全 文 ：凉粉草基因组 DNA提取与分析
关杰敏 ,张桂芳＊ ,林 吉 ,徐鸿华　(广州中医药大学 ,广东广州 510006)
摘要　[目的 ]为分子生物学研究提供高质量 、高产量的凉粉草总 DNA。 [方法]采用改良 CTAB法提取总 DNA,通过测定 OD260 /OD280
值、琼脂糖凝胶电泳和RAPD扩增对所得DNA的浓度和质量进行检测 ,考察该方法对DNA的提取效果。 [结果 ]改良CTAB法提取的总
DNAOD260 /OD280值为 1.6～ 2.0;电泳条带清晰 , 完整性好 , 纯度高 ,总 DNA分子量与 λDNA相近;以所提DNA为模板进行 RAPD扩增
时 ,可得到稳定的扩增条带。 [结论]改良CTAB法适合凉粉草基因组DNA的提取。
关键词　凉粉草;基因组DNA;改良CTAB法;提取
中图分类号　S576　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)20-10575-03
GenomicDNAExtractionandAnalysisofMesonachinensisBenth.
GUANJie-minetal　(GuangzhouUniversityofChineseMedicine, Guangzhou, Guangdong510006)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtoprovidegenomicDNAofMesonachinensisBenth.formolecularstudying.[ Method] Genomic
DNAextractedwithmodifiedCTABmethodwastestedforitsconcentrationandquality, throughratioofOD260 /OD280andagarosegelelectropho-
resis(AGE)andRAPD-PCR, inordertostudytheextractioneffect.[Result] RatioofOD260 /OD280 ofgenomicDNA, showedbymeansofmodi-fiedCTAB, wasamong1.6-2.0.TheDNAstripwasclear, andtheintegritywaswelwithhigherpurity.Themolecularweightwassimilarwith
thatofλDNA.ThestableamplifiedstripscouldbeobtainedthroughRAPD-PCRamplificationwithtemplateoftheextractedgenomicDNA.
[Conclusion] ThemodifiedCTABmethodwasfavorableforextractionofgenomicDNAofMesonachinensisBenth.
Keywords　MesonachinensisBenth;GenomicDNA;ModifiedCTABmethod;Extract
　　凉粉草(MesonachinensisBenth.),又名仙人草 、仙人冻 、
仙草 、薪草 、黑豆腐草 、草板草等 ,为唇形科凉粉草属植物的
干燥地上部分 ,性寒 、甘 、淡凉 ,具有清热利湿 、凉血解暑等功
效 ,用于治疗中暑 、糖尿病 、高血压 、急性肾炎 、风火牙痛 、丹
毒 、梅毒 、黄疸等症 [ 1] 。近年来凉粉草作为清暑解渴 、药食两
用植物 ,其发展规模不断扩大。各地的种植选择与长期自然
进化使凉粉草种质发生了一些变异 ,因而有必要在分子水平
上对凉粉草种质资源多样性进行分析。基因组 DNA的提取
是获得基因或 DNA序列进行系统研究的基础 ,直接决定着
PCR扩增 、克隆等的进行。植物总 DNA的提取方法很多 。
CTAB法是一种获得质优 、量高与有效基因组 DNA的方法 ,
在药用植物 DNA提取中被广泛应用 [ 2-3] 。为此 ,笔者采用
改良 CTAB法对 19个不同产地或居群的凉粉草总 DNA进行
提取。
1　材料与方法
1.1　材料　供试凉粉草(MesonachinensisBenth.)由广州中
医药大学大学城校区 2号山体提供 ,移栽自广东平远南台药
业种植基地(表 1)。采集实地类型均为山坑田 。
基金项目　广东省科技厅中药现代化专项(K5080016);广东省高校师资
队伍建设科研启动课题。
作者简介　关杰敏(1986-),女 ,广东中山人, 硕士研究生 ,研究方向:复
方中药新药开发。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2010-05-21
1.2　方法
1.2.1　样品 DNA提取方法。取样品叶片 ,先用自来水冲
洗 ,在超净台上用灭菌重蒸水洗净 ,灭菌纸巾吸干水分 ,室
温下吹 0.5 ～ 1.0 h。称取 0.2 g样品叶片放于灭菌研钵
中 ,加 800 μlCTAB提取液和适量灭菌石英砂 ,冰浴快速研
磨成匀浆 ,小心转入 2 ml离心管中。在 65 ℃水浴中保温
20 ～ 40 min,在此期间间或转摇离心管使之混匀反应充分 。
取出离心管 ,冷却至室温后 ,加入等体积(约 800 μl)氯仿 /
异戊醇(24∶1)上下颠倒几次 ,充分混匀 , 10 000 r/min离心
