全 文 ：[ 基金项目] 山东省自然科学基金资助(编号:J07YD07)。
[ 作者简介] 史传文(1982-),男 ,山东泰安人 ,住院医师 , 研究
方向:中西医结合基础专业肿瘤侵袭转移的防治研究。
罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌 TACE术后乏氧微环境中
HIF-1α、VEGF及血清 sICAM-1表达影响的研究
史传文1 ,刘福利2 ,梁晓东3 ,史妍婷3
(1.山东省泰山疗养院 ,山东泰安 271000;2.山东省立医院消化内科 ,山东 济南 250022;3.山东中医药大学 ,山东 济南 250355)
　　[ 摘要] 目的:观察罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌 TACE 术后乏氧微环境中 HIF-1α、VEGF 及血清 sICAM-1 表达的影响。
方法:将大鼠肝包膜下种植法建立的大鼠移植性肝癌模型分为 5 组:非 TACE 对照组 、TACE+NS 对照组 、TACE+罗勒胶囊
大剂量组 、TACE+罗勒胶囊中剂量组 、TAC E+罗勒胶囊小剂量组。对于非 TACE对照组大鼠只进行开腹操作 ,不行 TACE
术 ,其余 4 组大鼠均行 TACE 术;术后分别给予不同剂量罗勒胶囊灌胃治疗。 10 d 后处死大鼠 , 取出瘤块 ,观察形态学变化;
采用免疫组化法检测瘤块中 H IF-1α、VEGF 的表达情况 ,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定大鼠血清中 sICAM-1 表达
情况。结果:与 TACE+NS 组比较罗勒胶囊大剂量组瘤重明显降低(P <0.05);与非 TACE 组比较 , TACE+NS 组 HIF-1α、
VEGF及血清 sICAM-1 的表达均增高(P <0.05);罗勒胶囊治疗组 HIF-1α、VEGF 表达及血清 sICAM-1 较TACE+NS 组表
达显著降低(P <0.05),肝癌组织中 VEGF(P <0.01 , r=0.428)、血清 sICAM-1 的表达与 HIF-1α(P <0.01 , r =0.601)的
表达具有明显相关性。结论:罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌具有改善 TACE 术后乏氧的作用 ,并通过降低术后肿瘤乏氧微环境
中 H IF-1α和 VEGF 及血清 sICAM-1 的表达 ,而起到对 TACE 术后肝癌侵袭转移的抑制作用。
　　[ 关键词] 罗勒胶囊;大鼠移植性肝癌;经导管肝动脉化疗栓塞;乏氧诱导因子 1α;侵袭转移
[ 中图分类号] R735.7;R816.5　　　[ 文献标识码] A　　　DOI:10.3969/ j.issn.1672-0512.2010.02.002
Research of Basil capsule on expression of HIF-1α, VEGF in hypoxia environmental and sICAM-1 inblood serum after TACE of rat
hepatoma　S H I Chuanwen , LIU Fuli , LIANG X iaodong , et al.Taishan Sanita rium of Shandong Province , Taian , 271000 ,
China.
[ Abstract] Objective:To obse rve the influence of Basil capsule on expression of HIF-1α, VEGF and sICAM-1 in blood se rum.In
hypoxia environmental af te r TACE of r at hepatoma.Methods:Anima ls were r andomly divided into five g roups af te r models
were built:non-TACE group , TACE +NS g roup , TACE+mini-dose Basil capsule g roup , TACE+ middle-do se Basil capsule
gr oup , TACE+ larg e do se Basil capsule g roup.Fo r non-TACE g roup rats w ere only for abdominal ope rations , without TACE
technique.The remaining four g roups o f ra ts w ere car ried out TACE technique.Car ried out different do se s of Basil capsule ga-
vage tr eatment af te r TACE.Ten day s later , sac rifice the rats.Detected the expression of H IF-1α, VEGF in hepa toma focus with
immunohistochemistry me thod.Detected the level of sICAM-1 w ith EL ISA.Results:Compared w ith the g roup o f Non-TACE ,
TACE +NS g roup had a highe r expre ssion of VEGF , HIF-1α, and SICAM-1 in blo od serum(P <0.05).Different do se Basil
capsules had a lowe r expre ssion than TACE+NS g roup (P <0.05).Conclusion:Basil capsule can obv iously improve hypoxia
environmental o f ra t hepatoma after TACE and dow n regulation the expression o f VEGF , HIF-1α, and SICAM-1 in blo od ser-
um.Basil capsule ha s dose dependent inhibito ry action on invasion and metastasis of rat hepatoma after TACE.
