全 文 ：世界中西医结合杂志 2013年第 8卷第 1期 World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine 2013，Vol. 8，No. 1
·博士论坛·
基金项目:国家自然科学基金(No． 81273726) ，上海市西部开发科技
合作项目(No． 11495801300) ，上海市中医药事业三年行动计划首批
重大研究项目(ZYSNXD － CC － ZDYJ017) ，国家中医管理局中医肿
瘤重点学科合作项目(LHZLK － 1107) ，上海中医药大学杏林学者项
目及龙华医院国家中医临床研究基地“龙医团队、龙医学者”项目
(LYTD － 04)
作者单位:上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032
通讯作者:胡兵，Email:beearhu@ hotmail． com
蛇莓对人结肠癌 RKO细胞失巢凋亡作用的
实验研究
胡兵 沈克平 史秀峰 邓珊 魏蒙蒙
【摘要】 目的 观察蛇莓对人结肠癌 RKO细胞悬浮生长及失巢凋亡作用。方法 不同浓度蛇
莓作用 RKO细胞，CCK － 8(Cell Counting Kit － 8，CCK － 8)法检测蛇莓对 RKO细胞悬浮生长作用，双
嵌入剂乙锭均二聚物(Ethidium homodimer － 1，EthD － 1)染色检测失巢凋亡，比色法检测半胱天冬酶
－ 3(Caspase － 3)活性，二氯氢化荧光素二酯染色法结合荧光酶标仪检测细胞内活性氧的产生。结果
蛇莓可显著抑制 RKO悬浮生长，呈剂量依赖性。蛇莓作用后悬浮生长 RKO 细胞吸收 EthD － 1 散
发红色荧光，部分细胞可见核碎裂，呈现凋亡形态改变;蛇莓同时可显著增强 RKO细胞 Caspase － 3 活
性，升高细胞内活性氧水平。结论 蛇莓可抑制 RKO 细胞悬浮生长，促使 RKO 细胞发生失巢凋亡，
可能与活化 Caspase － 3 以及升高细胞内活性氧水平相关。
【关键词】 结肠癌;蛇莓;失巢凋亡;半胱天冬酶 － 3(Caspase － 3) ;活性氧
【中图分类号】R285． 5;R735． 3 + 5 【文献标识码】A 【文章编号】1673 －6613(2013)01 －0069 －04
Experimental Research of RKO Cell Anoikis Induced by Duchesnea Indica
in Human Colon Cancer
HU Bing，SHEN Ke － ping，SHI Xiu － feng，DENG Shan，WEI Meng － meng
(Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032)
【Abstract】 Objective To observe RKO cell suspending growth and anoikis induced by duchesnea
indica in human colon cancer．Methods Duchesnea indica of different concentrations worked on RKO cell．
CCK － 8(Cell Counting Kit － 8)method was used to detect the impact of duchesnea indica on RKO cell sus-
pending growth． Ethidium homodimer － 1(EthD － 1)staining was adopted to detect anoikis． The colorimetric
method was applied to detect caspase － 3 activity． The dichlorohyrogenated fluorescein diester staining method
and fluorescence microplate system were used to co － detect the production of reactive oxygen in the cell． The
fluorescent probe DCFH － DA was used to detect the reactive oxygen． Results Duchesnea indica inhibited
significantly RKO cell suspending growth，presenting dose dependence． After stimulated with duchesnea indi-
ca，RKO in suspending growth absorbed EthD － 1 and emitted red fluorescence． The nuclear fragmentation
