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2008年第 6期
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实验技术
荔枝草总黄酮提取方法研究
邓志昌 ,李金贵
(扬州大学兽医学院 ,江苏扬州　225009)
　　中图分类号:S853.74　　　　 　文献标识码:A　　文章编号:1000-6354(2008)06-0024-03
　　荔枝草为唇形科雪见草(SalviaplebeiaR.Br)的全草 ,
性味苦 、辛 、凉。荔枝草别名荠宁 、雪见草 、雪里青 、癞子草 、
癞团草 、癞疙宝草 、蛤蟆草 、猪婆草 , 为二年生直立草本植
物 , 有清热解毒 、利尿消肿 、凉血止血之效 [ 1] 。荔枝草在临
床上主要用于镇咳 、抗菌 、抗病毒等 , 对瘙痒性皮肤病 [ 2] 、溃
疡性结肠炎 [ 3] 、带状疱疹 [ 4] 、急性乳腺炎 [ 5] 、痔疮 [ 6] 、肛周
炎 [ 7] 、痔瘘 [ 8] 、特发性血小板减少性紫瘢 [ 9]等亦有较好的疗
效。
1　材料与方法
1.1　材料
荔枝草 ,购自国药控股江苏有限公司中药饮片公司 , 原
产地广州。经扬州大学中兽医教研室鉴定为荔枝草。芦丁
对照品 ,氯化铝 , 95%乙醇 , 亚硝酸钠均为国产分析纯。 仪
器:756型紫外分光光度计(上海分析仪器总厂), 超声波仪
(上海生析超声仪器有限公司)。
1.2 　方法
1.2.1　荔枝草黄酮测定方法考察 [ 10]
1.2.1.1　标准溶液的配制　精确称取 105 ℃干燥至恒定质
量的芦丁标准品 10 mg, 置于 100 mL容量瓶中 , 加 70%乙醇
适量 ,微热溶解 , 冷却后加入 70%乙醇稀释至刻度 , 摇匀 , 得
质量浓度为 0.1g/L的芦丁对照品溶液 , 备用。
1.2.1.2　标准曲线的绘制　分别精密吸取芦丁乙醇溶
液(0.1 mg/mL)0、0.5、1、 2、 3、 4、 5 mL于 25 mL容量瓶中 ,
加 5%亚硝酸钠溶液 1 mL, 摇匀 , 静置 6 min, 再加 10%硝酸
铝溶液 1 mL,摇匀 , 静置 6 min;再加 4%氢氧化钠溶液 10mL,
用 70%乙醇稀释至刻度 ,摇匀 , 静置 15 min,于 510 nm处测定
吸收值(以不含芦丁的空白管对照调零做空白对照)。
1.2.1.3　精密度　取对照品溶液 , 按 1.2.1.2项方法于
510 nm处连续测定吸光度 5次 , 记录结果 。
1.2.1.4　显色稳定性　取 1 mL按 1.2.3.1项方法所提得
水回流提取液 ,按 1.2.1.2项方法分别于 0、10、20、40、 60min
测定吸光度 ,记录结果。
1.2.1.5　重复性　精确称取药材 1g, 共 5份 , 按 1.2.3.1项
方法平行试验 , 按 1.2.1.2项方法分别于 510 nm处测定吸
收值 ,记录结果。
收稿日期:2008-06-07
基金项目:新疆生物资源基因工程重点实验室开放课题(XJDX0201
-2005-01)
作者简介:邓志昌(1983-),在读硕士研究生 , 主要从事兽药及动物
疫疾防治研究。通讯作者:李金贵 ,博士 ,副教授。
1.2.1.6　回收率试验　精确称取 105 ℃干燥至恒定质量的
芦丁对照品 100 mg, 置于 100 mL容量瓶中 , 以 70%乙醇溶
解 ,稀释至刻度 , 摇匀 ,得芦丁贮备液。取 1.2.3.1项所得提
取液 5份 ,每份 5 mL, 添加芦丁对照品 10 mg, 按 1.2.1.3项
方法测定 ,回收率试验用于评价所用测定方法的准确度。
1.2.2　提取物含量的测定　精密吸取样品液 1 mL,置于 25mL
容量瓶 ,每组 3份平行样品 , 按标准曲线的制备方法测定吸
光度 ,根据回归方程求得荔枝草中总黄酮的含量。
1.2.3　荔枝草总黄酮提取方法的考察
1.2.3.1　水回流提取法　将荔枝草粉碎 , 过 20目筛 , 取荔
枝草粉末 3份 , 每份 30 g, 加 10倍量蒸馏水 , 水回流提取 2
次 ,每次 1 h, 合并提取液 ,过滤 ,按 1.2.1.2标准曲线绘制方
法测定提取液的总黄酮含量。
1.2.3.2　乙醇 、甲醇回流提取法　将提取介质分别易为 10
倍量 70%乙醇和甲醇 ,其他处理同 1.2.3.1。
1.2.3.3　水超声提取法　将荔枝草粉末过 20目筛 , 取 30
g,加 10倍量蒸馏水 , 3个平行样品 ,超声提取 2次 , 每次 1 h,
合并提取液 ,过滤 , 测定提取液的总黄酮含量。
1.2.3.4　乙醇 、甲醇超声提取法　将提取介质分别换为 10
倍量 70%乙醇和甲醇 ,其他处理同 1.2.3.3。
1.2.4　荔枝草总黄酮水提取法正交试验设计 [ 11] 　荔枝草
提取工艺的主要影响因素为:加水量 、提取时间和提取次
数 , 故采用 L9(33)正交试验设计方案 , 以不同工艺所得
提取液中总黄酮含量为指标来考察水提取的最佳工艺 。
将荔枝草粉碎 , 过 20目筛 , 取荔枝草粉末 , 每份 10 g, 将
药材粉末置于 500 mL圆底烧瓶中 , 按照下表设计内容进
