全 文 ：2010年 1月 山东中医药大学学报 第 34卷第 1期
经导管肝动脉化疗栓塞术（TACE）已成为肝癌
非手术治疗的主要手段之一，但 TACE 的治疗不能
彻底杀灭肿瘤细胞 ［1］，TACE 后仅有 5%左右病例肿
瘤完全坏死，其余 95%的肿瘤包膜内外均可见存活
的癌细胞，残存的癌细胞具有很强的增殖和侵袭能
力，研究发现，这一现象与肿瘤细胞乏氧 ［2］有关。 部
分中药能改善机体血液循环，增加局部血流量，改善
局部乏氧状态，促进细胞凋亡，使抗癌药物易于发
挥作用，对放疗、化疗有增效作用［3-4］。 本实验通过对
Wistar 大鼠 TACE 后用中药罗勒胶囊进行干预，检
测肿瘤组织中乏氧诱导因子 1α（HIF-1α）和凋亡抑
制基因 Bcl-2 表达及相互关系，探讨中药罗勒胶囊
对肝肿瘤乏氧微环境的影响及意义。
1 材料和方法
1.1 材料 SPF 级 Wistar 大鼠 80 只，雌性，体质量
170～230 g（购于山东中医药大学实验动物中心）。
肿瘤细胞 Walker-256 瘤株购于上海医药工业研究
院。罗勒胶囊（有效成分为罗勒多糖，北京四环科宝
制药有限公司研发部提供）。 超液态碘油（上海华联
制药有限公司）。 5-Fu注射液（0.25 g/10 ml），上海旭
罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌 TACE后
HIF-1α和 Bcl-2表达的影响
冯 兵 1，史传文 2，郑广娟 3，刘福利 4
（1.山东中医药大学 2007年级硕士研究生，山东 济南 250355； 2.泰山疗养院，山东 泰安 271000；
3.山东中医药大学，山东 济南 250355； 4.山东省立医院，山东 济南 250021）
［摘要］ 目的：观察罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌行经导管肝动脉化疗栓塞术（TACE）后组织中乏氧诱导因子（α）
（HIF-1α）和凋亡抑制基因 Bcl-2 表达的影响，探讨该药对肝肿瘤乏氧微环境的作用。 方法：建立大鼠移植性肝癌模型
后，随机分为 5 组。对 TACE+ 生理盐水组和 TACE+ 罗勒胶囊大、中、小剂量组大鼠进行 TACE，并分别给予生理盐水
和大、中、小剂量罗勒胶囊灌胃，对非 TACE 对照组大鼠只进行开腹操作，不进行 TACE。 10 d 后取出移植性肝癌病理
标本，免疫组化法检测肿瘤组织中 HIF-1α 和 Bcl-2 表达情况。 结果：行 TACE 的 4 组大鼠瘤重与非 TACE 组比较均
明显减轻（P< 0.05），TACE+ 罗勒胶囊大剂量组瘤重较 TACE+ 生理盐水组显著减轻（P< 0.05）；HIF-1α 和 Bcl-2 阳性
表达率方面：TACE+ 生理盐水组与非 TACE 组比较显著升高（P< 0.01），TACE+ 罗勒胶囊大、中剂量组较 TACE+ 生
理盐水组显著降低（P< 0.05）。 结论：罗勒胶囊能使肿瘤组织中 HIF-1α 和 Bcl-2 表达降低，改善肝肿瘤局部的乏氧微
环境并促进细胞凋亡，抑制大鼠移植性肝癌 TACE 术后肿瘤的复发。
［关键词］ 罗勒胶囊；大鼠移植性肝癌；肝动脉化疗栓塞；乏氧诱导因子；凋亡抑制基因
［中图分类号］ R285.5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1007-659X（2010）01-0072-03
Effects of Luole capsule on expressions of HIF -1α and Bcl -2 for transplanted liver cancer in rats after
TACE FENG Bing1，SHI Chan-wen2，ZHENG Guang- juan3，LIU Fu- li4（1.Graduate for Master Degree of Grade 2007，
Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2.Taishan Sanatorium，Taian 271000,China；
3.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；4.Shandong Provincial Hospital，Jinan
250355，China）
［Abstract］ Objectives：To study effects of Luole capsule on expressions of HIF-1α and Bcl-2 for transplanted liver
cancer in rats after transcatheter arterial chemoembolization（TACE），and discuss the significance of the capsule on
hypoxia micro-environment. Methods：The liver tumor models were established and were randomly divided into five
groups：without TACE group，no medicine to use；TACE+ Saline（B）group，were given Saline after TACE，TACE+ large
dose Luole capsule（C）group，TACE+mid-dose Luole capsule（D）group，TACE+mini-dose Luole capsule（E）group，carry-
ing out different dose Luole capsule after TACE. After ten days，the tumors were taken out. To demonstrate the ex-
pression rates of HIF-1α and Bcl-2 with immunohistochemistry. Results：The tumor weights of the groups after TACE
were significantly reduced than A group（P< 0.05），the tumor weight of C group was reduced than B group（P< 0.05）.