15min。吸取上清液 300μl(注意不要吸起位于两相中间的
杂质层)于 1.5ml离心管中 ,加入 0.7体积预冷异丙醇(约
210 μl),缓缓地转动离心管 ,可见白色的 DNA絮状物 。 4
℃冰箱放置 20 ～ 120 min后 ,以 10 000 r/min离心 15 min,
弃上清液 ,管底出现白色沉淀为 DNA。将 DNA沉淀用
1 000μl浓度 70%乙醇洗 2次 , 10 000 r/min离心 5 min,倾
去乙醇。将 DNA置于超净台室温中干燥后 ,加 50 μl灭菌
重蒸水溶解 ,置 -20 ℃冰箱保存备用 。
表 1　材料来源
Table1　 Sourceofmaterials
编号No. 来 源Source 采集日期Colectingdate
1 广东增城市 2009-09-14
2 福建武平县栽培种 1(露丰 1号) 2009-09-14
3 广东平远县 2009-09-24
4 广东汕头朝阳区 2009-09-24
5 福建永安市 2009-09-26
6 福建新田县 1 2009-09-26
7 印尼 -广东汕头朝阳区杂交 2009-10-24
8 广西灵山县 2009-10-24
9 福建武平县栽培种 2 2009-12-26
10 福建武平县(种子苗 1) 2009-12-26
11 福建武平县(种子苗 2) 2009-12-26
12 福建武平县(种子苗 3) 2009-12-26
13 福建武平县(种子苗 4) 2009-12-26
14 福建永定县 2009-12-26
15 台湾关西 2009-12-26
16 广东阳春市 2010-01-02
17 印尼 2010-01-02
18 福建新田县 2 2010-01-02
19 广东潮州凤凰山 2010-01-02
1.2.2　DNA浓度 、纯度及质量检测 。取原液 2 μl,加预冷
灭菌重蒸水稀释到 150μl(稀释 75倍),搅拌混匀 ,移 50 μl
至微量样品池中 ,以 50 μl灭菌重蒸水为参比 ,用核酸蛋白
检测仪测定 DNA在波长 260、280 nm处的吸收值 ,利用下
列公式计算 DNA浓度和含量。
DNA浓度(μg/ml)=OD260 ×稀释倍数 /(0.02×L)
式中 , L为样品池光径(1 cm)。
DNA产率(μg/g)=DNA浓度(μg/ml)×提取 DNA体
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(20):10575-10577 责任编辑　刘月娟　责任校对　况玲玲
积(ml)/材料鲜重(g)
1.2.3　DNA琼脂糖凝胶电泳检测 。将 DNA用浓度 1.0%
琼脂糖凝胶(在稍微冷却的琼脂糖溶液中按 0.03 ～ 0.05
μl/ml的比例加入 goldview)、0.5×TBE电泳缓冲液进行电
泳 ,每个泳道上样量为 5 μlDNA样品液及 1 μl6×loading
Bufer, λDNA加 5 μl,在 80 V电压 、25 min条件下电泳。从
电泳槽中取出 ,放在凝胶成像系统上 ,观察 、拍照。
1.2.4　RAPD扩增及电泳检测 。将得到的基因组 DNA稀
释至 50ng/μl进行 PCR扩增。 20μlPCR反应体系为:1μl
DNA模板(50 ng/μl), 1.0 μl引物 S253(20 μmol/L),缓冲
液 2.0 μl, 1.6 μldNTP(各 2.5 mmol/L), 1.0 μlMg2+(25
mmol/L), 0.2 μlTaq酶(5 U/μl),加灭菌重蒸水至 20 μl。
RAPD扩增程序:94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 30 s, 35 ℃
退火 45 s, 72 ℃延伸 1min,循环 40次 , 72 ℃延伸 10 min, 4
℃保存 。将 PCR扩增产物与 6×Loadingbufer混匀 ,取 6μl
上样于浓度 1.5%琼脂糖凝胶中 ,电泳缓冲液为 0.5×TBE,
在 85 V电压下电泳 30 min。电泳结束后放在凝胶成像系
统上 ,观察 、拍照 。
2　结果与分析
2.1　DNA浓度 、纯度及质量检测结果　试验中 19个凉粉
草样品在提取过程中未出现褐化现象 ,初提的 DNA沉淀为
白色或无色 ,纯化后成无色透明。根据 OD260 /OD280 ,可判断
DNA的大致纯度。这是因为 DNA在紫外区有强吸收 ,最大
吸收波长为 260 nm,而蛋白质在 280 nm有强吸收 。如果
DNA中含有蛋白质 ,则 OD260 /OD280 <1.7;如果含有 RNA,
则 OD260 /OD280 >2.0。当 1.7≤OD260 /OD280 <2.0时 ,表明
DNA纯度很好 ,此时 DNA中蛋白质 、酚类物质和 RNA等杂
质含量符合要求 [ 4] 。由表 2可知 , 3 ～ 4、6 ～ 19号样品符合
质量要求 ,其 DNA受损程度低 ,纯度高 ,杂质去除较完全;
1、2、5号样品 OD250 /OD280均小于 1.7,说明 DNA中含有较
多蛋白质及多糖等杂质 ,需要进一步纯化 。
表 2　凉粉草叶片总 DNA检测结果
Table2　TheexaminationresultsoftotalDNAfromtheleavesofMesonachinensisBenth.