[ Key words] Basil capsule;Rat with transplanted live r cancer;TACE;H ypox ia-inducible facto r-1α;I nvasion and metastasis
　　原发性肝癌经导管肝动脉化疗栓塞(TACE)作
为非手术治疗的主要手段之一应用广泛 ,但有临床
资料显示 TACE术后肿瘤侵袭转移增加 ,且以年轻
者多见[ 1] 。在长期临床工作中还发现 , TACE 术后
许多患者出现舌质紫暗 、舌下静脉曲张等不同程度
的血瘀征象[ 2] ,通过多年对于肿瘤侵袭转移的深入
研究 ,我们认为这与肿瘤乏氧微环境有密切关系。
肿瘤乏氧微环境在肿瘤的演化进展过程中起着非常
重要的作用 ,常导致肿瘤局部复发 、远处转移和预后
不良。本研究利用Walker-256瘤株进行雌性Wist-
100
中国中西医结合影像学杂志 2010年 4月第 8卷第 2期
a r大鼠移植性肝癌的造模 ,并模拟 TACE术 ,分析
术后局部微环境下乏氧诱导因子 1α(HIF-1α)、血管
内皮生长因子(vascular endothelial g row th factor ,
VEGF)及血清可溶性细胞间黏附分子 1(sICAM-1)
表达的改变及本课题组研制的中药有效成分罗勒多
糖(basil po ly saccharide , BP)[ 3 , 4] 不同剂量对其表达
的影响 ,探讨罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌 TACE 术
后乏氧微环境及侵袭转移干预作用的机制 ,为罗勒
胶囊辅助肝癌 TACE治疗提供科学依据 。
本课题组一直从事活血化瘀药物抗肿瘤的研
究 ,中药罗勒系课题组经长达数年的研究从经典的
活血化瘀药中发现的抗肿瘤转移中药 5 类新药 ,现
正在进行临床实验 ,罗勒胶囊有效成分为罗勒多糖 ,
我们对该药的抗肿瘤临床与基础进行了系统的研究
(山东省中医局项目编号:99-46 ,山东省科技厅项目
编 号:03104010 , 山 东 省 卫 生 厅 项 目 编 号
2001CAICDAI),证实了其具有较强的抗血小板及
活血化瘀作用 ,对几种移植瘤转移模型(H22 肝癌
小鼠模型 、Lew is肺癌小鼠模型 、B16-BL6黑色素瘤
小鼠模型及 NuTu-19卵巢癌大鼠模型等)具有抗转
移作用。
1　资料与方法
1.1　材料
1.1.1　动物和细胞株:Wistar 大鼠 , 雌性 , (200±
30)g(山东中医药大学试验动物中心);Walker-256
瘤株(上海医药工业研究院)。
1.1.2　实验药品和主要试剂:罗勒胶囊(北京四环
科宝制药有限公司),批号:20080526(罗勒胶囊为中
药 5类新药 ,已获国家食品药品监督管理局注册批
件 ,正在进行三期临床实验);HIF-1α抗体及 VEGF
抗体(浓缩型)(北京博奥森生物技术有限公司);
ZLI-9032浓缩型 DAB试剂盒 , SP9001免疫组化染
色试剂盒(美国 Zymed公司);大鼠(Rat)可溶性细
胞间黏附分子 1(sICAM-1)ELISA 检测试剂盒(上
海朗顿生物技术有限公司)。
1.2　动物肿瘤模型制作及分组　从液氮中取出癌
株 ,接种于 3只传代用(Wistar)大鼠腹腔 。14 d 后
取腹水离心 ,将瘤细胞接种于其他传代Wistar 大鼠
右后肢内侧皮下 ,1周后皮下长出肿瘤结节 ,无菌条
件下取出实体瘤 ,用双面刀片或眼科剪取肿瘤边缘
生长活跃的鱼肉样组织 ,切成 1 mm3大小的碎块备
用。200 g 左右Wistar 雌性大鼠 80只 ,开腹后暴露
大鼠腹腔 ,选取最近体表的肝叶(体积最大),将取出
的瘤块植入[ 5 , 6] 。术后取侧卧位 ,放置于安静 、光线