The expression rates of HIF-1α and Bcl-2 of B group were higher than A group（P< 0.01）；the expression rate of
HIF-1α and Bcl-2 of C group and D group were lower than B group（P< 0.05）；the expression rate of HIF-1α and
Bcl-2 between C group and D group were different（P< 0.05）. Conclusion：Luole capsule could depress the expressions
of HIF-1α and Bcl-2，could obviously improve local hypoxia micro-environment in liver tumor rats and inhibit rat
liver transplant tumor recurrence after TACE.
［Key words］ Luole capsule；transplanted liver cancer in rat；transcatheter arterial chemoembolization（TACE）；hypoxia
inducible factor；apoptosis suppressor gene
［收稿日期］ 2009-08-05
［基金项目］ 山东省自然科学基金资助项目（J07YD07）
［作者简介］ 冯兵（1983- ），男，湖北十堰人，硕士研究生，主要从
事中医药防治肿瘤转移的研究。
第 34 卷 第 1 期 山东中医药大学学报 Vol．34，No．1
2010 年 1 月 JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY OF TCM Jan.2010
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2010年 1月 第 34卷第 1期冯兵等：罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌 TACE 后 HIF-1α 和 Bcl-2 表达的影响
表 2 各实验组肿瘤组织 HIF-1α
和 Bcl-2 免疫组化表达结果（x±s） %
n HIF-1α 阳性
表达率
Bcl-2 阳性
表达率
非 TACE 对照组 11 32.36±1.86 9.04±1.02
TACE+生理盐水组 9 59.41±3.18** 12.38±0.59**
TACE+罗勒大剂量组 9 41.23±2.44**△△ 9.81±0.75△△
TACE+罗勒中剂量组 10 47.72±3.08**△△# 11.09±1.46**△#
TACE+罗勒小剂量组 9 56.51±2.78**## 11.74±0.87**##
与非 TACE 对照组比较 **P＜0.01； 与 TACE+生理盐水
组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与 TACE+罗勒大剂量组比较
#P＜0.05，##P＜0.01
东海普药业公司生产。 Anti-Bcl-2、RabbitAnti-HIF-
1alpha（bs-0737R），北京博奥森生物技术有限公司生
产。 SP-9001 免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒（北
京中杉金桥生物有限公司生产）。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立 将 Walker-256 瘤株接种
于传代 Wistar 大鼠右后肢内侧皮下，1 周后皮下长
出肿瘤结节者待用。 无菌条件下取出实体瘤，切成
1 mm3 大小的碎块备用。 将 80 只实验大鼠腹腔麻
醉，打开腹腔，暴露肝脏，用眼科镊刺破肝包膜，于肝
表面成 30°角刺入 3～5 mm，形成一隧道，然后将取
出的瘤块植入，用小块明胶海绵封堵创口，压迫止血
待无持续岀血后逐层关腹，消毒手术切口 ［5］。 术后
10 d经超声检测选取肿瘤长至 1 cm的 65只大鼠。
1.2.2 带瘤大鼠 TACE 治疗 将造模成功的 65 只
大鼠，随机分为 5 组，每组 13 只：非 TACE 对照组、
TACE+ 生理盐水组 、TACE+ 罗勒胶囊大剂量组 、