编号
No. OD2 60 OD280 OD260 /OD280
DNA浓度∥μg/ml
DNAconcentration
DNA产量∥μg/g
DNAyield
1 0.257 7 0.154 6 1.667 966.3 241.6
2 0.215 7 0.128 4 1.680 808.8 202.2
3 0.224 7 0.124 8 1.800 842.5 210.6
4 0.161 0 0.079 6 2.024 603.8 151.0
5 0.147 7 0.090 3 1.635 553.8 138.5
6 0.252 0 0.144 9 1.739 945.0 236.3
7 0.243 5 0.138 3 1.760 913.0 228.3
8 0.182 3 0.106 4 1.713 683.8 171.0
9 0.157 8 0.086 6 1.823 591.8 148.0
10 0.145 3 0.080 7 1.801 545.0 136.3
11 0.184 9 0.095 5 1.935 693.3 173.3
12 0.181 4 0.097 1 1.867 680.1 170.0
13 0.207 2 0.113 5 1.826 777.1 194.3
14 0.300 9 0.157 5 1.911 1128.4 282.1
15 0.221 0 0.120 2 1.839 828.8 207.2
16 0.219 6 0.111 0 1.978 823.4 205.9
17 0.220 9 0.114 7 1.926 828.4 207.1
18 0.257 9 0.141 6 1.821 967.1 241.8
19 0.261 0 0.144 3 1.809 978.8 244.7
2.2　电泳检测 DNA　改良 CTAB法提取的总 DNA用浓度
1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总基因组 DNA的有无及完整
性 。从图 1可以看出 , 19个凉粉草样品提取的总 DNA分子
　注:M为 λDNA。
　Note:MstandsforλDNA.
图 1　凉粉草总 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1　TheagarosegelelectrophoresismapoftotalDNAfrom
MesonachinensisBenth.
量与 λDNA相近 ,每条泳道均出现 1条清晰的 DNA条带 ,
条带完整性较好 ,无蛋白质 、RNA污染 ,无降解现象 。
2.3　RAPD扩增检测结果　由图 2可知 ,以改良 CTAB法
提取的凉粉草基因组 DNA为模板进行 RAPD扩增可获得
稳定的扩增谱带 ,说明采用该方法获得的凉粉草基因组
　注:1～ 5泳道分别为引物 253对样品 9 ～ 13的 RAPD扩增结
果;M为 DL2000。
　Note:1-5swimminglanesareRAPDamplificationresultsoftem-
plate9～ 13usingprimerS253;MstandsforDL2000.
图 2　凉粉草RAPD扩增结果
Fig.2　RAPD-PCRamplificationresultsofMesonachinensis
Benth.