was seen in a part of cells，presenting apoptotic morphological change． Duchesnea indica enhanced significant-
ly caspase － 3 activity in RKO cell and increased the level of reactive oxygen． Conclusion Duchesnea indi-
ca inhibits the suspending growth of RKO cell，promotes anoikis in RKO cell，which is probably related to the
activation of caspase － 3 and the increase of intracellular reactive oxygen level．
【Key words】 Colon Cancer;Duchesnea Indica;Anoikis;Caspase － 3;Reactive Oxygen
在血液或淋巴循环中存活并移动至远处靶器
官是肿瘤转移的关键生物过程。上皮来源肿瘤细
胞在血液或淋巴循环中存活与失巢凋亡(Anoikis)
相关。失巢凋亡现象由 Frish 等于 1994 年首次发
现。上皮类细胞依赖基质黏附提供存活信号，脱离
基质黏附将发生凋亡，即失巢凋亡。肿瘤细胞由于
基因表达或活性异常而获得一定程度的失巢凋亡
耐受，使得部分肿瘤细胞可以在血液或淋巴循环中
存活，最终导致肿瘤转移［1］。在适当的药物治疗
下，肿瘤细胞可以发生失巢凋亡，失巢凋亡已成为
肿瘤治疗新的靶标［2 － 3］。本研究在结肠癌细胞中观
察了蛇莓对 RKO结肠癌细胞失巢凋亡的作用。
材料与方法
一、实验材料
·96·
世界中西医结合杂志 2013年第 8卷第 1期 World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine 2013，Vol. 8，No. 1
细胞株与试剂:人结肠癌细胞株 RKO购自中国
科学院典型培养物保藏委员会细胞库;CytoSelectTM
24 － Well Anoikis Assay 为 Cell Biolabs 产品;Cell
Counting Kit － 8(CCK － 8)为 Dojindo 产品;poly －
HEMA购自 Sigma Aldrich 公司;Caspase － 3 活性检
测试剂盒为美国 Promega 公司产品;活性氧检测试
剂盒为江苏碧云天生物技术研究所产品;中药由龙
华医院中药房提供并鉴定。
二、实验方法
1．中药制备:参考文献方法制备中药［4］，蛇莓
300 g加 8 倍量水，浸泡 1 h，煎煮 2 次，每次 30 min，
收集中药煎液纱布粗虑去渣，合并滤液、浓缩，18
000 rpm离心 30 min，取上清加入等体积无水乙醇，4
℃过夜;18 000 rpm 离心 30 min，取上清液冰冻干
燥，称重，RPMI1640 溶解，调浓度至 400 mg·mL －1，
依次 0． 45 和 0． 22 μm 滤器过滤除菌，1 mL 分装，4
℃保存备用。
2．细胞悬浮生长检测:1 × 104 对数生长期 RKO
细胞接种于 poly － HEMA 包被 96 孔板，接种后第 2
天加入不同浓度中药或等体积 RPMI1640，每组 3 个
复孔;药物作用 24 h后加入 10 μL CCK －8，37 ℃反
应 2 h，酶标仪 450 nm波长检测各孔 OD值，按公式
计算细胞存活率:细胞存活率 =实验组 OD值 /对照
组 OD值。
3．失巢凋亡检测:1 × 105 对数生长期 RKO 细
胞接种于 poly － HEMA包被 24 孔板，接种后第 2 天
加入不同浓度中药或等体积 RPMI1640，每组 3 个复
孔;药物作用 24 h后加入 1 μL EthD － 1，37 ℃反应
1 h，荧光酶标仪检测各孔 OD 值(激发波长:525
nm，发射波长:590 nm) ，荧光显微镜下观察细胞
形态。
4． Caspase － 3 活性检测:1 × 106 对数生长期
RKO细胞接种于 poly － HEMA 包被直径 6cm 培养
皿，接种后第 2 天加入不同浓度中药或等体积 RP-
MI1640，每组 3 个样本;药物作用 24 h 后收集细胞，
按操作说明书采用酶底物法检测 Caspase － 3 活性。
5．活性氧检测:5 × 105 对数生长期 RKO 细胞
接种于 poly － HEMA 包被 6 孔板，接种后第 2 天加
入不同浓度中药或等体积 RPMI1640，空白组不作处
理，每组 3 个样本;药物作用 24 h 后收获细胞，加入
含 DCFH － DA 探针(10 μmol·L －1)的无血清 RP-
MI1640，37 ℃孵育 20 min，荧光酶标仪测各孔 OD
值(激发波长:488 nm，发射波长:525 nm)。
三、统计学处理
采用 SPSS 16． 0 统计软件进行统计分析，计量
资料以均数 ±标准差(x ± s)表示，组间差异比较采
用单向方差分析，组间两两比较用 LSD 法，以 P ＜