柔和的饲养间内 ,保持室温 25 ℃～ 30 ℃,结果造模
成功 60只。随机分为 5 组:非 TACE对照组 、TA-
CE+NS 组 、TACE+罗勒胶囊小剂量组 、TACE+
罗勒胶囊中剂量组 、TACE +罗勒胶囊大剂量组。
将罗勒胶囊水溶后对大鼠进行灌胃给药 ,根据大鼠
与人的体表面积比例制定大鼠给药剂量为大剂量:
30 mg/100 g ;中 剂量:15 mg/100 g ;小剂 量:
7.5 mg/100 g ,每天一次。
1.3　TACE 治疗方法　瘤块种植后第 10 天肿瘤
模型成功建立后对非 TACE组以外 4组大鼠做肝
动脉栓塞。于手术显微镜下经胃十二指肠动脉将自
制的微导管(小儿静脉留置针改造)插至肝固有动脉
内[ 7] 。经导管分别注入 5-Fu 20 mg/kg ,加超液态
碘油 0.5 ml/kg ,术后拔管 ,结扎胃十二指肠动脉近
端 ,逐层缝合 ,消毒 ,分笼饲养。
1.4　血样及标本收集　于术后第 10 天处死动物 ,
大鼠腹主动脉取血 4 ml ,血样收集在试管中 ,在室
温静置 30 min ,低温离心(3 000 r/min ,10 min),分
离血清保存在-70℃冰箱 。动物肝脏标本经 10%
甲醛固定 ,石蜡包埋 ,5 μm 连续切片 。
1.5　免疫组化染色及结果判定 　HIF-1α、VEGF
免疫组化染色 。一抗分别为兔抗大鼠 HIF-1α(工作
浓度 1∶200)、兔抗大鼠 V EGF(工作浓度 1∶200)
用已知阳性切片同时在同一条件下染色作为阳性对
照 ,用 PBS(pH = 7.4)代替一抗作为阴性对照 ,染
色步骤严格按照试剂说明书进行 。结果判定:每组
30个视野计数表达 HIF-1α及 VEGF 的瘤细胞数 ,
计算阳性细胞表达百分率。
1.6　ELISA检测血清 sICAM-1　运用酶联免疫吸
附试验法检测血清 sICAM-1的表达 ,操作过程按照
说明书进行 ,以吸光度 OD值为纵坐标(Y),相应的
sICAM-1标准品浓度为横坐标(X),采用 ELISA
Calc V0.5软件绘制标准曲线 ,并根据样品OD值读
取样品 sICAM-1浓度。
1.7　统计学处理　用 SPSS13.0 统计学软件进行
显著性检验 , 组间比较采用方差分析(One Way
ANOVA),以均数±标准差(x ±s)表示 ,显著性水
准设为 P <0.05。
2　结果
2.1　罗勒胶囊对各实验组大鼠移植性肝癌瘤重的
101
中国中西医结合影像学杂志 2010年 4月第 8卷第 2期
影响(见表 1)。实验结果显示:TACE+NS 组大鼠
瘤重较非 TACE对照组显著降低 ,差异有统计学意
义(P <0.05),与 TACE+生理盐水组比较罗勒胶
囊大剂量组瘤重明显降低(P <0.05)。中 、小剂量
作用不明显 ,不同剂量组之间大鼠瘤重无明显差异
(P >0.05)。
表 1　罗勒胶囊对各实验组大鼠移植性肝癌瘤重的影响
组别 样本数 瘤重(m/ g)
非 TACE 对照组 10 3.241±0.861
TACE+NS 组 10 2.343±0.819■
TACE+罗勒大剂量组 10 2.191±0.599＊◎
TACE+罗勒中剂量组 10 2.671±0.995◎
TACE+罗勒小剂量组 10 2.626±0.827◎
　　注:与非 TACE 对照组比较 , ■P <0.05 , ◎ P <0.01;
与 TACE+NS 组比较 , ＊◎ P <0.05 , ◎ P >0.05
2.2　罗勒胶囊对模型大鼠术后血清 sICAM-1表达
的影响　TACE +NS 组血清 sICAM-1较非 TA-
CE 组明显增高(P <0.05);TACE+罗勒三个剂量
组与 TACE +NS 组比较血清 sICAM-1均明显降
低(P <0.01 , F =18.474);罗勒三个剂量组间亦
有明显差异(P <0.05);说明罗勒胶囊对大鼠术后