行操作。
表 1　荔枝草总黄酮水提取法的正交试验设计
水平 因　素A水的用量 /倍 B提取时间 /h C提取次数 /次
1 10 1 1
2 20 2 2
3 30 3 3
2　结果
2.1　芦丁标准曲线的建立
根据所测得芦丁吸光度 ,绘制得到芦丁的标准曲线 , 由此
得出芦丁浓度与吸光度的关系式为 y=0.495 7x+0.007 2, R2
=0.999 5,芦丁在 0-0.5mg范围内线性关系良好。
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实验技术
表 2　显色稳定性 、精密度及重复性试验结果
序号 1 2 3 4 5 RSD/%
稳定性 0.446 0.444 0.442 0.429 0.418 2.746
精密度 0.496 0.496 0.494 0.495 0.494 0.202
重复性 0.246 0.243 0.244 0.244 0.244 0.501
由表 2可以看出 , 在稳定性方面 , 测试溶液随着时间的
延长而呈现吸光度下降的趋势 ,导致吸光度不能反映荔枝草
黄酮真实浓度 ,由于是每隔 10min测一次 ,根据所测结果 , 应
用该方法测试样品时需要控制在 20 min内。精密度和重复
性 RSD分别为 0.202和 0.501,说明该方法有较高的精密度
和较好的重复性。
由表 3可知样品平均回收率为 99.53%, RSD为 0.961,
说明该测试方法的样品回收率较好 , 符合测试要求。由表 4
可以看出 ,不管回流法还是超声法提取 , 用醇类溶剂提取荔
枝草黄酮的效率要优于水 , 其中乙醇提取效果最好 , 其次是
甲醇和水 ,而超声法提取优于回流提取法。考虑到水的成本
低 ,且无污染 , 水回流提取在工厂化生产中较易实现 , 因此确
定采用水回流法进行下一步正交试验 , 以得到高效率的提取
方法组合。
2.2　水提取正交试验设计结果
从表 5直观分析可知 , 各因素水平的顺序是:A2 >A3 >
A
1
, B
3
>B
2
>B
1
, C
3
>C
2
>C
1
。 即生药与水的比例为 1∶20
时 ,总黄酮的提取效率高于 1∶30和 1∶10;回流提取的时间为
3 h>2h>1h, 提取次数则是 3次 >2次 >1次。方差分析表
明 ,水的用量(A)、提取时间(B)以及提取次数(C)3个因素
的主次顺序为:C>A>B, 即提取次数对提取率影响最大 , 其
次是水的用量和提取时间(见表 6)。故荔枝草的最佳提取
工艺为 A2B3C3 ,即 20倍水 ,回流提取 3次 , 每次 3 h。
表 3　回收率试验结果
样品号 样品含量
加样量
/mg
测得
量
回收率
/%
平均回
收率 /%
RSD
/%
1 4.863 10 14.805 99.60
2 4.863 10 14.701 98.90
3 4.863 10 14.933 100.47 99.53 0.961
4 4.863 10 14.655 98.60
5 4.863 10 14.878 100.10
表 4　荔枝草黄酮提取方法对比
提取方法 提取率 /%
水回流 1.197
乙醇回流 2.353
甲醇回流 1.631
水超声 1.298
乙醇超声 3.070
甲醇超声 1.703
表 5　荔枝草总黄酮水提取法正交试验设计测定结果
试验号 A B C 总黄酮含量 /%
1 1 1 1 0.625
2 1 2 2 1.167
3 1 3 3 1.822
4 2 1 2 1.860
5 2 2 3 1.788
6 2 3 1 1.480
7 3 1 3 1.550
8 3 2 1 1.397
9 3 3 2 2.076
T
1 3.614 4.035 3.502 13.765T
2 5.128 4.352 5.103T3 5.023 5.378 5.160X1 1.205 1.345 1.167X2 1.709 1.451 1.701X3 1.674 1.793 1.720
R 0.469 0.448 0.553
　　注:T值表示各因素同一水平之和;X值表示各因素同一水平的
平均值;R值表示极差 ,决定各因素的主次顺序。
表 6　正交试验设计方差分析结果
方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F值
A 0.477 2 0.238 3.540
B 0.329 2 0.164 2.441
C 0.591 2 0.295 4.388
3　讨论
本试验用紫外分光法对荔枝草总黄酮进行了测定 ,以芦
丁做标准曲线 , 测定荔枝草中黄酮的含量。通过对精密度 、
稳定性 、重复性及回收率的考察 , 可知该方法可行 , 但显色稳
定性较差 ,需在 20min内测定。
回流法和超声法是提取黄酮最常用的两种方法 , 在本试
验中 ,水回流 、乙醇回流 、甲醇回流的提取率分别为 1.197%、
2.353%、1.631%, 水超声 、乙醇超声 、甲醇超声提取率分别
为 1.298%、3.07%、1.703%。超声提取法总体上优于回流
法 ,这与有关报道一致。
参考文献:
[ 1] 江苏新医学院.中药大辞典 [ M] .上海科学技术出版社 ,
1986, 1614.