0． 05 为差异有统计学意义。
结 果
1．蛇莓对 RKO细胞悬浮生长影响:本研究采用
poly － HEMA 包被造模，促使 RKO 细胞悬浮生长，
结果显示 200 ～ 600 μg·mL －1蛇莓可以显著抑制
RKO细胞悬浮生长，与对照组比较差异有统计学意
义(P ＜ 0． 01) ，结果见表 1。
表 1 蛇莓对 RKO细胞悬浮生长作用(x ± s)
蛇莓(μg·mL －1) 例数 存活率(%)
对照组 3 99． 95 ± 0． 84
200 3 90． 26 ± 0． 95a
400 3 64． 63 ± 2． 61ab
600 3 29． 71 ± 1． 35abc
注:与对照组比较，aP ＜ 0． 01;与 200 μg·mL －1组比较，bP ＜
0． 01;与 400 μg·mL －1组比较，cP ＜ 0． 01
2．蛇莓对 RKO失巢凋亡作用:研究采用 CytoS-
electTM 24 － Well Anoikis Assay 试剂盒，以 EthD － 1
荧光染色检测失巢凋亡，结果显示蛇莓作用后 RKO
细胞可以吸收 EthD － 1 呈现红色荧光，部分细胞可
见核碎裂，结果见图 1;蛇莓不同剂量组荧光光密度
与对照组比较差异有统计学意义(P ＜ 0． 01) ，结果
见表 2;提示蛇莓可以促 RKO细胞失巢凋亡。
图 1 蛇莓对 RKO细胞失巢凋亡影响(× 200 倍)
3．蛇莓对 RKO 细胞 Caspase － 3 活性影响:研
究采用酶底物反应比色法检测蛇莓对悬浮生长
RKO细胞 Caspase － 3 活性影响，结果显示 200 ～ 600
·07·
世界中西医结合杂志 2013年第 8卷第 1期 World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine 2013，Vol. 8，No. 1
表 2 蛇莓对悬浮生长 RKO细胞吸收 EthD － 1 作用(x ± s)
蛇莓(μg·mL －1) 例数 EthD － 1(OD)
对照组 3 0． 10 ± 0． 02
200 3 0． 28 ± 0． 04a
400 3 0． 55 ± 0． 04ab
600 3 1． 16 ± 0． 05abc
注:与对照组比较，aP ＜ 0． 01;与 200 μg·mL －1组比较，bP ＜
0． 01;与 400 μg·mL －1组比较，cP ＜ 0． 01
μg·mL －1蛇莓可以显著增强悬浮生长 RKO 细胞
Caspase － 3 活性(P ＜ 0． 01) ，结果见表 3。
表 3 蛇莓对悬浮生长 RKO细胞 Caspase － 3活性影响(x ± s)
蛇莓(μg·mL －1) 例数 Caspase － 3(U)
对照组 3 1． 26 ± 0． 15
200 3 12． 60 ± 1． 75a
400 3 26． 04 ± 2． 34ab
600 3 55． 96 ± 3． 12abc
注:与对照组比较，aP ＜ 0． 01;与 200 μg·mL －1组比较，bP ＜
0． 01;与 400 μg·mL －1组比较，cP ＜ 0． 01
4．蛇莓对 RKO细胞内活性氧水平影响:研究采
用 DCFH － DA荧光染色法检测活性氧(Reactive ox-
ygen species，ROS)水平，结果显示 200 ～ 600 μg·
mL －1蛇莓可以显著升高悬浮生长 RKO 细胞内 ROS
水平，与对照组比较差异有统计学意义(P ＜ 0． 01)。
结果见表 4。
表 4 蛇莓对悬浮生长 RKO细胞 ROS生成影响(x ± s)
蛇莓(μg·mL －1) 例数 ROS(OD)
对照组 3 0． 26 ± 0． 05
200 3 0． 74 ± 0． 11a
400 3 1． 51 ± 0． 12ab
600 3 2． 06 ± 0． 14abc
注:与对照组比较，aP ＜ 0． 01;与 200 μg·mL －1组比较，bP ＜
0． 01;与 400 μg·mL －1组比较，cP ＜ 0． 01
讨 论
蛇莓是蔷薇科植物蛇莓 Duchesnea indica(An-
dr．)Focke 的全草，有清热解毒、活血散瘀、收敛止
血作用，中医临床常用于肿瘤的治疗。研究发现蛇
莓可以抑制卵巢癌、宫颈癌细胞增殖，提升细胞内
Bax /Bcl － 2 表达比例，促使细胞色素 C 从线粒体释
放，活化 Caspase － 3，进而诱导卵巢癌、宫颈癌细胞
凋亡;蛇莓同时还可抑制 Cyclin A、Cyclin E、Cyclin
D1 以及 CDK2 表达，并阻滞卵巢癌、宫颈癌细胞周
期于 S期［5 － 6］。蛇莓组分齐墩果酸还可以抑制肝癌
细胞增殖［7］。此外，有研究表明蛇莓可以抑制鸡胚
绒毛尿囊膜新生血管生成［8］。目前尚缺乏蛇莓对
肿瘤细胞失巢凋亡作用的研究。
poly － HEMA 是一种无毒阴离子聚合物，具有
均匀的非离子特性，铺在培养皿底部，可阻止细胞
贴壁，使得细胞只能悬浮生长，poly － HEMA 常用为
失巢凋亡研究模型［9 － 10］。本研究结果显示蛇莓可
以抑制结肠癌 RKO 细胞在 poly － HEMA 包被板中