血清 sICAM-1 表达影响具有一定剂量依赖性 , 非
TACE 组与 TACE +罗勒中剂量组比较则没有显
著性差异(P >0.05 ,见表 2)。
表 2　罗勒胶囊干预大鼠移植性肝癌 TACE术后血清
可溶性细胞间黏附分子 1(sICAM-1)的变化
组别 样本数 sICAM-1(ng/ ml)
非 TACE 对照组 10 27.21±1.58
TACE+NS 组 10 31.58±1.98 ☆
TACE+罗勒大剂量组 10 25.52±1.07 ＊★
TACE+罗勒中剂量组 10 27.86±1.98★◎△
TACE+罗勒小剂量组 10 29.64±1.92 ＊★◎
　　注:与非 TACE 组比较 , ☆ P <0.05 , ＊P <0.01;与
TACE +NS 组比较 , ★ P <0.01;与 TACE+罗勒大剂量
组比较 , ◎ P <0.05;与 TACE+罗勒小剂量组比较 , △P <
0.01
2.3　罗勒胶囊对模型大鼠术后肿瘤组织中 HIF-
1α、VEGF 表达的影响
2.3.1　与非 TACE 对照组比较 , TACE+NS 组肿
瘤及周边组织中 HIF-1α表达显著增高 ,而 TACE
+罗勒大剂量组则有显著降低;与 TACE+NS 组
比较 ,罗勒三个剂量组均有显著降低 ,罗勒大剂量组
作用优于中 、小剂量组;罗勒中 、小剂量组作用相似
(＊△P >0.05),且与非 TACE对照组无显著性差
异(P >0.05 ,见表 3)。
表 3　各实验组肿瘤组织 HIF-1α免疫组化表达结果(x±s)
组别 样本数 视野数 HIF-1α阳性表达率(%)
非 TACE 对照组 10 30 32.36±1.86
T ACE+NS 组 10 30 59.41±3.18 ◎
T ACE+罗勒大剂量组 10 30 41.23±2.44 ＊■
T ACE+罗勒中剂量组 10 30 47.72±3.08 △☆
T ACE+罗勒小剂量组 10 30 49.21±3.72 △☆
　　注:与非 TACE 对照组比较 , ◎ P <0.01 , ＊P <0.01 ,
△ P <0.01;与 TACE+NS 组比较 , ■P <0.01 , △ P <
0.01;与 TACE+罗勒大剂量组比较 , ☆P <0.01;TACE+
罗勒中剂量与 TACE+罗勒小剂量组比较没有显著性差异 ,
△☆ P >0.05
HIF-1α在肿瘤组织中普遍表达 ,主要位于肿瘤
细胞核中 ,胞质中也有表达 ,而在正常肝组织中表达
相对较低。在肿瘤组织中 HIF-1α的表达不均匀 ,
中心坏死组织不表达 ,瘤旁组织的表达均强于肿瘤
中心组织 ,肿瘤坏死组织周围及有纤维结缔组织包
绕的瘤细胞条索中 HIF-1α表达最强 。TACE+NS
组阳性表达细胞深染 ,明显强于非 TACE 组 , TA-
CE+罗勒大 、中 、小三个剂量组表达较弱 ,明显低于
TACE+NS组(图 1 ,见封 2)。
2.3.2　与非 TACE对照组比较 , TACE +NS 组肿
瘤及周边组织中 VEGF 表达显著增高 ,而 TACE+
罗勒不同剂量的三个组则有显著降低;与 TACE+
NS 组比较 ,罗勒三个剂量组均有显著降低 ,并且三
个剂量组间 VEGF 的表达差异显著 ,提示具有一定
的剂量依赖性。 HIF-1α与 VEGF 表达成正相关
(P <0.01 , r =0.601 ,见表 4)。
表 4　各实验组肿瘤组织 VEGF 免疫组化表达结果(x±s)
组别 样本数 视野数 VEGF 阳性表达率(%)
非 TACE 对照组 10 30 40.44±4.23 ◎△
T ACE+NS 组 10 30 65.32±3.32 ＊△
T ACE+罗勒大剂量组 10 30 31.62±2.11 ◎＊
T ACE+罗勒中剂量组 10 30 38.57±4.16 ＊△◎