TACE+ 罗勒胶囊中剂量组、TACE+ 罗勒胶囊小剂
量组。 对 TACE四组大鼠进行 TACE，对非 TACE 对
照组大鼠只进行开腹操作，不进行 TACE。 沿上次手
术切口逐层剪开腹腔，在手术显微镜下，用眼科弯镊
分离肝总动脉和胃十二指肠动脉，经胃十二指肠动脉
将自制的微导管插至肝固有动脉内，经导管分别注入
5-Fu 20 mg/kg，加超液态碘油 0.5 ml/kg，术后拔管，结
扎胃十二指肠动脉近端，分笼饲养［6-7］。 TACE成功后，
对 TACE+ 罗勒胶囊大、中、小剂量组分别灌胃罗勒
胶囊 30 mg/100 g·d-1、15 mg/100 g·d-1、7.5 mg/100 g·d-1，
TACE+ 生理盐水组给予生理盐水 1 ml/100 g·d-1，非
TACE组不予用药，连续灌胃 10 d。 由于手术过程复
杂及感染等原因，部分大鼠死亡。 取出移植肿瘤肝叶，
剥离肿瘤，称重。 免疫组化法检测肿瘤组织中 HIF-1α
和 Bcl-2的表达。
1.2.3 免疫组织化学的检测与判定 采用链霉素亲
和过氧化物酸（SP）法进行免疫组化染色，操作步骤
按照试剂盒说明进行。 光镜下观察并拍照，每组 30
个视野计数表达 HIF-1α 和 Bcl-2 的瘤细胞数，计算
阳性细胞表达百分率。
1.3 统计学处理 实验数据采用统计软件包 SPSS
13.0进行统计分析处理，以均数±标准差表示，采用
单因素方差分析，以 P< 0.05为差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 大体观察 五组荷瘤大鼠的肝叶均见肿瘤生
长，呈圆形，结节状，无包膜，灰白色，鱼肉样，质硬。
各实验组大鼠移植性肝癌瘤质量比较见表 1。 表明
罗勒胶囊可以降低 TACE 术后大鼠肝癌瘤质量，对
术后大鼠移植性肝癌细胞增殖有抑制作用，且与用
药剂量有一定关系。
2.2 HIF-1α的表达 光镜下观察切片，HIF-1α表达
阳性细胞为镜下组织细胞结构清晰，细胞浆（部分细
胞核）内有棕黄色颗粒沉着，染色明显高于背景。 各
实验组肿瘤组织 HIF-1α 和 Bcl-2 免疫组化表达结
果见表 2。
非 TACE 对照组：肿瘤组织及肿瘤周边肝组织
中，HIF-1α 阳性表达细胞可见，阳性表达的棕黄色
颗粒较多见于肿瘤边缘细胞的胞浆和细胞核中，肿
瘤中心部分阳性细胞染色多呈淡黄色，且多见于细
胞核染色。 正常肝组织无染色或染色极弱。
TACE+ 生理盐水组：肿瘤组织及肿瘤周边组织、
坏死组织 HIF-1α 阳性表达细胞可见，且较非 TACE
对照组多见，染色深浅较均匀；肿瘤组织阳性细胞胞
浆染色为棕黄色，较非 TACE对照组染色深。
TACE+ 罗勒大剂量组：HIF-1α阳性表达细胞较
TACE+ 生理盐水组显著减少，集中出现在有炎细胞
浸润的肿瘤细胞中，且阳性细胞内的黄色颗粒染色
较均匀。
TACE+ 罗勒中剂量组：肿瘤组织、肿瘤周边组
织及有纤维结缔组织包绕的瘤细胞条索内，HIF-1α
阳性表达细胞可见，较 TACE+ 生理盐水组少，染色
浅较均匀，阳性颗粒染色为棕黄色。
TACE+ 罗勒小剂量组：肿瘤组织及肿瘤周边组
织中，HIF-1α阳性表达细胞可见，染色浅，较均匀。
2.3 Bcl-2的表达 Bcl-2基因表达产物主要位于细
胞浆，染色阳性呈棕褐色，在瘤内坏死区周围及栓塞
后残存癌组织中可见灶状分布的 Bcl-2 阳性染色细
胞，而在瘤周正常肝细胞染色较弱，染色明显高于背
景。 各实验组肿瘤组织 Bcl-2 免疫组化表达结果见
表 2。
非 TACE 对照组：肿瘤组织中细胞胞浆中呈阳
性表达的棕褐色颗粒较多见，肿瘤周边细胞染色较
表 1 各实验组大鼠移植性肝癌瘤质量比较（x±s） m/g
n 瘤质量
非 TACE 对照组 11 3.295±0.876
TACE+生理盐水组 9 2.540±0.691*
TACE+罗勒大剂量组 9 1.924±0.515**△
TACE+罗勒中剂量组 10 2.396±0.628*
TACE+罗勒小剂量组 9 2.458±0.735*
与非 TACE 对照组比较 *P< 0.05，**P< 0.01； 与 TACE+生
理盐水组比较△P< 0.05
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2010年 1月 山东中医药大学学报 第 34卷第 1期
淡。 正常肝组织染色较弱。
TACE+ 生理盐水组：肿瘤组织及坏死组织中
Bcl-2 阳性表达细胞较非 TACE 对照组多见，染色深
浅较均匀；肿瘤组织阳性细胞胞浆染色为棕褐色，较