的生长，提示蛇莓对悬浮生长结肠癌 RKO细胞具有
抗癌作用。EthD －1(Ethidium homodimer)是一种核
酸荧光染料，EthD －1 可以进入破损细胞结合核酸，
呈现红色荧光信号，但不能渗透活细胞，因此常用
作死亡细胞的荧光染色指示剂;CytoSelectTM 24 －
Well Anoikis Assay 试剂盒以 EthD － 1 为标记，结合
细胞在 poly － HEMA包被板悬浮生长检测细胞失巢
凋亡。本研究 EthD － 1 染色显示蛇莓作用后 RKO
细胞可以吸收 EthD － 1 呈现红色荧光，部分细胞还
可见核碎裂，提示蛇莓可以促使 RKO 细胞失巢
凋亡。
失巢凋亡是一种特殊形式的细胞凋亡，失巢凋
亡也是由 Caspase级联反应介导的。上皮细胞与胞
外基质黏附后经整合素介导，形成粘着斑(Focal ad-
hesion plaque) ，促使粘着斑激酶(Focal adhesion ki-
nase，FAK)构象变化而活化;FAK 下游信号转导与
MAPK、PI3K － AKT 等信号通路有关。细胞脱离基
质黏附后 FAK到 MAPK信号转导受到抑制，致使细
胞凋亡分子调控失常，活化 Caspases［11 － 12］。与细胞
凋亡一样，失巢凋亡也可以通过内源或外源通路，
分别活化 Caspase － 9 或 Caspase － 8，进而激活细胞
凋亡执行蛋白酶 Caspase － 3，引发失巢凋亡。本研
究发现蛇莓可以活化悬浮状态 RKO细胞 Caspase －
3，提示蛇莓对 RKO细胞失巢凋亡作用与 Caspase －
3 活性相关。
ROS是细胞在有氧代谢过程中产生一系列活
性氧簇，细胞内 ROS 水平变化可以引起肿瘤细胞一
系列与细胞增殖、凋亡相关信号通路的变化，提高
细胞内 ROS水平可活化细胞内 Caspases 活性，诱导
肿瘤细胞凋亡［13］。ROS 是中药活化 Caspase 信号
通路，介导抗癌作用的重要机制，已发现大黄素、姜
黄素等中药组分可以通过提高细胞内 ROS 水平促
使肿瘤细胞失巢凋亡［14 － 15］。本研究发现蛇莓作用
后 RKO 细胞内 ROS 水平显著升高，提示蛇莓对
RKO细胞失巢凋亡作用还与 ROS相关。
综上所述，本研究结果显示蛇莓可以抑制 RKO
细胞悬浮生长，促 RKO 细胞失巢凋亡，同时活化
RKO细胞 Caspase － 3，提升 RKO细胞内 ROS 水平;
蛇莓对 RKO失巢凋亡作用可能与 Caspase － 3 以及
ROS相关，值得进一步研究。
·17·
世界中西医结合杂志 2013年第 8卷第 1期 World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine 2013，Vol. 8，No. 1
参 考 文 献
［1］Simpson CD，Anyiwe K，Schimmer AD． Anoikis resistance and tumor
metastasis［J］． Cancer Lett，2008，272(2) :177 － 185．
［2］Coates JM，Galante JM，Bold RJ． Cancer therapy beyond apoptosis:
autophagy and anoikis as mechanisms of cell death［J］． J Surg Res，
2010，164(2) :301 － 308．
［3］Nagaprashantha L，Vartak N，Awasthi S，et al． Novel anti － cancer
compounds for developing combinatorial therapies to target anoikis －
resistant tumors［J］． Pharm Res，2012，29(3) :621 － 636．
［4］Hu B，An HM，Shen KP，et al． Polygonum cuspidatum extract induces
anoikis in hepatocarcinoma cells associated with generation of reactive
oxygen species and downregulation of focal adhesion kinase［J］． Evid
Based Complement Alternat Med，2012:607675．
［5］Peng B，Hu Q，Liu X，et al． Duchesnea phenolic fraction inhibits in
vitro and in vivo growth of cervical cancer through induction of apop-
tosis and cell cycle arrest［J］． Exp Biol Med(Maywood) ，2009，234
(1) :74 － 83．
［6］Peng B，Chang Q，Wang L，et al． Suppression of human ovarian SKOV