T ACE+罗勒小剂量组 10 30 34.28±5.24 ＊△◎
　　注:与非 TACE 对照组比较 , ＊ P <0.01;与 TACE+
NS 组比较 , ◎ P <0.01;与 TACE +罗勒大剂量组比较 ,
△ P <0.01
光镜观察发现 VEGF 阳性染色主要集中在肿
102
中国中西医结合影像学杂志 2010年 4月第 8卷第 2期
瘤细胞膜和细胞质中 。在瘤周 、瘤内坏死区周围及
栓塞后残存癌组织中可见呈弥漫性或灶状分布的
VEGF 强阳性染色细胞 ,与新生血管的分布有较好
的一致性;而在瘤周正常肝细胞染色较弱。与非
TACE 对照组及 TACE +NS 组比较 ,罗勒胶囊各
剂量组在瘤周 、瘤内坏死区周围及栓塞后残存癌组
织中特别是新生血管周围的 VEGF 阳性表达的细
胞数明显减少 ,其中罗勒胶囊大剂量组 VEGF 阳性
表达的细胞数最少(图 2 ,见封 2)。
3　讨论
正常肝脏由肝动脉及门静脉双重供血 ,而肝癌
组织则以肝动脉供血为主(85%),这是进行栓塞治
疗的基础[ 8] 。由于肿瘤存在侧支循环及门静脉血
供 ,因此 ,肝动脉化疗栓塞存在一定局限性。从病理
切片上可以发现 ,肝动脉化疗栓塞后 ,肿瘤并没有完
全坏死[ 9] ,癌中心及癌周仍有大量存活的癌细胞 ,这
些癌细胞生存在不同程度的乏氧环境中 ,肿瘤内存
在的乏氧微环境 ,使得 HIF-1α在肿瘤组织中表达
增高。肿瘤细胞通过 HIF-1α的表达可诱导
VEGF 、EPO 、iNOs 、sICAM-1 等的表达 ,增加供血 、
供氧 、细胞黏附以增强它们在缺氧环境中的生长和
转移能力[ 10 , 11] 。已有研究表明 , HIF-1α与恶性肿
瘤新生血管的形成关系极为密切 ,促进肿瘤生长的
关键在于通过上调 VEGF 的表达使肿瘤微血管密
度增加[ 12] 。VEGF 是新生血管的关键调控因子 ,其
表达受许多外部因子调控 ,其中 HIF-1α能够诱导
VEGF 的转录活性增强和表达增加 ,在肿瘤细胞的
能量代谢 、新血管生成 、促进肿瘤增殖和转移中起重
要作用[ 13 , 14] 。
罗勒多糖系从中国传统化瘀名方中的一味具有
抗血小板作用的全草植物中经分离 、提取及初步精
制得到的药物有效成分 。初步的实验结果已表明 ,
罗勒多糖在体内能够明显抑制肿瘤细胞的转
移[ 3 , 4] 。在本实验中 ,我们建立了大鼠移植性肝癌
模型 ,并对模型大鼠进行了模拟 TACE 治疗 ,从肿
瘤乏氧的角度观察了罗勒多糖对术后乏氧微环境中
与肿瘤侵袭转移相关的 HIF-1α、V EGF 及血清 sI-
CAM-1 表达的影响。结果显示 , 术后 HIF-1α、
VEGF 及血清 sICAM-1表达有不同程度增高 ,提示
TACE 有可能增加了肿瘤局部微环境的乏氧 ,而罗
勒多糖则显著降低肿瘤局部尤其是瘤体周围组织中
的乏氧诱导因子 1α的表达 ,说明罗勒多糖对于术后
的肿瘤乏氧微环境具有改善作用;在瘤周 、瘤内坏死
区周围及栓塞后残存癌组织中特别是新生血管周围
的 VEGF 的表达显著降低 ,并且与 HIF-1α的表达
具有明显相关性(P <0.01 , r =0.428),表明罗勒
胶囊可能通过改善术后肿瘤乏氧而抑制肿瘤血管新
生间接起到抑制侵袭转移的作用。 sICAM-1 的表
达降低 ,与 HIF-1α的表达亦呈明显正相关(P <
0.01 , r =0.601),说明罗勒胶囊可能通过改善乏氧
抑制肿瘤细胞运动和黏附能力而干预肿瘤侵袭转
移 ,其具体机制还需要进一步研究。综上所述 ,罗勒
多糖通过改善肿瘤乏氧 、抑制血管新生 、降低肿瘤细
胞黏附力等多个环节抑制肿瘤的发生发展 。
[参考文献]
[ 1] 王英凯 ,迟宝荣.原发性肝癌 T ACE术后与肺转移[ J].中国肿
瘤临床与康复 , 2007 , 14(2):181-182.