[ 2] 王　学 ,魏　峰.单味蛤蟆草治疗瘙痒性皮肤病 [ J] .中
国乡村医生杂志 , 2001(1):36.
[ 3] 陈英明.复方白雪丸治疗溃疡性结肠炎 37例 [ J] .江西
中医药 , 1996(2):68.
[ 4] 王昌荣 ,宫兆妮 , 毕金花 ,等.蛤蟆草治疗带状疱疹 38例
[ J] .中国民间疗法 , 2004, 9(4):25.
[ 5] 王翠英.瓜蒌公英汤治疗急性乳腺炎 89例 [ J] .吉林中
医药 , 1996(3):18.
[ 6] 王　萌.荔矾治疗炎性外痔 289例疗效观察 [ J] .山东医
药 , 2005, 5(35):32.
[ 7] 崔华宇 ,宋慧英.消痔坐浴剂治疗肛周炎症 256例 [ J] .
中医外治杂志 , 2000, 9(3):26.
[ 8] 张崇敏 ,张崇芬.354例痔瘘术后疼痛的防治与护理体会
[ J] .甘肃中医 , 2004(4):37-38.
[ 9] 孙登军 ,王慧芳.中药治疗特发性血小板减少性紫瘢 32
　　　　　　　 JTCVM
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实验技术
例 [ J] .医学理论与实践 , 2006(4):930-931.
[ 10] 金　泉 , 廉丽花 , 罗惠善 , 等.紫外分光光度计法测
定翻白草中总黄酮的含量 [ J] .延边大学医学学报 ,
2007 , 30(4):262-263.
[ 11] 宫维娜 ,于惠春,陈　伟 ,等.竹康宁中竹叶总黄酮的提取
及测定方法研究 [ J] .中国食品添加剂 , 2007(1):164-166.
白花蛇舌草多糖的提取工艺研究
李春玲1 ,高艳艳 1, 2 ,王贵平1 , 孙俊颖 1 ,何子双1 ,贾爱卿 1
(1.广东省农业科学院兽医研究所 , 广东广州　510640;2.华南农业大学)
　　中图分类号:S853.74　　　　 　文献标识码:A　　文章编号:1000-6354(2008)06-0026-02
　　白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇草(Hedyotisdif-
fusaWild.)干燥全草 , 具有清热解毒 、利尿消肿 、抗菌消炎等
功效。近年来 , 常被用于自身免疫性疾病和癌症的辅助治
疗 ,在兽医临床上主要用作机体的免疫增强剂 , 多糖类物质
是其发挥免疫增强作用的活性成分之一 , 笔者等采用热水浸
提乙醇沉淀法提取白花蛇舌草多糖 , 并通过正交试验优化其
提取工艺 ,以期为白花蛇舌草多糖在兽医领域的开发利用提
供依据。
1　材料与方法
1.1　试验材料
白花蛇舌草 ,产自广西。
1.2　仪器与试剂
RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),
SHZ-D(Ⅲ)型循环水多用真空泵(巩义予华仪器有限责任
公司), 快速冷冻离心机 , DZF-6020真空干燥箱(上海申亚
恒温设备厂), UV-2201型自动记录紫外分光光度计(日本
岛津)。所有试剂均为 AR级。
1.3　多糖的提取与纯化
白花蛇舌草经植物粉碎机磨成粉末 ,过 60目筛 , 用电子
天平精确称取粉末 50g, 加水 800mL浸泡 1.5h,煎煮 1.5 h,
过滤 ,滤渣加水 500mL,煎煮 1.0h,过滤 ,滤渣再加水 300mL,
煎煮 0.5 h后过滤 ,合并 3次滤液, 用旋转蒸发仪在 0.9 kPa和
65℃条件下浓缩至 80 mL, 置于分液漏斗中 , 加入乙酸乙酯
30mL脱脂 ,摇匀后静置 3h, 取水相 ,加入无水乙醇使其浓度
为 80%,摇匀 , 置冰箱静置 24 h, 后离心取沉淀 , 所得浸膏置