10576 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
DNA适于进行 DNA的多态性研究。
3　结论与讨论
凉粉草属植物叶片含有酚类 、多糖类等次生代谢物 [ 5] 。
在提取过程中 ,酚类物质与空气接触后会迅速氧化使匀浆
液变褐 ,一般使提得的 DNA颜色深(呈浅褐色),并难溶于
水 。去除酚类物质关键在研磨植物材料时使其释放出来后
直接与提取溶液中的抗氧化剂接触 ,缩短其在空气中暴露
的时间 。多糖类物质在提取过程中常常会形成黏稠胶状
物 ,这种胶状物会和 DNA共沉淀而使 DNA产率大为减少 。
在基因组分析中需要高纯度 、高分子质量的基因组 DNA,其
提取过程包括破碎细胞;去除蛋白质 、多糖 、酚类等生物大
分子;去除盐类 、有机溶剂等杂质;浓缩和溶解 DNA。
植物 DNA的破碎细胞过程包括破壁与破膜。细胞壁
中含有的大量酚类 、多糖 、色素等物质 ,会给 DNA提取与纯
化过程带来麻烦。该试验采用冰浴研磨法 ,研磨时加入适
量石英砂(太少使研磨困难 ,时间加长;太多会致使最后提
取的 DNA量减少),动作要快速 ,最后研成匀浆;细胞膜破
除后 DNA才能释放 , CTAB缓冲液能够溶解细胞膜 ,还能有
效地去除多糖类杂质 ,而且 CTAB缓冲液作为裂解液的方
法提取的 DNA较纯 [ 6] 。植物材料采用鲜嫩幼小叶片 ,因其
DNA含量较多 ,纤维素与酚类物质较少 ,易于提取 。
CTAB液附加浓度 1%PVP酚类络合剂与叶片一起研
磨 ,可以有效避免酚类物质氧化褐变的干扰;笔者也尝试加
入抗氧化剂 β-巯基乙醇 ,但其去除酚类物质效果不明显 ,且
具有特殊臭味及毒性 ,因此试验不采取该方法。氯仿 /异戊
醇(24∶1)抽提可以有效去除蛋白质及其他杂质 ,因此不需
要加入有毒且有腐蚀性的苯酚;抽提时要上下颠倒几次 ,增
加材料与有机溶剂接触面 ,使充分混匀 ,以提高抽提效果;
另外 ,过多地抽提对 DNA纯度并无明显提高反而会严重降
低得率 ,通常 1 ～ 2次至两相界面无明显蛋白沉淀即可。
浓缩 DNA的常用试剂为异戊醇和乙醇。异戊醇的优
点是沉淀能力强 [ 7] ,加入量小 ,速度快 ,带入多糖杂质少 ,而
且小分子量 DNA也可以沉淀下来;而乙醇只能沉淀大分子
量的 DNA。但由于异戊醇难挥发 ,易使盐类 、蔗糖等与
DNA发生共沉淀 [ 8] 。沉淀后的漂洗则改用浓度 70%乙醇 ,
目的是为了去除样品中的异戊醇与盐分。该试验沉淀 DNA
时采用预冷的异戊醇 ,并用浓度 70%乙醇漂洗 2次。
溶解 DNA可以采用灭菌重蒸水或 TE缓冲液 。灭菌重
蒸水溶解适于 DNA短期保存 ,因为 DNA双链在水中很不
稳定 ,容易降解;TE缓冲液中含有 EDTA螯合剂 ,能有效地
抑制降解酶的消化反应 ,很好地保存 DNA。因此 ,提取后
DNA立即用于试验的可以用灭菌重蒸水溶解 ,需长期保存
的则用 TE缓冲液溶解 。
另外 ,还有一些需要注意的问题 。研磨成匀浆液转入
离心管后要立即放入温浴 ,否则随着时间越长 ,匀浆出现褐
化现象越明显 ,导致最后得到的 DNA量也减少。当溶液中
有胶状物时 ,离心转速必须适当提高 ,否则被胶状物裹夹的
植物材料无法沉淀 ,会随胶状物一同被吸出 [ 9] 。为了保证
基因组 DNA的完整性 ,各项操作应该温和 ,避免过度震荡
和搅拌 ,用剪去前端的较粗枪头吸取上清液 ,吸取过程中避
免产生气泡 ,加溶液时应顺着离心管壁流下 ,勿对着 DNA
沉淀冲洗 ,不要反复吸打来助溶 DNA。 DNA沉淀易滑落 ,
因此弃上清液时应特别小心。倾斜浓度 70%乙醇后用微量
加样器吸走上清液 ,迅速在超净台倒置于纸巾上进行干燥。
研究表明 ,所提取的凉粉草基因组 DNA的浓度和质量均能
满足 RAPD扩增的需要 , PCR产物具有很好的多态性 。因
此 ,可为今后的分子生物学研究打下坚实的基础 。
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科技论文写作规范———引言
扼要地概述研究工作的目的 、范围 、相关领域的前人工作和知识空白 、理论基础和分析、研究设想 、研究方法和实验设
计 、预期结果和意义等 。一般文字不宜太长 ,不需作详尽的文献综述。在最后引出文章的目的及试验设计等 。 “引言 ”两字
省略 。
1057738卷 20期　　　　　　　　　　　　　　　　关杰敏等　凉粉草基因组 DNA提取与分析