－3 cancer cell growth by Duchesnea phenolic fraction is associated
with cell cycle arrest and apoptosis［J］． Gynecol Oncol，2008，108
(1) :173 － 181．
［7］吴英俊，王超男，刘洁婷，等．蛇莓中齐墩果酸对肝癌细胞 SMMC
－7721 的抑制作用［J］． 中国生化药物杂志，2011，32(4) :306
－ 308．
［8］许扬，潘瑞乐，常琪，等．蛇莓抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管新生作用
研究［J］．中药药理与临床，2008，24(3) :65 － 67．
［9］Sakamoto S，McCann RO，Dhir R，et al． Talin1 promotes tumor inva-
sion and metastasis via focal adhesion signaling and anoikis resistance
［J］． Cancer Res，2010，70(5) :1885 － 1895．
［10］Kochetkova M，Kumar S，McColl SR． Chemokine receptors CXCR4
and CCR7 promote metastasis by preventing anoikis in cancer cells
［J］． Cell Death Differ，2009，16(5) :664 － 673．
［11］Simpson CD，Anyiwe K，Schimmer AD． Anoikis resistance and tumor
metastasis［J］． Cancer Lett，2008，272(2) :177 － 185．
［12］Chiarugi P，Giannoni E． Anoikis:a necessary death program for an-
chorage － dependent cells［J］． Biochem Pharmacol，2008，76(11) :
1352 － 1364．
［13］Circu ML，Aw TY． Reactive oxygen species，cellular redox systems，
and apoptosis［J］． Free Radic Biol Med，2010，48(6) :749 － 762．
［14］Cai J，Niu X，Chen Y，et al． Emodin － induced generation of reactive
oxygen species inhibits RhoA activation to sensitize gastric carcino-
ma cells to anoikis［J］． Neoplasia，2008，10(1) :41 － 51．
［15］Pongrakhananon V，Nimmannit U，Luanpitpong S，et al． Curcumin
sensitizes non － small cell lung cancer cell anoikis through reactive
oxygen species － mediated Bcl － 2 downregulation［J］． Apoptosis，
2010，15(5) :574 － 585．
(收稿日期:2012 － 09 － 06)
·信息·
全国中医、中西医结合防治老年痴呆及相关疾病学术交流会征文通知
老年痴呆及相关疾病，已成为威胁老人健康的“四大杀手”之一。为发挥中医、中西医结合在该医学领域中的优
势，由中华中医药学会主办，《世界中西医结合》杂志社、北京强寿老年病研究院承办的全国中医、中西医结合防治老
年痴呆及相关疾病学术交流会，拟于 2013 年 11 月举办，会议将邀请国内外知名的神经病学专家学者到会作专题报
告及学术论文交流，现将有关征文事宜通知如下。
一、征文内容
未在国内外杂志公开发表的，内容涉及阿尔茨海默病(血管性痴呆)、认知功能障碍、血管相关认知障碍及其他
类型痴呆、脑萎缩等疾病的基础、临床与药物研究新进展、经验总结等方面的论文皆可参会。
二、征文要求
1．稿件请注明作者姓名、单位、地址、邮编、电话、E － mail。2． 稿件以 Word 文档形式，题目三号字、小标题四号
字、内容五号字，统一宋体，发送至邮箱:fzlncd2013@ 126． com(注明会议论文)。3．截稿日期:2013 年 10 月 15 日。
三、特别提示
1．为方便参会代表相互学习交流，组委会将编辑优秀论文集。未提交论文者也可参加会议，参会代表可获得国
家继续教育Ⅰ类学分。2．相关会议动态可登录杂志社网站 www． zhongxi． org查询。
四、联系方式
电话(传真) :010 － 64822253 联系人:李绍林、鲍燕
通讯地址:北京市朝阳区北四环东路 115 号院 6 号楼 109 室 邮编:100101
·27·