[ 2] 鞠立霞 ,陈喆.TACE术前后血瘀程度变化观察[ J].上海中医
药大学学报 , 2006 , 20(1):25-26.
[ 3] Qu X , Zhen g GJ , Yang M X , et al.Experimen t s tu dies of anti tu-
m or p roli feration and metastasis of a new Chinese herb A T-1
[ J].Chin J Cancer Res ,2003 , 15(3):223-226.
[ 4] Qu X , Zh eng GJ , Liu FL , et al.E xperim ental research on anti tu-
m or metas tasi s ef fect of basi l polys accharide in vivo[ J].CJ IM ,
2004, 10(2):138-140.
[ 5] 王锦波 ,吕毅 ,潘承恩 ,等.Walker-2256肝癌模型的制作及传代
保存[ J].肝胆外科杂志 , 1995 , 4(2)∶56.
[ 6] 瞿雪梅 ,顾伟 , 胡佳娜 ,等.大鼠移植性肝癌模型血管介入的护
理[ J].实验动物科学与管理 , 2005 , 22(2):56-57.
[ 7] Shimizu M , S aitoh Y , Itoh H.Immun ohistochemical staining of
Harasoncogene p rodu ct in n orm al , benign , and m alignan t hu
man pancreaticti ssues[ J].H um Path ol , 1990 , 21(6):607-612.
[ 8] 董永华 ,林贵.大鼠肝癌肝动脉碘油栓塞后的门脉血供[ J].中
华放射学杂志 , 1994 , 28(9):582-584.
[ 9] 陈荣新 ,叶胜龙 , 樊嘉 ,等.肝动脉化疗栓塞对原发性肝癌伴门
静脉癌栓的治疗作用[ J].中华肿瘤防治杂志 , 2006 , 13(7):530-
531.
[ 10] 乔连铭 ,冯敢生 ,李欣 ,等.化疗栓塞对大鼠 Walker-256 肝肿
瘤移植模型微血管密度 、VEGF 和 bFGF 表达的影响[ J].吉林
大学学报(医学版), 2004 , 30(1):321.
[ 11] 李庆 ,李代强.缺氧诱导因子-1与肿瘤的生长和转移[ J].实用
预防医学 , 2006 , 13(3):801-803.
[ 12] 佟晓光 ,张敬东.卵巢浆液性囊腺癌组织缺氧诱导因子 1α的
表达及其与临床病理学相关性的研究[ J].中华肿瘤防治杂志 ,
2008 , 15(2):138-141;144.
[ 13] 仲萍萍.微环境对肿瘤细胞恶性生物学行为的影响[ J].广东
医学, 2006 , 27(1):137-139.
[ 14] 李玉梅 ,陈永强.缺氧诱导因子-1与肿瘤细胞凋亡及血管生成
关系的研究进展[ J] .中华肿瘤防治杂志 , 2008 , 15(12):948-
950;954.
(回修日期　2009-09-08)
103
中国中西医结合影像学杂志 2010年 4月第 8卷第 2期