非 TACE对照组染色深。
TACE+ 罗勒大剂量组：Bcl-2 阳性表达细胞集
中出现在有炎细胞浸润的肿瘤细胞中，阳性表达细
胞内的棕褐色颗粒染色较均匀，较 TACE+ 生理盐水
组显著减少。
TACE+ 罗勒中剂量组：Bcl-2 阳性表达细胞在
肿瘤组织、肿瘤周边组织中可见，较 TACE+ 生理盐
水组少，较 TACE+ 罗勒大剂量组增多，染色浅，较均
匀，阳性颗粒染色为棕褐色。
TACE+ 罗勒小剂量组：Bcl-2 阳性表达细胞在
肿瘤组织及肿瘤周边组织中可见，较非 TACE 对照
组和 TACE+ 罗勒大剂量组增多，染色浅，较均匀。
3 讨论
TACE 后只有部分癌细胞因缺乏营养和缺氧死
亡，而另外一部分癌细胞实际处于一种乏氧的环境
中，部分患者 TACE 后短期内肝内出现多处或弥漫
性播散灶或肺内多发转移灶。 根据已有的文献资
料，TACE 致肝癌灶乏氧，而乏氧可诱导多种基因、
蛋白如 HIF-1α、Bcl-2、血管内皮生长因子（VEGF）、
尿激酶型纤溶酶原激活物受体（UPAR）、血管素、
PDGF 等的表达而促进肿瘤的侵袭、血管形成与转
移［8］。肝癌细胞在乏氧状态下发生适应性调节，HIF-1α
是调节氧稳态平衡的主要调节因子，在生理和病理
过程中起关键作用［5］。 最新的研究资料显示，许多实
体瘤都稳定高表达 HIF-1α，通过多个环节促进肿瘤
转移：①HIF-1α上调凋亡抑制基因 Bcl-2，抑制凋亡，
从而增强肿瘤侵袭转移力 ［9］；②HIF-1α 在肿瘤发生
早期向血管生成型转变过程中，介导了 VEGF 的上
调，对 VEGF的表达具有重要的调节作用；③HIF-1α
通过与靶基因上的乏氧反应元件（HRE）结合，诱导
下游靶基因的转录而产生系列生物学效应，增加与
无氧代谢有关的基因转录而使 ATP生成增加［10］。
细胞凋亡与肿瘤的形成密切相关 ［11］，细胞凋亡
途径的紊乱将导致细胞发育异常，从而引起并加速
肿瘤的发生和恶化。 细胞凋亡受凋亡抑制基因和凋
亡促进基因的调控。 Bcl-2是一种重要的凋亡抑制基
因，通过抑制凋亡而延长细胞寿命，最终使一些具有
突变倾向的细胞跨过凋亡环节，而不断增殖生长得
以形成肿瘤。 在正常肝组织中，Bcl-2 不表达或低表
达，在多数原发性肝细胞癌中 Bcl-2 高表达，其阳性
率明显高于癌前组织。 Bcl-2 能抑制细胞的凋亡，导
致肝癌发生。
本实验结果显示 ，与非 TACE 对照组比较 ，
TACE+ 生理盐水组肿瘤组织中 HIF-1α 的阳性表达
明显增强（P< 0.01），表明 TACE 造成了术后肿瘤乏
氧的形成，使肿瘤局部微环境中 HIF-1α 表达增高。
与 TACE+ 生理盐水组比，TACE+ 罗勒大、中剂量组
HIF-1α 表达率均显著降低（P< 0.01），TACE+ 罗勒
小剂量组与 TACE+生理盐水组无显著性差异
（P> 0.05）；TACE+ 罗勒大剂量组与 TACE+ 罗勒中、
小剂量组比较均有显著性差别（P< 0.05，P< 0.01）。 说
明罗勒胶囊可以改善肿瘤局部乏氧状况，使与肿瘤
乏氧密切相关的 HIF-1α 表达显著下降，且这一作用
与用药剂量有一定关系。
与非 TACE 对照组比较，TACE+ 生理盐水组肿
瘤组织中 Bcl-2 阳性表达率显著增高（P< 0.01），表
明由于 TACE 造成局部缺氧，刺激 Bcl-2 的表达增
加，从而可使癌细胞减少因缺氧而造成的损伤；与
TACE+生理盐水组比较，罗勒大、中剂量组 Bcl-2 阳
性表达率均显著降低，以罗勒大剂量组降低最为明
显（P< 0.01），其机制可能为罗勒胶囊减少了肿瘤乏
氧刺激所致 Bcl-2 的表达增加，从而促进了肿瘤细
胞的凋亡。 实验还显示移植性肝癌大鼠 TACE 术后
肿瘤组织中的 HIF-1α 与 Bcl-2 阳性表达率成正相
关 （P< 0.01，r=0.9889），提示 HIF-1α 可通过上调
Bcl-2 表达而抑制肝癌细胞的凋亡，进一步说明罗勒
胶囊改善肿瘤乏氧状态与促进肿瘤细胞凋亡密切相
关。
中药罗勒胶囊能明显改善大鼠移植性肝癌
TACE 术后肿瘤局部的乏氧微环境，使肝癌组织中
HIF-1α 的表达显著下降，并下调 Bcl-2 的表达；肝癌
组织中 Bcl-2 的表达与 HIF-1α 的表达有相关性；经
罗勒胶囊治疗大鼠术后瘤体减小，瘤质量下降；表明
罗勒胶囊可能通过改善术后肿瘤乏氧而起到间接抑
制肿瘤细胞增殖的作用，且具有一定的剂量依赖性。
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