真空干燥箱中以 60 ℃恒温干燥至恒重 , 得粗多糖置冰箱备
用。精确称取上述粗多糖 2 g, 放入 100 mL容量瓶中 , 加少
量水使其溶解 ,定容至刻度。然后加入等体积 5%的三氯乙
酸 ,混匀后静置 4 h, 脱去蛋白质。 1 500 r/min离心 15 min,
取上清液 , 浓缩至 40 mL, 加无水乙醇 , 使乙醇的浓度达到
80%, 过夜醇沉。取沉淀 ,依次用乙醚 、无水乙醇 、丙酮各洗 2
次 ,得到精制的白花蛇舌草多糖 , 60 ℃烘干至恒重 , 精制后
的多糖呈灰白色。
收稿日期:2008-08-19
基金项目:广东省自然科学基金项目(06025375)
作者简介:李春玲(1965-),女 ,博士 ,主要从事中兽药免疫增强剂研
究 , E-mail:lclclare@ 163.com。通讯作者:王贵平 , E-
mail:guipwang@sohu.com
1.4　多糖的含量测定
1.4.1　6%苯酚溶液的配制　取苯酚(分析纯)100 g, 置于
圆底烧瓶中 ,加入铝片 0.1 g和 NaHCO3 0.05 g, 常压蒸馏 ,
收集 182 ℃馏分 , 称重 , 配成 80%的苯酚溶液 , 放入棕色瓶
中 4℃冰箱保存 , 临用时配成 6%苯酚溶液 ,最好现配现用。
1.4.2　标准溶液的配制　电子天平精密称取 105 ℃干燥至
恒重的无水葡萄糖 40 mg, 用蒸馏水溶解后置 200mL容量瓶
中 ,加双蒸水定容 , 摇匀 ,即得 0.2 mg/mL的标准液。
1.4.3　最大吸收波长的确定　取 2倍稀释的葡萄糖标准溶
液 1 mL, 加入 10 mL试管中 , 迅速加入 6%苯酚溶液 1.0 mL,
99.5%浓硫酸 5.0 mL, 静置 10 min, 摇匀 , 室温放置 20 min
后 ,以蒸馏水同法操作为空白 , 置比色杯中于 400-600 nm
波段处进行扫描 ,得到最大吸收波长为 488 nm。
1.4.4　标准曲线的制作　用移液管分别吸取 0.0、0.5、1.0、
2.0、3.0、4.0、5.0 mL葡萄糖标准溶液至 10 mL容量瓶中 , 加
双蒸水定容至刻度。摇匀后 , 用移液枪分别吸取 1.0 mL至
试管中 ,加 6%苯酚溶液 1.0 mL, 99.5%浓硫酸 5.0 mL, 静
置 10 min,摇匀 , 室温放置 20 min后于 490nm测吸光度。以
吸光度 A对葡萄糖浓度 C回归 , 得回归方程为:A=10.933
15C+0.011 121,其中 r=0.999 8, 葡萄糖浓度在 0-100 μg
范围内与吸光度线性关系良好(A为吸光度 , C为葡萄糖浓
度 ,单位 mg/mL)(见表 1)。
表 1　标准曲线葡萄糖浓度与吸光度
C(葡萄糖度) 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
A(吸光度) 0 0.127 0.225 0.438 0.679 0.883 1.104
1.4.5　换算因素的计算　精密称取 60 ℃干燥至恒重的精制
多糖 10 mg,加双蒸水定容于 100 mL容量瓶中 , 配成浓度为
0.1mg/mL的精制多糖溶液。用移液管吸取 1 mL精制多糖
溶液 5份 ,自 “加入 6%苯酚 1.0 mL起”按标准曲线的制备项
下操作, 488nm测定其吸光度 ,并以此计算换算因素(见表 2)。
表 2　精制多糖溶液的吸光度
试样号 1 2 3 4 5 X±SD RSD/%
吸光度 0.497 0.474 0.479 0.482 0.485 0.483 4±0.017 3.56
　　F=Cs/C(Cs为多糖液浓度 , C为多糖液中葡萄糖浓
度), 计算得 , f=2.315。