuliformis）和云南松（Pinus yunnanensis）的杂交种，宋葆
华等 [11] 通过进一步研究指出：高山松的形成不仅与青藏高原的
隆升有关，还和某种未知的或已灭绝的物种有联系，云南松和油
松只是部分的参与了它的起源。而龙胆科中有关杂交的报道仅见
于个别属种。如白金花属（Centaurium Hill.）[12] 等，且多被理
解为由于梯度变化形成的中间性状或变异性状。Bell[13] 采用遗传
学和形态学的方法研究了发生在 Sabatia section Campestrina
（Gentianaceae）的渐变群的渐渗，从而揭示了组间异种的可交
配性。对青藏高原特有属－龙胆属内的相关研究却未见报道。
生长在青藏高原的秦艽植物，近年来随着药用龙胆的不断开
发以及“竭泽而渔”式的掠夺性采挖，野生植物资源已遭到严重
破坏。管花秦艽和麻花艽都是高山特有种。生存地域非常狭窄，
对于研究植物区系的起源和演化、以及物种的形成、演化、传播
等问题具有重要意义。因此，探讨麻花艽和管花秦艽的自然杂交
还可以为保护基因资源提供科学的理论依据。
参考文献
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作者简介：李小娟（1970-），女，陕西凤翔人，青海民族大
学化学与生命科学学院讲师，研究方向：分子生态学。
（上接第 43 页）
表 2 鹿茸、鹿花盘蛋白提取物对溶血性链球菌的抑菌作用
PEConcentration
(mg/ml) A(11.20) B(5.60) C(2.80) D(1.40) E(0.70) F(0.35)
Control length
(mm) 0 0 0 0 0 0
VR length (mm) 2.0±0.5 4.0±0.3 6.0±1.1▲ 7.0±0.4 5.0±1.3 -
VA length (mm) 4.0±0.5 6.0±1.2 8.0±0.1▲▲ 6.0±1.3 3.0±0.5 -
AP length (mm) 6.0±1.3 5.0±0.6 10.0±0.5▲▲ 6.0±1.4 4.0±0.6 -
注：▲ P＜ 0.05，▲▲ P＜ 0.01，▲▲▲ P＜ 0.001
3 讨论
鹿茸、鹿花盘蛋白提取物所具有的抑菌作用，可能与所含成
分有关。范玉林 [5] 研究报道，鹿茸，鹿花盘具有诸多特殊药理作
用和鹿茸、鹿花盘所含成分有关。有机化合物是鹿茸、鹿花盘具
有特殊药理作用的物质基础，花鹿茸蛋白中谷氨酸、门冬氨酸、
丙氨酸、亮氨酸含量较高。鹿茸中还含有酸性粘多糖成分 [6]。驯
鹿茸主要含有胶质、磷酸钙、碳酸钙及氮化物等物质。鹿茸有效
成分可激发机体免疫系统防治和抵抗感染与疾病。
鹿茸、鹿花盘的多胺类物质是促进核酸和蛋白质合成的有效
成分。生物效应实验表明鹿茸中分离出多肽组分均具有抗炎和促
生长作用。其作用机理主要是刺激肝细胞核的 RNA—聚合酶Ⅱ的
活性，从而提高了蛋白质和 RNA的全成速度。鹿茸多肽主要含有
缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸，梅花鹿茸氨基酸含量高于驯
鹿茸高于鹿花盘，可能决定了三种鹿蛋白提取物抑菌效果的不同。
综上所述，三种鹿蛋白提取物抑菌作用研究，鹿花盘蛋白提
取物的抑菌效果最好，有待在抑菌抗炎方面进行系统研究。
参考文献
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项目来源：吉林省科技厅资助项目（20030224-2）及长春市
科技局项目资助（2008214）项目资助。
作者简介：黄金凤（1982-）, 女 , 吉林长春人 , 就职于吉林
农业大学生命科学学院，研究方向：微生物发酵及产品开发。
通讯作者：王莘（1959-），女，吉林农业大学生命科学学院
教授，研究生导师。